개소시랑개비 추출물의 RAW264.7대식세포에서 in vitro 항염효과 In vitro anti-inflammatory activity of extracts from Potentilla supina in murine macrophage RAW 264.7 cells원문보기
본 연구에서는 개소시랑개비 (Potentilla supina)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride(LPS)로 염증을 유발해 nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 prostaglandin$E_2$($PGE_2$) 같은 염증 유발 인자들의 억제효과를 확인하였다. 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물의 염증 유발 인자 억제 시 $IC_{80}$ value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin $E_2$ 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 29.34와 $50.75{\mu}g/ml$이었고 Inducible nitric oxide synthase의 양도 $50{\mu}g/ml$ 처리하였을때 농도 의존적으로 발현 감소 하였다. 따라서 본 연구결과는 개소시랑개비의 ethyl acetate 분획물과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 개소시랑개비 (Potentilla supina)의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride(LPS)로 염증을 유발해 nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 prostaglandin$E_2$($PGE_2$) 같은 염증 유발 인자들의 억제효과를 확인하였다. 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물의 염증 유발 인자 억제 시 $IC_{80}$ value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin $E_2$ 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 29.34와 $50.75{\mu}g/ml$이었고 Inducible nitric oxide synthase의 양도 $50{\mu}g/ml$ 처리하였을때 농도 의존적으로 발현 감소 하였다. 따라서 본 연구결과는 개소시랑개비의 ethyl acetate 분획물과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Potentilla supina (Rosaceae) has traditionally been used to treat disorders of hemostasis, dysentery, malaria, bloody discharge and arthritis, and it has antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so ...
Potentilla supina (Rosaceae) has traditionally been used to treat disorders of hemostasis, dysentery, malaria, bloody discharge and arthritis, and it has antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of P. supina using the ethanolic extract of P. supina and its sub-fractions. To evaluate the anti-inflammatory effects of P. supina, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) in RAW 264.7 cells. Our results indicated that ethyl acetate fraction significantly inhibited LPS-induced NO, iNOS and $PGE_2$ production in RAW 264.7 cells. This result showed that ethyl acetate fraction of P. supina is expected to be a good candidate for development into a source of anti-inflammatory agents.
Potentilla supina (Rosaceae) has traditionally been used to treat disorders of hemostasis, dysentery, malaria, bloody discharge and arthritis, and it has antinociceptive and anti-inflammatory properties. However, validity of the anti-inflammatory activity has not been scientifically investigated so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the anti-inflammatory potential of P. supina using the ethanolic extract of P. supina and its sub-fractions. To evaluate the anti-inflammatory effects of P. supina, we examined the inflammatory mediators such as nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) in RAW 264.7 cells. Our results indicated that ethyl acetate fraction significantly inhibited LPS-induced NO, iNOS and $PGE_2$ production in RAW 264.7 cells. This result showed that ethyl acetate fraction of P. supina is expected to be a good candidate for development into a source of anti-inflammatory agents.
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문제 정의
생성을 효과적으로 저해하였다. 개소시랑개비 분획물들을 이용하여 murine macrophage cell인 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의해 유도된 염증성 대사산물인 Nitric oxide, Inducible nitric oxide synthase의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물이 NO, iNOS 와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 ethyl acetate 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다.
기존에 보고된 개소시랑개비에 관한 보고는 분류학적인 연구(Yoo et al. 1999)가 대표적인 연구결과로서 생리 활성에 관한 연구는 아직까지 미진한 편이며, 따라서 본 연구자들은 개소시랑개비 추출·분획물을 lipopolysaccharide(LPS)로 염증반응이 유도된 RAW 264.7대식세포에 처리하여, 항염증 활성(NO, PGE2) 효과를 평가 후 기능성 소재로서의 가능성을 제시하고자 본 연구를 수행하였다.
본 연구는 개소시랑개비의 추출·분획물을 이용하여 LPS 유도를 통한 대식세포주인 RAW 264.7 macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다.
본 연구에서는 개소시랑개비 (Potentilla supina )의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.
어린 줄기와 잎은 식용하며, 한국(충북, 경기, 강원, 평남, 함남, 함북)을 비롯한 북반구의 온대지방(중국, 일본 및 한국)에 분포한다. 본 연구에서는 식용이 가능하고 자생력이 강한 개소시랑개비가 5월 중에 논이나 밭에서 제초되는 것으로 확인되어, 이를 이용한 항염증 등의 기능성식품 소재 기초자료로서 활용 가능성을 제시하고자 실험하였다.
제안 방법
개소시랑개비에서 ethanol 추출 후 분획한 총 3개의 농축물을 MTTassay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 분획물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO 및 iNOS 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 선택하였다. 상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해 효과를 확인하였다.
Griess reagent [1% (w/v) sulfanilamide in 5 % (v/v) phosphoric acid 와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl]를 이용하여 RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양을 세포 배양액중에 존재하는 NO2-의 형태로서 측정하였다. Griess reagent를 100μl씩 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
LPS로 유도된 nitric acid (NO)의 생성량이 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물의 처리에 의하여 농도 의존적으로 감소함을 확인하였으므로, NO 생성에 관여한다고 알려진 iNOS의 단백질 발현을 western blot으로 확인하였다. Figure 2를 보면 LPS 처리 후 24 h에서 발현된 iNOS의 양이 LPS 처리군에서 유의성 있게 발현되었고, 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 발현 감소를 확인하였다.
MTT assay 수행 결과 세포독성을 나타내지 않는 농도에서 LPS에 의해 활성화된 RAW264.7 세포의 배양액 중에 생성된 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 측정하였다. Table 3과 Figure 1에서 볼 수 있듯이 LPS와 동시 처리하였을 때 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물이 IC50가 29.
의 생성 저해효과를 NS398{N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4-nitrophenyl] metha-nesulfonamide : COX-2 선택적 생성 억제제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다. ethyl acetate 분획물의 IC50가 50.
Nitric oxide screening 실험에서 억제효과를 나타내는 분획물들을 LPS에 의해 유도되는 또 다른 염증성 대사산물인 PGE2의 생성 저해효과를 NS398{N-[2-(Cyclohe-xyl-oxy)-4-nitrophenyl] metha-nesulfonamide : COX-2 선택적 생성 억제제}이라는 positive control로 사용하여 확인하였다. NO assay 실험에서 NO 생성 저해 효과가 뛰어난 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 이용하여 PGE2생성 저해 효과를 측정하였다.
PBS (Bioneer Co., Korea) 완충용액으로 세척한 후 각각의 well에 H2O2 (BBC Biochemical, USA) 100 μl 및 여러 농도의 시료 100 μl를 첨가하여 45분간 배양한 후 상등액을 제거하고 PBS 완충용액으로 2번 세척한 후 배지 200 μl를 주입하여 다시 24시간 배양하였다.
RAW 264.7 세포들을 PBS로 2회 세척하여 잔여 배지를 제거한 후, lysis buffer (PRO-PREPTM protein extraction solution), sodium fluoride (NaF), sodium orthovanadate, phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), 및 protease inhibitor cocktail (PIC)를 넣어 4°C에서 30분간 반응시키고 15,000 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 모았다.
RAW 264.7세포에 시료 용액의 여러 농도(10, 20, 40 μM)를 1시간 전 처리한 후 LPS를 처리하고 24시간 배양하였다.
7 macrophage 세포를 이용한 염증 모델을 사용하여 항염증 효과를 구명하고자 하였다. 개소시랑개비에서 ethanol 추출 후 분획한 총 3개의 농축물을 MTTassay를 실시하여 세포독성을 IC80으로 나타내고 독성이 없는 유효농도 범위를 설정하여 각각의 분획물의 유효농도 범위 내에서 저, 중, 고 상태로 3가지 농도를 설정하였다. Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO 및 iNOS 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 선택하였다.
건조중량 약2.1 kg의 세절한 개소시랑개비를 6개월간 ethanol(EtOH) 용매로 상온 냉침 하였다. 추출액을 수욕상에서 추출 후 회전식 진공농축기(Tokyo Rikakikai Co.
본 연구에서는 개소시랑개비 (Potentilla supina )의 전초를 이용하여 세포독성 및 항염증 활성 효과를 평가하였다. 대식세포인 RAW264.7 cell에서 염증 매개 물질인 lipopo-lysacchride(LPS)로 염증을 유발해 nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 prostaglandinE2 (PGE2) 같은 염증 유발 인자들의 억제효과를 확인하였다. 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물의 염증 유발 인자 억제 시 IC80 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 29.
배양액 속에 5 mg/ml MTT 시약 50 μl을 가하여 4시간 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO (Sigma Chemical Co., USA) 100 μl를 첨가한 후 540 nm에서 ELISA microplate reader (Bio-Tek Instruments Co., USA)로 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다.
Endotoxin인 lipopolysacch-aride (LPS)를 처리하여 염증 지표인 Nitric oxide (NO), Inducible nitric oxide synthase(iNOS)의 생성을 유도하고 각 분획물을 처리하여 NO 및 iNOS 생성 저해효과를 확인함으로써 가장 효과가 좋은 분획물인 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물을 선택하였다. 상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해 효과를 확인하였다. 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
1% Tween 20을 함유한 TBS 용액으로 7분씩 3번 세척한 후, 2차 항체와 1:2000의 비율로 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 전술한 TBS 용액으로 10분씩 3번 세척한 후에 enhanced chemiluminescence (GE healthcare, WI) 용액으로 반응시켜서 단백질 발현을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay 방법을 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
추출액을 수욕상에서 추출 후 회전식 진공농축기(Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용 감압 농축하여 에탄올 추출물 11.9 g을 얻었으며 이를 증류수 0.5 리터에 현탁 한 후 n-Hexane (1 L×3), chloroform(1 L×3), ethylacetate (1 L×3)로 용출하여 각각의 분획물을 진공농축 후 수득·평량 한 결과는 Table 1과 같다.
대상 데이터
RAW264.7세포를 10% FBS 및 penicillin (100 μg/ml), streptomycin(100 U/ml)이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco, Co., USA) 배지에서 37°C, 5% CO2 조건을 유지하여 배양하였다.
본 실험에서 사용한 개소시랑개비는 2013년5월 강원도 양구군 동면 일대에서 자생하는 전초를 채집하여 상지대학교 보건대학 제약공학과 박희준 교수에 의뢰하여 감정을 받고 건조한 후 세절하여 사용하였고, 표본은 고령지농업연구소 천연물 분리 실험실(표본 번호 NIHA-자 05)에 보관되어 있다.
데이터처리
실험치의 값은 3번의 독립된 실험을 시행하여 mean ±S.D.로 나타냈으며 분석은 Student’s t-test로 유의성을 나타내었다.
이론/모형
이후, 전술한 TBS 용액으로 10분씩 3번 세척한 후에 enhanced chemiluminescence (GE healthcare, WI) 용액으로 반응시켜서 단백질 발현을 확인하였다. 각 시료의 단백질 정량은 Bradford protein assay 방법을 사용하여 595nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
세포의 독성 정도를 확인하기 위하여 MTT (Sigma Chemical Co., USA) 시험법으로 측정하였다. 96 well plate (Falcon T.
성능/효과
ethyl acetate 분획물의 IC50가 50.75 μg/ml으로 LPS에 의해 유의성 있게 증가한 PGE2생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다(Table 4, Fig. 3).
개소시랑개비 ethyl acetate 분획물의 염증 유발 인자 억제 시 IC80 value를 측정하였을 때 nitric oxide 및 prostaglandin E2 생성을 농도의존적으로 현저하게 저해하는 농도는 각각 29.34와 50.75 μg/ml이었고 Inducible nitric oxide synthase의 양도 50 μg/ml 처리하였을때 농도 의존적으로 발현 감소하였다.
상기의 분획물을 이용하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해 효과를 확인하였다. 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물이 PGE2의 생성을 저해함으로써 유의성 있는 항염증 효과를 보이는 것으로 확인할 수 있었다.
개소시랑개비 추출물 및 분획물들의 항염증 효과를 규명하기에 앞서 RAW264.7세포에 독성을 통한 염증 매개물질의 저해효과 가능성을 배제하는, 즉 독성이 없는 최적 용량을 설정하기 위하여 MTT assay를 수행하였음 Viability가 80%가 넘는 농도가 최적 용량이라고 판단하였고 Table 2에서 볼 수 있듯이 개소시랑개비의 추출물 및 분획물들이 100 μg/ml의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
후속연구
7 cell에서 LPS에 의해 유도된 염증성 대사산물인 Nitric oxide, Inducible nitric oxide synthase의 생성과 Prostaglandin E2 생성의 저해 효과를 확인을 통해 추후 항염증 효과 확인 실험에 있어서 가장 유력한 후보물질을 선택하고자 하였다. MTT assay에 의해 설정된 농도에 따라 screening을 진행한 결과 개소시랑개비 ethyl acetate 분획물이 NO, iNOS 와 PGE2의 생성 저해 실험 시 지용성이 높은 ethyl acetate 분획물이 효과가 크므로, 약효성분에 대한 추후 연구를 진행하는 것이 필요하다고 사료된다. 대식세포는 NO, PGE, leukotriene 및 염증성 사이토카인들의 2차 매개물을 생산하고 분비한다.
75 μg/ml이었고 Inducible nitric oxide synthase의 양도 50 μg/ml 처리하였을때 농도 의존적으로 발현 감소하였다. 따라서 본 연구결과는 개소시랑개비의 ethyl acetate 분획물과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
따라서 본 연구결과는 개소시랑개비의 ethyl acetate 분획물과 같은 비극성용매 분획물들이 유의성 있는 항염증 효과를 나타내었으며, 이러한 효능은 예방의학적 가능성을 충분히 가지고 있기에 염증성질환의 예방을 위한 건강 기능성식품의 개발 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 염증과 관련된 사이토카인 및 단백질 발현 메커니즘에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
염증반응이란?
2011). 활성산소로 인하여 유발되는 염증반응은 외부로부터 물리·화학적 자극, 세균, 박테리아 또는 바이러스 같은 유해물질이 체내로 유입되는 경우, 체내 면역세포가 이를 감지하여 다양한 염증 매개 물질들을 분비함으로써 손상된 조직을 수복 및 재생하려는 신체보호 기전 중 하나이다. 그러나 이와 같은 염증반응이 멈추지 않고 지속적으로 일어날 때는 염증 매개 물질이 과도하게 분비되어 암세포의 성장을 촉진시키고, 인슐린 저항성을 증가시키며 동맥경화를 악화시키는 등 다양한 질병의 매개체로써 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다(Nishida et al.
개소시랑개비의 서식지는?
본 연구에서 사용된 개소시랑개비(Potentilla supina)는 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 여러해살이풀로서 잎의 가장자리에 톱니가 있어, 그 모양이 쇠스랑을 닮아 그렇게 불리게 되었다. 어린 줄기와 잎은 식용하며, 한국(충북, 경기, 강원, 평남, 함남, 함북)을 비롯한 북반구의 온대지방(중국, 일본 및 한국)에 분포한다. 본 연구에서는 식용이 가능하고 자생력이 강한 개소시랑개비가 5월 중에 논이나 밭에서 제초되는 것으로 확인되어, 이를 이용한 항염증 등의 기능성식품 소재 기초자료로서 활용 가능성을 제시하고자 실험하였다.
iNOS가 발현되는 세포는?
이 중 NO는 반응성이 높은 물질로 NO synthase (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 생성되며 NOS는 항시적인 NOS와 유도성의 NOS (iNOS)로 나누어진다. 특히 iNOS는 외부 자극이나 염증성 사이토카인 등에 의해 자극을 받게 되면 hepatocytes, smooth muscle cells, bone marrow cells, monocytes, macrophages 등 다양한 세포에서 발현되어 다량의 NO를 생산한다고 보고되고 있다. 즉, iNOS와 COX-2의 발현과 NO, PGE2의 생성은 면역세포의 대표적인 염증 유발 인자이다.
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