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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 생물전환에 의한 참깨 발효물을 건강기능식품 원료로써 개발 시 원료의 표준화를 위하여 lig-nan 화합물인 sesamol, sesamin 및 sesamolin의 분석방법 및 분석법 검증에 대한 연구를 실시하였다.
- 생물전환(bioconversion)이란 생물공정(bioprocessing), 생합성(biosynthesis) 등의 용어와 의미상 중복성을 가지며, 미생물 및 효소 등을 이용한 생물학적 방법을 통하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 뜻한다. 즉 기존 천연물에 함유된 물질의 구조적 변화를 유도하여 유효성분의 함량 증가 및 새로운 기능성분의 생성을 유도하는 기술이다. 기존의 발효공정은 상대적으로 간단한 원료물질에서 출발하는 반면, 생물전환은 효소의 기질에 대한 선택성을 이용하여 전구물질로부터 산물을 생산한다는 점에서 차이를 나타낸다.
제안 방법
- 정밀성에 대한 검증은 참깨 추출물을 inter-day(일간)와 intra-day(일내)로 나누어 진행하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 정량한 값은 표준편차를 평균으로 나누어 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
- 45 μm syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다. Lignan 화합물의 HPLC 분석은 식품첨가물의 기준 및 규격 천연첨가물 참깨 유불검화물(17)을 변형하여 실시하였다(Table 1). 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co.
- 참깨의 생물전환공정은 효소처리 및 멸균과정을 거쳐 배양배지화한 표고균사를 접종하여 생물전환 발효공정을 통해 1차 발효물을 생산하였다. 그 후 2차 생물전환 효소처리공정을 실시하였다. 발효미생물로 선정한 표고버섯 균사의 접종량과 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인한 후 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하고, 접종량을 각각 10%, 20%로 하여 본 발효배양에 접종하여 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다.
- 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 분석용 column으로는 Sunfire™ C18(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm, Waters Co.)을 이용하여 분석하였다.
- 농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다.
- 2). 또한, 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig. 1).
- 그 후 2차 생물전환 효소처리공정을 실시하였다. 발효미생물로 선정한 표고버섯 균사의 접종량과 배양시간을 최적화하기 위하여 종균배양의 growth curve fitting을 통해 각 발효미생물의 배양상태를 확인한 후 cell mass 농도에 따라 3 point를 선정하고, 접종량을 각각 10%, 20%로 하여 본 발효배양에 접종하여 배양시간 및 접종량을 비교하여 최적화를 진행하였다. 효소처리 최적화는 배양기질인 참깨와 발효배양산물인 배양균사체의 세포벽을 구성하고 있는 유용물질을 세포벽으로부터 효율적으로 추출하기 위하여 β-glucanase, cellulase, hemicellu-lase(DMS Food Specialties, Chilgok, Korea) pectinase, β-glucosidase, amylase, protease(Shin Nihon Chemical Co.
- 정확성 검증은 농도를 알고 있는 참깨 추출물에 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 15, 20, 25 μg/mL의 세 가지 농도로 첨가하여 분석하였다. 분석한 결과를 다음식을 이용하여 회수율(recovery)로 나타내어 HPLC 분석방법의 정확성을 확인하였다.
- 정밀성에 대한 검증은 참깨 추출물을 inter-day(일간)와 intra-day(일내)로 나누어 진행하였다. Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다.
- 정확성 검증은 농도를 알고 있는 참깨 추출물에 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 15, 20, 25 μg/mL의 세 가지 농도로 첨가하여 분석하였다.
- 정확성은 표준물질을 시료에 첨가한 후 분석하여, 표준물질을 가한 시료의 검출반응과 순수 표준물질의 검출반응을 비교하는 spiking과 recovery 방법으로 실험하여 참값을 정확히 회수할 수 있는지 회수율 계산을 통해 확인하였다(24). 농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다.
- 직선성에 대한 검증은 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 각각 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0, 250.0 μg/mL씩 단계적으로 희석한 다음 각각의 표준물질을 HPLC로 분석하여 3회 반복 측정하였으며, peak 면적비에 대한 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성된 검량선으로부터 상관계수(R2) 값을 이용하여 직선성을 확인하였다.
- 직선성은 시료 중 분석물질의 양에 대하여 직선적인 측정값을 나타내는 정도로 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 이용하여 각각 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125.0, 250.0 μg/mL의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 값으로 각 물질의 검량선을 작성하였다.
- 참깨에 함유된 lignan 화합물의 분석을 위하여 추출물을 0.45 μm syringe filter(Whatman, Maidstone, UK)를 이용하여 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
- 특이성 검증은 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin 및 참깨 추출물을 HPLC로 분석한 후 chromatogram을 비교하여 sesamol, sesamin, sesamolin이 선택적으로 분리가 되는지 확인하였으며 PDA spectrum을 이용하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
- 즉 다른 물질의 간섭 없이 분리되는 것으로 특이성을 확인할 수 있다(19). 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 spectrophotometer를 사용하여 200 nm에서 400 nm까지의 흡수파장을 분석하였다. 그 결과, sesamol은 296 nm, sesamin은 287 nm, sesamolin은 288 nm에서 각각의 최대흡수파장을 나타내었다(Fig.
- 효소처리 최적화는 배양기질인 참깨와 발효배양산물인 배양균사체의 세포벽을 구성하고 있는 유용물질을 세포벽으로부터 효율적으로 추출하기 위하여 β-glucanase, cellulase, hemicellu-lase(DMS Food Specialties, Chilgok, Korea) pectinase, β-glucosidase, amylase, protease(Shin Nihon Chemical Co., Ltd., Aichi, Japan) 등의 효소를 0.1~2%로 첨가하여 50~60°C 조건에서 1~3시간 동안 shaker(SI-4000R, Jeio Tech Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 250 rpm에서 효소/기질반응을 수행하였다.
대상 데이터
- 표준물질인 sesamol, sesamin, sesamolin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, Si-chuan, China)에서 구입하였으며, HPLC용 용매 methanol은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다.
- 본 연구에 사용한 참깨는 2014년 10월에 수확된 진율 품종으로, 국립식량과학원(Miryang, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 표준물질인 sesamol, sesamin, sesamolin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.
데이터처리
- *Significantly different between non-fermented and fermented sesame at P<0.05 by Student’s t-test.
- Inter-day는 1일 1구간으로 3일간 진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로 나누어 진행하였으며, 각 시험은 구간별로 3회, 9반복하여 분석하였다. 분석하여 얻어진 면적은 검량선을 이용하여 정량하였으며 정량한 값은 표준편차를 평균으로 나누어 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 백분율로 나타내었다.
이론/모형
- HPLC를 이용한 lignan 화합물의 분석방법은 의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(18)을 근거로 하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limits of detection, LOD), 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.
성능/효과
- 47%로 나타났다. Inter-day 정밀도에서는 참깨 비발효물 sesamin의 경우 0.27%, sesamolin 0.64%를 보였으며 참깨 발효물에서 sesamin 1.34%, sesamolin 1.94%로 나타나 inter-day, intra-day 모두 RSD 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. 참깨 비발효물의 sesamin 함량의 경우 intra-day에서 2.
- 정밀성이란 같은 시료에 대하여 연속적인 분석을 통해 얻은 결과 간의 유사함을 의미하는 것으로 참깨 추출물의 정밀성 분석 결과는 Table 2와 같다. Intra-day 정밀성 RSD값은 참깨 비발효물의 sesamin의 경우 0.25%, sesamolin은 0.43%로 나타났으며 참깨 발효물의 sesamin의 경우 RSD 값이 0.69%, sesamolin 0.47%로 나타났다. Inter-day 정밀도에서는 참깨 비발효물 sesamin의 경우 0.
- 검출한계 및 정량한계의 분석 결과, sesamol의 검출한계는 0.34 μg/g, 정량한계는 1.03 μg/g으로 나타났으며, ses-amin의 경우 검출한계 0.26 μg/g, 정량한계 0.78 μg/g으로 나타났다.
- 0 μg/mL의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 값으로 각 물질의 검량선을 작성하였다. 그 결과, sesamol(y=18309x－17636, R2=0.9999), sesamin(y=29746x－33563, R2=0.9999), sesamolin(y=17667x－25926, R2=0.9999)으로 나타났으며 모두 0.9999의 상관계수(R2)를 나타내어 우수한 직선성을 확인하였다.
- 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 spectrophotometer를 사용하여 200 nm에서 400 nm까지의 흡수파장을 분석하였다. 그 결과, sesamol은 296 nm, sesamin은 287 nm, sesamolin은 288 nm에서 각각의 최대흡수파장을 나타내었다(Fig. 1). 또한, chromatogram을 비교한 결과 lignan 화합물 3종의 혼합물과 참깨 추출물에서 각 peak의 머무름 시간(retention time)이 각각 4.
- 1). 또한, chromatogram을 비교한 결과 lignan 화합물 3종의 혼합물과 참깨 추출물에서 각 peak의 머무름 시간(retention time)이 각각 4.6, 9.5, 11.1분대로 다른 물질의간섭 없이 분리되었으며 표준용액의 머무름시간과 참깨 추출물의 머무름시간이 일치하는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 또한, 동일한 spectrum을 나타내어 본 시험법의 특이성을 확인하였다(Fig.
- 농도를 알고 있는 참깨 비발효물 및 발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을 각각 3가지의 농도(15, 20, 25 μg/mL)로 첨가한 후 HPLC로 분석하였다. 분석 결과(Table 3), sesamol의 회수율은 첨가된 농도에 따라 98.43~110.72%를 나타냈으며, sesamin은 106.45~115.10%의 회수율을 보였다. Sesamolin의 경우 99.
- 37 mg/g을 나타내었다. 참깨 발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서 각각 2.97mg/g, 2.75 mg/g을 보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23mg/g, inter-day 3.92 mg/g의 함량을 보여 생물전환을 통해 참깨의 sesamin, sesamolin의 함량이 증가하는 것으로 나타났다. Lim 등(20)은 sesamin과 sesamolin 급여 시 간 지방산 산화에 관여하는 다양한 효소의 활성 증가를 보고하였으며, Lee 등(21)은 RAW 264.
후속연구
- 또한, Jung 등(22)의 연구에서 생물전환을 통한 참깨 발효물에서 lignan 함량의 증가와 더불어 다양한 항산화 모델에서 효능을 증대시켰다. 따라서 본 연구의 생물전환을 통한 참깨 발효물의 sesamin 및 sesamolin의 증가로 인한 추가적인 생리활성이 기대된다. Sesamol의 경우 참깨 비발효물과 발효물에서 모두 검출되지 않았다.
- 70 μg/g으로 나타났다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 참깨의 sesamol, sesamin 및 sesamolin을 유용성분 및 지표성분으로 선정 시 분석법 검증을 통하여 이들 원료의 표준화가 가능할 것으로 생각된다.
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