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문제 정의
- 본 연구에서는 효율적인 무 검은무늬병 저항성 검정법을 확립하고자, 광 조사기간에 따른 A. brassicicola 균주들의 포자 형성량과 병원성을 조사하여 저항성 검정에 사용할 균주를 선발하고, 이 검은무늬병균에 대한 시판 중인 무 61개 품종의 저항성 정도를 조사하고, 저항성 정도가 다른 4개의 무 품종을 선발하여 생육 정도, 접종원 농도 및 재배 온도 등의 발병 조건에 따른 이들 품종의 A. brassicicola에 의한 검은무늬병 발생을 조사하였다.
- brassicicola의 포자 형성을 효과적으로 유도하는 방법으로 V-8 juice agar 배지에 접종하고 7일 동안 배양한 후에 하루에 12시간씩 1일 동안 광(55 µmol·m-2 ·s-1)을 처리를 하는 방법을 확립하였다. 한편, A. brassicicola의 race 분화는 아직 보고된 바 없으므로 실험한 균주 중 A. brassicicola KACC 40036가 포자의 형태가 균일하고 다른 균주보다 많은 포자를 형성하였으므로, 이 균주를 무 검은무늬병 저항성 검정법을 확립을 위해 선발하였다. 그리고 향후 보다 정확한 무 검은무늬병 저항성 검정을 위해 다양한 저항성 유전자원을 확보한 후에 A.
제안 방법
- A. brassicicola 7개 균주들의 광처리 기간에 따른 포자 형성량을 조사하고자 각각의 균주를 potato dextrose agar(PDA; Becton, Dickinson and Co.) 배지에 접종하고 25°C에서 7일간 전배양하여 형성된 균총으로부터 균사조각을 떼어내 직경 8.5cm Petri dish의 V-8 juice agar[V8 agar; V-8 Juice (V8 Campbell Soup Co.) 200mL, CaCO₃3g (Samchun Chem. Co., Ltd.), Agar (Junsei Chemical Co., Ltd.) 18g, distilled water 800mL] 배지 중앙에 1조각씩 올려놓고 알루미늄 호일로 싸서 암상태가 되도록 한 후에 25°C에서 7일 동안 배양 하였다.
- A. brassicicola 7개 균주의 병원성 실험은 앞에서 같이 동일한 방법으로 접종하고 25°C 습실상에서 48시간 배양한 후에 항온항습실(25°C, 상대습도 80%)에서 1일 동안 재배한 후에 병조사 하였다.
- A. brassicicola 7개 균주의 병원성과 재배 온도에 따른 무 검은무늬병 발생 실험을 제외한 모든 실험은 A. brassicicola KACC 40036의 포자현탁액을 무 유묘가 충분히 젖도록 분무 접종한 후에 25°C 습실상에서 암상태로 24시간 동안 배양하였다.
- A. brassicicola 균주들의 병원성 실험과 접종원 농도에 따른 4개 품종들의 저항성 정도 실험을 제외한 모든 실험은 포자현탁액의 포자 농도를 2.0 × 105 spores·mL-1로 조정하여 사용하였고, 접종원 농도에 따른 검은무늬병 발생 실험을 위해서는 포자 현탁액의 포자 농도가 각각 2.5 × 104 , 5.0 × 104 , 1.0 × 105 , 2.0 × 105 spores·mL-1 가 되도록 준비하였다.
- A. brassicicola 균주들의 병원성 실험을 제외한 나머지 실험은 A. brassicicola KACC 40036 균주를 PDA 배지에 접종하고 25°C에서 7일간 배양한 균총으로부터 균사조각을 떼어내어 직경 8.5cm Petri dish의 V-8 juice agar 배지에 3조각씩 올려놓고 25°C에서 7일 동안 배양하였다.
- Sixteen-day-old seedlings were inoculated with various concentration (2.5 × 104 , 5.0 × 104 , 1.0 × 105 and 2.0 × 105 spores·mL-1) of Alternaria brassicicola KACC 40036 spore suspension by the spray method.
- 배양한 검은무늬병균 plate의 뚜껑을 열고 25°C 항온항습실(상대습도 80%)에서 하루에 12시간씩 광(55µmol·m-2 ·s-1 )을 처리하면서 1일 또는 2일간 배양한 후에 배지에 멸균수 20mL를 넣고 멸균한 붓으로 긁어 포자를 수확하였다. 그리고 4겹의 거즈로 걸러서 균사체를 제거하고 광학현미경 하에서 hemocytometer를 이용하여 mL 당 포자의 수를 조사하고 이를 각 배지 plate에 형성된 포자의 수로 환산하였다. 실험은 처리 당 3개의 plate를 사용 하였으며, 각 실험은 2회 반복하여 실시하였다.
- 그리고 A. brassicicola KACC 40036을 다양한 포자 농도로 접종하여 병원성을 조사하는 실험을 위해서는 포자현탁액의 포자 농도가 각각 3.7 × 103 , 1.1 × 104 , 3.3 × 104 , 1.0 × 105 , 3.0 × 105 spores·mL-1이 되도록 조정하였다.
- 그리고 이 Petri dish의 뚜껑을 열고 25°C 항온항습실(상대습도 80%)에서 하루에 12시간씩 광(55µmol·m-2 ·s-1)을 조사하면서 1일간 배양한 후에 ‘광처리 시간에 따른 A. brassicicola 7균주의 포자 형성량 조사’ 실험과 동일한 방법으로 포자를 수확하고 포자 농도를 측정하였다.
- 그리고 재배온도에 따른 무 검은무늬병 발생 실험은 A. brassicicola KACC 40036을 앞에서와 같은 방법으로 접종하고 각각 20, 25, 30°C 습실상에 넣고 48시간 동안 배양한 후에 검은무늬병 발생 정도를 조사하였다.
- 따라서 무 검은무늬병 저항성 검정을 위한 A. brassicicola의 포자 형성을 효과적으로 유도하는 방법으로 V-8 juice agar 배지에 접종하고 7일 동안 배양한 후에 하루에 12시간씩 1일 동안 광(55 µmol·m-2 ·s-1)을 처리를 하는 방법을 확립하였다.
- 배양한 검은무늬병균 plate의 뚜껑을 열고 25°C 항온항습실(상대습도 80%)에서 하루에 12시간씩 광(55µmol·m-2 ·s-1 )을 처리하면서 1일 또는 2일간 배양한 후에 배지에 멸균수 20mL를 넣고 멸균한 붓으로 긁어 포자를 수확하였다.
- 습실 처리한 유묘는 항온항습실(25°C, 상대습도 80%)로 이동하여 하루에 12시간씩 광(55 µmol·m-2 ·s-1)을 처리하며 재배하여 병발생을 유도하였고, 접종 2일 후에 잎에 발생한 검은무늬병의 병반면적율(%)을 달관조사 하였다.
- 시판 중인 무 61개 품종의 A. brassicicola에 대한 저항성 정도 실험은 10반복씩 2회 수행하였으며, 나머지 모든 무 검은무늬병 발생 실험은 5반복으로 2회 수행하였다. 그리고 SAS(SAS 9.
- 이들 품종 중 종자회사에서 검은무늬병에 대한 저항성으로 공시한 품종은 없었고 우리의 저항성 검정 결과에서도 강한 저항성 품종은 없었으므로, 무 검은무늬병 저항성 검정 체계확립을 위한 발병조건에 따른 무 검은무늬병 발생 실험을 위해 실험한 품종 중 높은 감수성을 보인 ‘토광’과 ‘대평여름’ 그리고 약한 저항성을 보인 ‘금봉’과 ‘새롬’을 선발하였다.
- 이상의 결과로부터 무 검은무늬병의 저항성 검정을 위한 효과적인 방법으로 종자를 파종하고 온실(25 ± 5°C)에서 16일 동안 재배한 무 유묘의 잎에 A. brassicicola의 포자현탁액(2.0 × 105 spores·mL-1)을 충분히 분무하여 접종하고, 25°C 습실상에서 24시간 동안 습실처리한 후에 25°C의 항온항습실(상대습도 80%)로 이동하여 하루 12시간씩 광을 조사하면서 재배하고, 접종 2일 후에 잎에 발생한 검은무늬병의 병반면적율(%)을 달관조사 하는 것을 제안하고자 한다.
- 무의 생육 정도에 따른 검은무늬병 발생 실험을 제외한 모든 실험에서는 무 종자를 5 × 8 육묘용 연결 포트(70mL/pot, 범농사)에 원예용상토 5호(부농사)를 넣고 포트 당 2립씩 파종하고 온실(25 ± 5°C)에서 재배하였다. 종자가 발아한 후 생장이 고른 개체로 포트 당 1주씩 남기고 솎아 주었다. 파종 후 13-16일 동안 재배한 유묘를 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- A. brassicicola 7개 균주들의 무에 대한 병원성 실험은 ‘한농알타리’(동부팜한농)와 ‘미농조생’(아시아종묘)을 그리고 발병 조건에 따른 무 품종 등의 검은무늬병 발생 실험은 ‘금봉’(권농종묘), ‘새롬’(신젠타), ‘토광’(동부팜한농), ‘대평여름’(신젠타) 네품종을 사용하였다.
- Disease severity was measured two days after inoculation, and is represented as percentage of infected leaf area. The data were obtained from five replicates with two repetitions.
- Disease severity was measured two days after inoculation, and is represented as percentage of infected leaf area. The data were obtained from two runs with five replicates each.
- brassicicola 7균주의 광처리 시간에 따른 포자 형성량 조사’ 실험에서 수확한 포자를 사용하여 포자 농도가 5.0 × 105 spores·mL-1인 포자현탁액을 준비하였다.
- 그리고 무의 생장 정도에 따른 검은무늬병 발생 실험은 앞에서와 동일한 방법으로 파종하고 온실(25 ± 5°C)에서 10, 13, 16, 19일 동안 재배한 유묘를 실험에 사용하였다.
- 농촌진흥청 농업유전자원센터(KACC)로부터 무 검은무늬병균 A. brassicicola 7균주(KACC 40034, 40036, 40857, 43923, 44415, 44877, 44878)를 분양받아 실험에 사용하였다.
- 실험한 균주 중 KACC 40036와 KACC 43923은 가장 많은 포자를 형성하였는데 1일 광처리후에 각각 plate 당 1.1 × 108, 1.4 × 108개의 포자를 형성하였다(Table 1).
- 종자가 발아한 후 생장이 고른 개체로 포트 당 1주씩 남기고 솎아 주었다. 파종 후 13-16일 동안 재배한 유묘를 실험에 사용하였다. 그리고 무의 생장 정도에 따른 검은무늬병 발생 실험은 앞에서와 동일한 방법으로 파종하고 온실(25 ± 5°C)에서 10, 13, 16, 19일 동안 재배한 유묘를 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 그리고 SAS(SAS 9.1, SAS Institute Inc., USA) 프로그램을 이용하여 ANOVA 분석을 하였으며, 처리 평균간 비교를 위하여 Duncan’s multiple range test(p = 0.05)를 실시하였다.
이론/모형
- Sixteen-day-old seedlings were inoculated with spore suspension (2.0 × 105 spores·mL-1) of Alternaria brassicicola KACC 40036 by the spray method.
- zThirteen-day-old seedlings of radish cultivars were inoculated with a spore suspension (2.0 × 105 spores·mL-1) of A. brassicicola KACC 40036 by the spray method.
성능/효과
- A. brassicicola 7개 균주들의 무에 대한 병원성 검정을 검정하고자 2개 무 품종(한농알타리, 미농조생)에 병원균을 분무 접종하고 검은무늬병 발생을 실험한 결과, 실험한 균주 모두는 무 유묘에 분무접종하고 3일 후에 유묘 전체가 고사하였다(Table 1, Fig. 1). 따라서 7균주의 병원성 실험에서 접종한 유묘가 모두 고사한 것은 다른 실험들이 24시간 습실처리한 것과 달리 48시간 동안 습실처리하여 검은무늬병이 심하게 발생한 것으로 생각되었다.
- 감수성 품종인 ‘토광’과 ‘대평여름’은 1.0 × 105 spores·mL-1 이하에서는 71% 이하의 다소 낮은 병반면적율을 보였으나, 2.0 × 105 spores·mL-1에서는 88% 이상의 높은 병반면적율을 보였다(Fig. 4).
- 광(55 µmol·m-2 ·s-1)을 조사한 기간에 따른 A. brassicicola 7개 균주(KACC 40034, 40036, 40857, 43923, 44415, 44877, 44878)의 포자 형성량을 실험한 결과, 7균주 모두 암상태에서 7일 동안 배양하였을 때에는 hemocytometer로 포자 형성량을 조사하기 어려울 정도로 적은 양의 포자가 형성되었으나(결과 미제시), 광을 처리하였을 때에는 실험한 균주 모두 포자 형성량이 크게 증가하여 6.0 × 106개부터 1.4 × 108개의 많은 포자가 형성되었다(Table 1).
- 따라서 7균주의 병원성 실험에서 접종한 유묘가 모두 고사한 것은 다른 실험들이 24시간 습실처리한 것과 달리 48시간 동안 습실처리하여 검은무늬병이 심하게 발생한 것으로 생각되었다. 그리고 KACC 40036 균주의 포자현탁액을 5가지 농도로 하여 두 품종의 무 유묘에 접종하고 24시간 습실처리하고 2일 후에 발병 정도를 조사한 결과, 두 품종 모두 접종한 포자 농도 의존적으로 검은무늬병이 발생하였다(Fig. 2). 비병원성 균주는 습실처리 시간을 길게 하여도 병이 발생하지 않으므로, 실험한 A.
- 그리고 유묘에 병원균을 접종하고 20, 25, 30°C에서 재배하였을 때 무 4품종의 평균 발병도는 각각 27, 82, 47%를 나타내 25°C에서 검은무늬병이 가장 효과적으로 발생하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 따라서 A. brassicicola의 포자 형성을 위한 광 (55µmol·m-2 ·s-1) 조사는 1일이면 충분하다고 생각되었다.
- 3). 따라서 품종의 저항성 정도와 관계없이 무가 생장할수록 검은무늬병 발생이 감소하는 것을 알 수 있었으며, 실험한 4가지 생육 시기 중 16일 재배한 유묘는 품종간 검은무늬병에 대한 저항성 차이가 가장 뚜렷하여 검은무늬병 저항성 검정에 적합한 무의 생육 시기로 생각되었다.
- 무 4품종의 파종 시기를 다르게 하여 10, 13, 16, 19일 동안 재배한 유묘에 병원균 접종하고 무 유묘의 생육 시기에 따른 검은 무늬병의 발생을 조사한 결과, 16일 재배한 유묘의 경우에는 ‘금봉’, ‘새롬’, ‘토광’, ‘대평여름’ 각각 82, 82, 95, 98%의 평균 병반 면적율을 보였다(Fig. 3).
- 본 결과로부터 A. brassicicola에 의한 무의 검은무늬병 저항성 검정을 위해서는 2.0 × 105 spores·mL-1 농도로 접종하여 실험하는 것이 효과적이라 생각되었다.
- 2). 비병원성 균주는 습실처리 시간을 길게 하여도 병이 발생하지 않으므로, 실험한 A. brassicicola 균주는 모두 무에 대하여 강한 병원성이 있다는 것을 알 수 있었다.
- 시판 중인 61개 무 품종의 A. brassicicola KACC 40036에 대한 저항성 정도를 조사하기 위하여 실험한 결과, 실험한 품종 중 높은 저항성을 나타내는 품종은 없었다. 하지만 ‘대평여름’ 등이 95% 이상의 병반면적율을 보이는 반면에 ‘금봉’, ‘백춘’, ‘새롬’ 등은 54-66%의 병반면적율을 보여 이들이 A.
- 저항성 정도가 다른 그룹으로 나누어 살펴보면 비교적 약한 저항성을 보인 ‘금봉’과 ‘새롬’ 두 품종에 대한 10, 13, 16, 19일 재배한 유묘의 평균 병반면적율은 각각 98, 93, 82, 67%을, 그리고 감수성 품종 ‘토광’과 ‘대평여름’ 두 품종은 각각 100, 99, 97, 81%의 병반면적율을 보였다(Fig. 3).
- 접종 후 재배온도(20, 25, 30°C)에 따른 네 가지 무 품종들의 검은무늬병 발생을 실험한 결과, 25°C의 경우에는 ‘금봉’, ‘새롬’, ‘토광’, ‘대평여름’에서 각각 74, 75, 89, 89%의 병반면적율을 보였다(Fig. 5).
- 접종원 농도(2.5 × 104 , 5.0 × 104 , 1.0 × 105 , 2.0 × 105 spores·mL-1)에 따른 4개 무 품종의 검은무늬병 발생을 실험한 결과, 실험한 모든 품종들은 모두 접종 농도가 증가할수록 검은무늬병 발생이 증가하였다(Fig. 4).
- 5). 즉, 감수성 품종들에서는 검은무늬병이 심하게 발생하였고, 감수성 및 약한 저항성 품종 간의 발병 정도 차이 또한 효과적으로 나타났다. 하지만 20°C와 30°C에서는 감수성 품종을 비롯한 모든 품종에서 58% 이하의 낮은 병반면적율을 보였을 뿐만 아니라, 감수성 및 약한 저항성 품종간의 차이도 거의 없었다(Fig.
- 하지만 10일 또는 13일 재배한 유묘는 실험한 품종 모두에서 91% 이상의 높은 병반면적율을 보였으며, 19일 재배한 유묘는 감수성 품종인 ‘토광’과 ‘대평여름’이 각각 86%와 75%의 다소 낮은 병반면적율을 나타냈다(Fig. 3).
- 하지만 본 실험에서 무 4품종에서 접종원 농도에 따른 검은무늬병 발생을 조사한 결과에서는 2.5 × 104 , 5.0 × 104 , 1.0 × 105 , 2.0 × 105 spores·mL-1 농도로 접종하였을 때 각각 16, 30, 48, 74%의 평균 발병도를 나타내며, 접종한 포자 농도가 높아질수록 실험한 무 품종들의 검은무늬병의 발생은 증가하였다(Fig. 4).
- rapa 품종은 30일 재배한 유묘의 잎에서는 강한 저항성을 나타내었지만 40일 재배한 식물의 잎에서는 경계선 상의 저항성을 나타냈으며, 감수성 품종도 생장 단계에 따라 서로 다른 병 발생 정도를 보이며 나이든 잎이 어린 잎에 비해 더 감수성을 나타낸다고 보고하였다. 하지만 본 실험에서는 10, 13, 16, 19일 동안 재배한 무 유묘의 검은무늬병 발생을 실험한 결과, 무 4품종의 평균 발병도는 각각 99, 96, 89, 74%로 무가 성장할수록 검은무늬병 발생은 감소하였다(Fig. 3). 이는 실험에 사용한 무 식물의 생장 정도가 서로 다르기 때문인 것으로 생각되었다.
후속연구
- brassicicola KACC 40036가 포자의 형태가 균일하고 다른 균주보다 많은 포자를 형성하였으므로, 이 균주를 무 검은무늬병 저항성 검정법을 확립을 위해 선발하였다. 그리고 향후 보다 정확한 무 검은무늬병 저항성 검정을 위해 다양한 저항성 유전자원을 확보한 후에 A. brassicicola의 race 분화에 관한 연구를 수행할 예정이다.
- brassicicola의 포자를 생산하는 것이 중요하다. 이를 위해서는 기존의 포자 형성 방법들을 비교하여 가장 효율적으로 A. brassicicola의 포자를 대량생산할 수 있는 방법을 선발하는 것이 필요하다. 기존 연구자들의 포자 형성 방법을 실험을 통해 비교한 결과, A.
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