[논문]지방간에 대한 백두구 에틸아세테이트 추출물의 억제 효과 및 기전 연구

임동우; 김혁; 박성윤; 박선동; 박원환; 김재은

doi:10.15188/kjopp.2017.06.31.3.159

[국내논문] 지방간에 대한 백두구 에틸아세테이트 추출물의 억제 효과 및 기전 연구
Study of the Suppressive Effect and Its Mechanism of Amomum Cardamomum L. on Free Fatty Acid-induced Liver Steatosis 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.31 no.3, 2017년, pp.159 - 166

임동우 (동국대학교 한의과대학 병리학교실) , 김혁 (동국대학교 한의과대학 진단학교실) , 박성윤 (동국대학교 한의과대학 진단학교실) , 박선동 (동국대학교 한의과대학 방제학교실) , 박원환 (동국대학교 한의과대학 진단학교실) , 김재은 (동국대학교 한의과대학 병리학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Through this study, the authors investigated the anti-steatosis effects of the Amomum cardamomum ethyl acetate fraction in free fatty acids (FFAs)-induced human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. The ethyl acetate fraction of Amomum cardamomum (ACEA) was extracted with 70% ethanol and then the extract was evaporated using a rotary evaporator prior to sequential fractionation. Human hepatocellular carcinoma were treated with different concentrations of ACEA in the presence and absence of FFAs. To demonstrate the reactive oxygen species (ROS) scavenging activity, DCFDA level was analyzed by using in vitro assay system. Cell viability, lipid accumulation, intracellular triglycerides, malondialdehyde (MDA), liver steatosis related signaling molecules and inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-6, 8, tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$) were also investigated. As results, ACEA inhibited the FFAs-induced ROS, lipid accumulation, intracellular triglycerides, and MDA in a dose dependent manner. Treatment of human hepatocellular cells with ACEA induced the phosphorylation of 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) and carnitine palmitoyltransferase I (CPT1) expression using western blot analysis. ACEA also potently suppressed the FFAs-induced inflammatory cytokines including IL-6, IL-8 and $TNF-{\alpha}$. These results suggest that the ethyl acetate fraction of Amomum cardamoum extract own inhibitory effects of liver steatosis by inhibiting ROS, lipid accumulation, intracellular triglycerides, MDA through AMPK signaling and anti-inflammatory actions.

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AI 본문요약
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문제 정의

따라서 스타틴 계열 약물의 효능 향상과 성분 개량을 통한 부작용 감소의 노력이 다국적 제약 회사를 중심으로 연구 진행 중에 있으며, 민족 고유의 전통 한약에서 고지혈에 유효한 성분을 발견하는 것이 유의미한 연구가 될 것이다. 본 연구에서는 DCF-DA법을 이용하여 백두구 에틸아세테이트 분획(ACEA)및 스타틴(pravastatin)을 인간의 간암 세포주(human hepatocellular carcinoma cell line, HepG2)에 처리하여 ROS를 소거하는 활성을 살펴보았다. 세포 생존율 실험에서 HepG2 cells의 생존에 아무런 영향을 주지 않는 ACEA의 농도(Fig.
위장이 차서 일어나는 구토, 복통 등을 치료하는 것을 보아 현대 의학적 해석으로 위액 분비 촉진과 장관의 흥분 등의 작용을 나타내어 소화기 질환에 적용 가능하다. 본 연구에서는 백두구를 성분 분획 추출하여 소화 작용을 상승시키는 약물이 간 지방증(liver steatosis)에 미치는 영향을 평가하였으며, 다음과 같은 긍정적 결론을 도출할 수 있었다.
. 하지만 세포 수준에서 지방간을 예방하거나 치료하는 백두구 추출물의 효과는 알려진 바 없으므로, 본 연구에서는 사람의 간암 세포인 HepG2(human hepatocellular carcinoma)에서 자유 지방산(free fattyacids)로 유도한 지방간 모델에서 백두구 에텔아세테이트 분획이AMPK 신호를 경유하여 간에 지방 축적을 억제하는 기전과 염증성사이토카인을 조절하는 효과를 보고하는 바이다.

제안 방법

단, β-actin은 SantaCruz사의 제품을 이용하였다. 1차 항체의 반응은 4℃에서 over night 동안 결합을 유도한 후 2차 항체 반응을 위하여 TBST로 수차례 세척을 실시하였으며, horseradish peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체를 1:2000의 비율로 TBST에 희석하여 90분 동안 반응을 전개하였다. 최종 이미지는 Las3000 (Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석을 실시하였고, 발현된 단백질에 대한 정량 값은 Las3000 장비를 이용하여 β-actin 대비 목적 단백질의 발현량으로 normalization을 진행하여 값으로 표시 하였다.
7% agarose gel에서 85 volt 전압으로 한 시간 동안 전기영동 하였다. Gel은 Coomassie brilliant blue R-250 용액으로 염색하고 탈색하는 과정을 반복하여 최종 결과를 획득하여 분석하였다.
HepG2 세포에서 간 지방의 축적 모델은 1 mM의 지방산(palmitic acid 및 oleic acid, 1:2)으로 24시간 동안 실시하였으며, 저농도와 고농도의 ACEA (25 및 50 μg/mL) 및 statin (50 μg/mL)을 각 각 처리하였다.
반응을 종료한 후 배양 상등액을 제거한 뒤 PBS로 2회 세척을 실시하였으며, 초음파 분쇄기를 이용하여 세포의 lysate를 얻었다. Intracellular TG 값은 GPO-POD(glycerophosphate oxidase - peroxidase) kit (아산제약)에 제공된 방법에 따라 흡광도 492 nm에서 최종 값을 산출하였다.
Intracellular TG를 측정하기 위한 방법으로 48 well 세포 배양 용기에 10 × 104 cells/mL의 HepG2 세포를 접종하고 지방산을 첨가한 후 실험 조건에 따라 ACEA 및 statin을 처리하여 48시간 동안 반응을 유도하였다.
LDL은 주로 인지질과 콜레스테롤, apoB-100 등으로 구성된 heterogeneous 분자로 백두구 70% 에탄올 추출물(EtOH)과 EtOH추출물에서 용매별 성분분획을 실시한 시료에서 산화적 손상에 의한 ox-LDL 형성 저해율을 비교 분석하였다(Fig. 1). EtOH와 헥산(hexane), 부탄올(butanol) 및 여액인 수층(water)에서는 LDL의 산화를 차단하는 효과가 거의 나타나지 않았으나, 백두구 에텔아세테이트 분획(Amomum cardamom, ethyl acetate fration,ACEA) 층의 10 μg/mL의 농도에서 57.
. 간세포에 지방의 직접적 축적을 나타내는 Oil Red O 분석을 통하여 ACEA 및 statin이 지질의 축적을 저해하는 효능을 HepG2 세포에서 복합 지방산의 처리(palmitic acid 및 oleic acid)로 산출하였다(Fig. 3A).ACEA는 처리 농도 모두에서 statin 최고 농도(50 μg/mL)에서보다 유의적으로 의미 있는 지방 축적의 저해 정도를 나타내었으며, 아울러 세포 내 triglycerides의 축적을 제어하였다(Fig.
다양한 농도의 ACEA (10 - 200 μg/mL)가 포함된 배지로 교환하여 24시간을 배양하였으며, 10 μL의 EZ-Cytox 반응액을 첨가하여 2시간 동안 반응을 유도한 후 상등액을 옮겨 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
얻어진 에탄올 추출물 재료에 hexane, dichloromethane, ethyl acetate 및 butanol을 첨가하여 분별 하였으며, H₂O층의 여액을 분리하였다. 다음 과정으로 감압 농축을 실시하여 모든 시료에서 유기 용매를 제거하였으며, freezer dryer(Labconco, Kansas City, MO, USA) 동결 건조를 실시하여 시험에 사용할 수 있는 최종 분말 형태의 시료를 얻었다.
단백질 정량은 BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 실시하였고, 5%의 β-mercaptoethanol이 함유된 Laemmli sample buffer (BioRad, USA)로 희석하여 전기영동 실시를 위한준비를 하였다.
먼저 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)에 120 μg/mL의 농도로 희석한LDL에 추출물 및 분획물 시료를 최종 5 및 10 μg/mL의 농도가 되도록 첨가하였다.
1%(w/v)가 되도록 2-thiobarbituric acid(TBA, Sigma)을 첨가하여 95℃에서 1시간 동안 반응을 유도하였다. 반응을 마친 시료를 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 하여 상등액을 다시 96 well plate로 옮긴 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하고 MDA equivalents로 지질의 과산화 정도를 평가하였다.
방법으로 1 × 105 cells/well의 세포를 black well culture plate에 접종 시키고, 25 및 50 μg/mL의 ACEA와 양성대조군으로 동일한 농도의 pravastatin을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
백두구 EA 분획 추출물이 산화적 스트레스(oxidative stress)의 제어를 통하여 간 지방증을 억제하는 효과를 세포 내부의 신호분자(signaling molecule) 변화로 살펴보기 위하여 진핵생명체의 세포 및 조직 대사의 조절자 중 하나로 알려진 AMP-activated protein kinase (AMPK) 신호 전달 과정(AMPK signaling pathway)을 살펴보았다(Fig. 4). 알려진 바와 같이 AMPK는 지질대사에서 핵심적 역할을 담당하고 있으며, 특히 간에서 AMPK가인산화(phosphorylation)되면 지방산의 합성과 지방질 생합성이 차단된다²⁸⁾.
전기영동을 실시하기 직전 시료를 100℃에서 3분 동안 반응시켜 단백질의 변성을 유도하였으며, SDS-PAGE 전기영동에는 25 μg/lane의 단백질을 이용하였다. 본 실험을 수행하기위한 조건으로 10%의 SDS-polyacrylamide gel 상에서 100 V의 전압으로 80 분 동안 전기영동을 실시하였으며, PVDF membrane에 모든 단백질을 이동시키기 위한 과정으로 transfer를 실시하였다. Membrane은 비특이적 항체의 결합을 방지하기 위하여 5%skim milk에 실온에서 60분 동안 노출시켰으며, 본 실험에 관련된 항체는 anti-phospho-AMPK (Thr 172) 및 anti-CPT1α는 CellSignaling 제품을 사용하였다.
분리된 RNA에 AccuPower RT PreMix kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 제공된 manufacture의 설명에 따라 최종 부피가 20 μL가 cDNA를 합성하였으며, 실시간 중합효소 반응에 의한 DNA의 증폭을 유도하기 위한 primers는 IL-6, forward: 5'-CCTTGGGTCCAGTTGCCTTCT-3', reverse: 5'-CCAGTGCCTCTTTGCTGCTTTC-3', IL-8,forward: 5'-CTTTCAGAGACAGCAGAG-3', reverse: 5′-CTAAGTTCTTTAGCACTCC-3′, TNF-α, forward: 5'-TCTTCTCGAACCCCGAGTGA-3', reverse: 5'-CCTCTGATGGCACCACCAG-3', 그리고 house keeping gene으로 β-actin은 forward: 5'-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3', reverse, 5'-GACTGCTGTCACCTTCA CCGT-3'과 같다.
47%). 얻어진 에탄올 추출물 재료에 hexane, dichloromethane, ethyl acetate 및 butanol을 첨가하여 분별 하였으며, H₂O층의 여액을 분리하였다. 다음 과정으로 감압 농축을 실시하여 모든 시료에서 유기 용매를 제거하였으며, freezer dryer(Labconco, Kansas City, MO, USA) 동결 건조를 실시하여 시험에 사용할 수 있는 최종 분말 형태의 시료를 얻었다.
3%의 Oil O Red을 첨가하여 다시 30분 동안 실온에서 지질의 염색을 실시하였다. 염색된 세포는 흐르는 물에 2분 간 세척 후 세포가 건조되기 전 즉시 hematoxylin 대비염색으로 시험을 종료하였으며, 붉은 색으로 염색된 지질 방울은 isopropanol에 다시 녹여 흡광도 520 nm (Versamax, Molecular Devices, USA)에서 지질 값을 측정 하였다.
열매를 사용하는 한약재의 경우 지질이 많이 함유되어있는 특성 상 목적 질환에 유지(油脂) 성분이 유효한 한 것으로 알려져 있으나, 백두구의 경우에는 ox-LDL의 형성을 차단하는 효능이 EA 및 DCM 분획에 포함된 phenolic compounds로 추정되었다. 이러한 결과는 본 연구진의 선행 연구에서 CCl₄로 유도한 백서의 급성 간손상을 예방하거나 치료하는 백두구의 효능 결과와 일치하였으며 본 연구에서는 EA 층을 재료로 사용하여 실험을 진행하였다¹⁹⁾.
이어서 10 μM의 CuSO4를 혼합시켜 37℃에서 12시간 동안 반응을 유지한 후, 단백질 총량 기준으로 3 μg의 LDL을 0.7% agarose gel에서 85 volt 전압으로 한 시간 동안 전기영동 하였다.
전기영동을 실시하기 직전 시료를 100℃에서 3분 동안 반응시켜 단백질의 변성을 유도하였으며, SDS-PAGE 전기영동에는 25 μg/lane의 단백질을 이용하였다.
최종 100 μL의 Hank's 용액을 각 well 마다 첨가하여 spectrofluorometer (Gemini EM, Molecular Devices, CA, USA)에서 excitation 파장 485 nm와 emission 파장 535 nm를 이용하여 형광값을 측정하였다.
최종 이미지는 Las3000 (Fujifilm, Japan)을 이용하여 분석을 실시하였고, 발현된 단백질에 대한 정량 값은 Las3000 장비를 이용하여 β-actin 대비 목적 단백질의 발현량으로 normalization을 진행하여 값으로 표시 하였다.

대상 데이터

Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin은 Hyclone 사(Logan, UT, USA)의 제품을, 실시간 중합효소 반응에 필요한 SYBR Green qPCR MasterMix (2X)는 Thermo Fisher Scientific 사(Foster City, CA, USA)를 구매하였고, Oligo primers는 Macrogen (Seoul, Korea)에서 합성 하였다.
p-AMPK 항체와 CPT1은 Cell Signaling Technology 사(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, β-actin항체 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 구매 하였다. Intracellular triglycerides는 아산제약(Asan, Korea)의 kit를 사용하여 제공된 protocol에 따라 실험을 실시하였고, 그 밖의 시약은 모두 Sigma-Aldrich 사(St.Louis, MO, USA)의 특급 제품을 사용하였다.
Membrane은 비특이적 항체의 결합을 방지하기 위하여 5%skim milk에 실온에서 60분 동안 노출시켰으며, 본 실험에 관련된 항체는 anti-phospho-AMPK (Thr 172) 및 anti-CPT1α는 CellSignaling 제품을 사용하였다.
p-AMPK 항체와 CPT1은 Cell Signaling Technology 사(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, β-actin항체 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) 제품을 구매 하였다.
건조된 백두구는 동천당(경북 영천, 한국)에서 구입하여 정선수치하고 추출을 진행하였다. 먼저 파쇄한 100 g의 분말 시료에70% 에탄올 2 L를 첨가하여 실온에서 3일 동안 교반하고, Whatman filter#2에 여과시킨 후 rotary evaporator (Büchi, Flawil, Switzerland) 50℃의 온도에서 에탄올을 증발 시켰다(수율:29.
사람의 간암 세포주 HepG2는 한국세포주 은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양 받아 실험에 사용하였으며, 10%의 FBS와 1%의 penicillin-streptomycin이 함유된 DMEM에서 세포를 배양 하였다. 계대 배양은 배양용기에 70-80% 세포가 채워졌을 경우 시행 하였으며, 5%의 이산화탄소가 공급되는 CO₂ 배양기에서 37℃ 조건으로 배양을 유지 하였다.
에탄올을 포함하여 추출에 필요한 용매 및 사람의 low-density lipoprotein (LDL)은 모두 Merck 사(Darmstadt, Germany)의 제품을 구입하였으며, 2'7'-dichloro dihydofluorescein diacetate (DCFDA)는 Molecular Probes(Eugene, OR, USA) 제품을 실험에 사용하였다.

데이터처리

실험결과의 통계처리는 평균값 ± 표준편차(means ± S.D)로 나타내었으며, 유의성 검증은 GraphPad Prism 5 프로그램에서 One-Way Anova 방법을 이용하여 p<0.05 인 경우에 결과 값이 유의한 것으로 인정하였다.

이론/모형

ACEA가 세포 내 활성산소종(intracellular ROS)을 소거하는 능력을 평가하기 위하여 DCFDA법²⁰⁾을 이용한 실험을 진행하였다. 방법으로 1 × 10⁵ cells/well의 세포를 black well culture plate에 접종 시키고, 25 및 50 μg/mL의 ACEA와 양성대조군으로 동일한 농도의 pravastatin을 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
계대 배양은 배양용기에 70-80% 세포가 채워졌을 경우 시행 하였으며, 5%의 이산화탄소가 공급되는 CO₂ 배양기에서 37℃ 조건으로 배양을 유지 하였다. 세포 생존율 측정은 EZ-cytox viability assay kit (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)의 제품을 이용하여 제공된 방법에 따라 실시하였다. 96 well의 세포배양 용기에 well당 1 × 10⁵개의 세포를 접종시키고 24시간 동안 배양한 후 FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지로 다시 24시간 starvation을 유도하였다.
분리된 RNA에 AccuPower RT PreMix kit (Bioneer, Korea)를 사용하여 제공된 manufacture의 설명에 따라 최종 부피가 20 μL가 cDNA를 합성하였으며, 실시간 중합효소 반응에 의한 DNA의 증폭을 유도하기 위한 primers는 IL-6, forward: 5'-CCTTGGGTCCAGTTGCCTTCT-3', reverse: 5'-CCAGTGCCTCTTTGCTGCTTTC-3', IL-8,forward: 5'-CTTTCAGAGACAGCAGAG-3', reverse: 5′-CTAAGTTCTTTAGCACTCC-3′, TNF-α, forward: 5'-TCTTCTCGAACCCCGAGTGA-3', reverse: 5'-CCTCTGATGGCACCACCAG-3', 그리고 house keeping gene으로 β-actin은 forward: 5'-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3', reverse, 5'-GACTGCTGTCACCTTCA CCGT-3'과 같다. 중합효소 연쇄반응은 Light Cycler Fast StartDNA Master SYBR Green mix를 사용하여 Light Cycler instrument (Roche Applied Science, USA)에서 실시하였다.
지질의 과산화 정도를 측정하기 위한 방법으로 MDA 법²⁰⁾을 실시하였으며, 실험 조건 배양을 마친 세포에서 배양 상등액을 제거한 후 부착 세포를 cell scraper로 긁어 e-tube에 옮겨 담았다. 차가운 PBS를 이용하여 재현탁 하였으며, spin down 과정을 거쳐 상등액 최종 농도가 8.

성능/효과

ACEA가 사람의 간암 세포주인 HepG2 cell의 생존율에 미치는 영향을 평가하고자 MTT assay를 실시한 결과 최종농도 10 - 200 μg/mL에서 각 각 116.5, 85.4, 87.6, 76.8, 66.7 및 38.3%의 생존이 관찰되었다(Fig. 2A).
ACEA는 또한 세포내의 주요한 신호 전달 과정으로 AMPK-signaling pathway를 경유 하였으며, 인산화된 AMPK 신호의 주요한 하위전달 과정에서 CPT-1α를 자극하여 간에서 지방산의 합성을 저해하는 것으로 확인이 되었다.
EtOH와 헥산(hexane), 부탄올(butanol) 및 여액인 수층(water)에서는 LDL의 산화를 차단하는 효과가 거의 나타나지 않았으나, 백두구 에텔아세테이트 분획(Amomum cardamom, ethyl acetate fration,ACEA) 층의 10 μg/mL의 농도에서 57.9%의 저해율이 관찰되었다.
FFAs로 염증성 cytokines의 mRNA 발현을 유도한 결과 IL-6는 약 17.5배, IL-8은 8.0배, 그리고 TNF-α는 약 8.3배의 발현이 증가되었으나, ACEA 및 statin을 처리한 경우 IL-6 및 TNF-α는 ACEA 농도에 의존적인 발현 감소를 나타내었다.
ORO 시험법으로 ACEA가 세포 내 지질 축적을 방어하는 효능을 살펴본 결과 25 및 25와 50 μg/mL 농도에서 의존적인 감소가 관찰되었으며(O.D 값 평균, 각 0.55 및 0.49), 양성 대조군으로 처리한 50 μg/mL statin 보다 우수한 효능을 나타내었다(Fig. 3A).
이상의 실험결과 ACEA는 LDL의 산화를 차단하고, ROS를 소거하였으며, 조직에서 지방의 축적을 방어하는 효능을 나타내었다. 그리고 TG와 같은 지방산의 합성을 억제하였으며, 지방산의 산화로 인한 세포의 손상을 방어하는 것으로 관찰이 되었다. ACEA는 또한 세포내의 주요한 신호 전달 과정으로 AMPK-signaling pathway를 경유 하였으며, 인산화된 AMPK 신호의 주요한 하위전달 과정에서 CPT-1α를 자극하여 간에서 지방산의 합성을 저해하는 것으로 확인이 되었다.
3배의 발현이 증가되었으나, ACEA 및 statin을 처리한 경우 IL-6 및 TNF-α는 ACEA 농도에 의존적인 발현 감소를 나타내었다. 대조군으로 사용한 statin은 본 연구 실험 중 염증성 cytokines를 가장 잘 조절하는 효능을 나타내었다(Fig. 5A, B, C).
TNF-α 또한 체내의 염증성 반응 중 급성 단계 반응에서 세포 신호 전달에 관여하는 사이토카인으로 선제적 면역 반응(primary immune response)을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 ACEA가 지방산으로 유도한 이들 사이토카인류의 mRNA 수준을 정상 범위로 조절하는 효과 확인을 통하여 간의 만성적 염증에 의하여 축적된 간 지방증을 제어할 수 있을 것으로 분석 되었다.
특히, 단핵구(monocyte) 세포의 분화를 촉진하여 대식세포(macrophage)의 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 분비를 유도하여 궁극적으로 염증 반응의 진행에 부담을 증가 시키는 것으로 잘 알려져 있다²²⁾. 백두구 추출물 중 어떠한 성분 분획이 우수한ox-LDL 저해 활성을 갖는지 살펴 본 결과 ethyl acetate (EA)층과 dichloromethan (DCM) 층에서 우수한 저해 성능을 나타내었다(Fig. 1). 열매를 사용하는 한약재의 경우 지질이 많이 함유되어있는 특성 상 목적 질환에 유지(油脂) 성분이 유효한 한 것으로 알려져 있으나, 백두구의 경우에는 ox-LDL의 형성을 차단하는 효능이 EA 및 DCM 분획에 포함된 phenolic compounds로 추정되었다.
백두구의 에틸아세테이트 분획 추출물 (Ammomum cardamun L., Ethyl acetate fraction, ACEA)은 사람의 LDL 산화를 우수한 효능으로 방어 하였고, 산화적 스트레스를 억제하는 기전을 나타내었다. 세포 실험에서 ACEA가 생존율에 영향을 미치지 않는 범위에서 지질의 축적(ORO), 지방산 합성의 감소(TG) 및 지질과산화(MDA) 억제를 나타내었으며, AMPK 신호 전달 경로를 경유하는 것으로 보인다.
본 연구에서는 DCF-DA법을 이용하여 백두구 에틸아세테이트 분획(ACEA)및 스타틴(pravastatin)을 인간의 간암 세포주(human hepatocellular carcinoma cell line, HepG2)에 처리하여 ROS를 소거하는 활성을 살펴보았다. 세포 생존율 실험에서 HepG2 cells의 생존에 아무런 영향을 주지 않는 ACEA의 농도(Fig. 2A)와 동일한 비율로 실험 대조군 스타틴(pravastatin)을 사용하였으며, 결과적으로 스타틴보다 ACEA가 ROS를 소거하는 효능이 우수한 것으로 관찰이 되었다.
, Ethyl acetate fraction, ACEA)은 사람의 LDL 산화를 우수한 효능으로 방어 하였고, 산화적 스트레스를 억제하는 기전을 나타내었다. 세포 실험에서 ACEA가 생존율에 영향을 미치지 않는 범위에서 지질의 축적(ORO), 지방산 합성의 감소(TG) 및 지질과산화(MDA) 억제를 나타내었으며, AMPK 신호 전달 경로를 경유하는 것으로 보인다. 나아가 사이토카인류(IL-6, IL-8 및TNF-α)를 정상 범위로 조절하는 것을 볼 때 고지방식으로 유도된 간의 지방증을 예방하거나 치료하는 비교적 구성이 간단한 물질로ACEA는 안정적이며 유효성이 있을 것으로 사료된다.
이상의 실험결과 ACEA는 LDL의 산화를 차단하고, ROS를 소거하였으며, 조직에서 지방의 축적을 방어하는 효능을 나타내었다. 그리고 TG와 같은 지방산의 합성을 억제하였으며, 지방산의 산화로 인한 세포의 손상을 방어하는 것으로 관찰이 되었다.
지질의 과산화를 억제하는 효과를 관찰한 결과 50 μg/mL의 ACEA는 양성대조군으로 처리한 quercetin 1 μM 보다 약 2배 정도 효능이 우수한 것으로 나타내었다(Fig. 3C).
지질의과산화 정도를 평가하기 위한 malondialdehyde (MDA) 지질과산화 측정법을 실시한 결과 양성대조군인 quercetin (최종농도 1 μM)보다 과산화 억제의 효능이 우수한 것으로 측정되었다(Fig. 3C).
평가에 따른 결과로 세포가 안정한 농도를 25와 50 μg/mL로 설정하였으며, 1 mM의 free fatty acids (FFAs, palmitic acid 및 oleic acid, 1:2 비율)로 산화적 스트레스를 유발하였을 때 ACEA 50 μg/mL의 농도에서 형광값이 113.7로 시험군 중 가장 낮게 관찰 되었다(Fig. 2B).

후속연구

ACEA는 또한 세포내의 주요한 신호 전달 과정으로 AMPK-signaling pathway를 경유 하였으며, 인산화된 AMPK 신호의 주요한 하위전달 과정에서 CPT-1α를 자극하여 간에서 지방산의 합성을 저해하는 것으로 확인이 되었다. 끝으로 복합 지방산에 의해 유도한 염증성 반응을 정상 범위 수준까지 낮춰 간에서 지방의 축적으로 인하여 유발되는 염증성 반응을 조기에 차단할 수 있을 것으로 예상되었다.
. 따라서 스타틴 계열 약물의 효능 향상과 성분 개량을 통한 부작용 감소의 노력이 다국적 제약 회사를 중심으로 연구 진행 중에 있으며, 민족 고유의 전통 한약에서 고지혈에 유효한 성분을 발견하는 것이 유의미한 연구가 될 것이다. 본 연구에서는 DCF-DA법을 이용하여 백두구 에틸아세테이트 분획(ACEA)및 스타틴(pravastatin)을 인간의 간암 세포주(human hepatocellular carcinoma cell line, HepG2)에 처리하여 ROS를 소거하는 활성을 살펴보았다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	백두구는 어떠한 효능이 있는가?	백두구(白荳蔲)는 생강과 백두구의 열매를 말린 것으로 약의 성질은 맵고 따뜻(辛溫)하며, 비위(脾胃)에 습기를 제거(祛濕)하고 소화 및 복부창만, 구토, 딸꾹질 및 주독(酒毒)을 해독하는 작용이 알려져 있다10). 백두구 속에 함유되어 있는 대표적인 단일 성분으로 터펜(terpenes)류의 시네올(1,8-Cineole)이 지방간을 억제하는 효능과 항산화 활성을 통하여 다이옥신 등의 유독물로부터 간을 보호하는 효과 등이 보고되어 있다11,12).
	비알콜성 지방간이란 무엇인가?	비알콜성 지방간(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 술을 전혀 마시지 않거나 소량의 음주를 하더라도 간에 지방이 축적되는 질병으로 비만, 제 2형 당뇨, 이상 지질혈증 및 대사증후군 등과 밀접한 연관이 있다4,5). 비알콜성 지방간 및 관련 대사 질환을 치료하기 위하여 반드시 식이 요법이 동반되어야 한다는 주장이 설득력을 얻고 있으며, 보조적으로 비타민 E 군의 고용량 처방이 NAFLD를 개선한다는 보고가 있다6).
	중증의 비알콜성 지방간의 치료에 사용되는 약물은 무엇인가?	비알콜성 지방간 및 관련 대사 질환을 치료하기 위하여 반드시 식이 요법이 동반되어야 한다는 주장이 설득력을 얻고 있으며, 보조적으로 비타민 E 군의 고용량 처방이 NAFLD를 개선한다는 보고가 있다6). 중증의 NAFLD에는 메트포민(metformin)과 스타틴(statin) 및 오메가(omega)-3 등을 병용투여 할 수 있는 것으로 알려져 있으나 각각 약물의 부작용을 최소화 시키는 고려가 필요하다7-9).

참고문헌 (30)

Kumar A, Sharma A, Duseja A, Das A, Dhiman RK, Chawla YK, et al. Patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFDL) have higher oxidative stress in comparison to chronic viral hepatitis. J Clin Exp Hepatol. 2012;3:12-8.
Li S, Tan HY, Wang N, Zhang ZJ, Lao L, Wong CW, Feng Y. The role of oxidative stress and antioxidants in liver diseases. Int J Mol Sci. 2015;16:26087-124.

상세보기
Griffith CM, Schenker S. The role of nutritional therapy in alcoholic liver disease. Alcohol Res Health. 2006;29:296-306.

상세보기
Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC. McCullough AJ. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology. 1999;116:1413-9.

상세보기
Marchesini G, Brizi M, Morselli-Labate AM, Buqianesi E, McCullough AJ, Forlani G. Association of nonalcoholic fatty liver diseases with insulin resistance. Am J Med. 1999;107:450-5.

상세보기
Sato K, Gosho M, Yamamoto T, Kobayashi Y, Ishii N, Ohashi T, et al. Vitamin E has a beneficial effects on nonalcoholic fatty liver disease: a meta-analysis of randomized controlled trials. Nutrition. 2015;31:323-930.
Rouabhia S, Milic N, Abenavoli L. Metformin in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease: safety, efficacy and mechanism. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;8:343-9.

상세보기
Pastori D, Polimeni L, Baratta F, Pani A, Del Ben M, Anqelico F. The efficacy and safety of statins for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Dig Liver Dis. 2015;47:4-11.

상세보기
Di Minno MN, Russolilo A, Lupoli R, Ambrosino P, Di Minno A, Tarantino G. Omega-3 fatty acids for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2012;18:5839-47.

상세보기
Heo J. Translated Dongeuibogam. 1st ed. Seoul: Bubinmunwha; 1999.
Lee DH, Kang SS, Chang IM, Mar W. Detection of anti-inflammatory agents from natural products as inhibitors of cyclooxygenase I and II. Nat Prod Sci. 1997;3:19-28.
Murata S, Ogawa K, Matsuzaka T, Chiba M, Nakayama K, Iwasaki K, et al. 1,8-Cineole ameliorates steatosis of pten liver specific KO mice via Akt inactivation. Int J Mol Sci. 2015;16:12051-63.

상세보기
Viollet B, Foretz M, Guigas B, Horman S, Dentin R, Bertrand L, et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hapatic disorders. J Physiol. 2006;574:41-53.

상세보기
Smith BK, Marcinko K, Desjardins EM, Lally JS, Ford RJ, et al. Treatment of nonalcoholic fatty liver disease: role of AMPK. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2016;311:730-40.

상세보기
Kohijima M, Higuchi N, Kato M, Kotoh K, Yoshimoto T, Fujino T, et al. SREBP-1c, regulated by the insulin and AMPK signaling pathways, plays a role in nonalcoholic fatty liver disease. Int J Mol Med. 2008;21:507-11.
Thomson DM, Winder WW. AMP-activated protein kinase control of fat metabolism in skeletal muscle. Acta Physiol. 2009;196:147-54.

상세보기
Tolman KG, Dalpiaz AS. Treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Ther Clin Risk Manaq. 2007;3:1153-63.
Braunersreuther V, Viviani GL, Mach F, Montecucco F. Role of cytokines and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2012;18:727-35.

상세보기
Lim DW, Kim H, Park JY, Kim JE, Moon JY, Park SD, Park WH. Amomum cardamomum L. ethyl acetate fraction protects against carbon tetrachloride-induced liver injury via an antioxidant mechanism in rats. BMC Complement Altern Med. 2016;16:155.

상세보기
Lim DW, Bose S, Wang JH, Choi HS, Kim YM, Chin YW, et al. Mofied SJH alleviates FFAs-induced hapatic steatosis through leptin signaling pathways. Sci Rep. 2017;7:45425.

상세보기
Min KJ, Cho KH, Kwon TK. The effects of oxidized low density lipoprotein (oxLDL)-induced heme oxygenase-1 on LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophage cells. Cell Signal. 2012;24:1215-21.

상세보기
Bekkering S, Quintin J, Joosten LA, van der Meer JW, Netea MG, Riksen NP. Oxidized low-density lipoprotein induces long-term proinflammatory cytokine production and foam cell formation via epigenetic reprogramming of monocytes. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014;34:1731-8.

상세보기
Beltowski J. Statins and modulation of oxidative stress. Toxicol Mech Methods. 2005;15:61-92.

상세보기
Leamy AK, Eqnatchik RA, Young JD. Molecular mechanisms and the role of saturated fatty acids in the progression of non-alcoholic fatty liver disease. Prog Lipid Res. 2013;52:165-74.

상세보기
Boots AW, Haenen GR, Bast A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol. 2008;585:325-37.

상세보기
Sultana B, Anwar F. Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected fruits, vegetables and medicinal plants. Food Chem. 2008;108:879-84.

상세보기
Lee KG, Shibamoto T, Takeoka GR, Lee SE, Kim JH, Park BS. Inhibitory effects of plant-derived flavonoids and phenolic acids on malonaldehyde formation from ethyl arachidonate. J Agric Food Chem. 2003;51:7203-7.

상세보기
Horton JD, Goldstein JL, Brown MS. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. J Clin Invest. 2002;109:1125-31.

상세보기
Kim JE. Tribulus terrestris suppresses the lipopolys accharide-induced inflammatory reaction in RAW264.7 macrophages through heme oxygenase-1 expression. Korean J Oriental Physiology & Pathology. 2014;28:63-8.
Sikora JP, Chlebna-Sokol D, Krzyanska-Oberbek A. Proinflammatory cytokine (IL-6, IL-8), cytokine inhibitors (IL-6sR, STNFRII) and anti-inflammatory cytokines (IL-10, IL-13) in the pathogenesis of sepsis in newborns and infants. Arch Immunol Exp. 2001;49:399-404.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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