[논문]조피볼락(Sebastes schlegelii) Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8)의 분자유전학적 특성 및 발현 분석

양혜림; 권혁재; 이성도; 김명진; 이제희

doi:10.5657/kfas.2017.0302

조피볼락(Sebastes schlegelii) Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8)의 분자유전학적 특성 및 발현 분석
Molecular Characterization and Expression Analysis of Interferon Regulatory Factor 8 (IRF8) in the Black Rockfish Sebastes schlegelii 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.50 no.3, 2017년, pp.302 - 310

양혜림 (제주대학교 해양생명과학과) , 권혁재 (제주대학교 해양생명과학과) , 이성도 (제주대학교 해양생명과학과) , (제주대학교 해양생명과학과) , 김명진 (제주대학교 해양생명과학과) , 이제희 (제주대학교 해양생명과학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Interferon regulatory factor 8 (IRF8) is essential for the development of B and T cells, as well as for the activity of dendritic cells and macrophages. We performed molecular characterization of IRF8 from rock fish, Sebastes schlegelii (Ss), and investigated the spatial and temporal profile of mRNA expression after challenge with lipopolysaccharide (LPS), polyinosinic:polycytidylic acid (poly I:C), or Streptococcus iniae. The full-length cDNA sequence of SsIRF8 was 1,657 bp, containing an ORF of 1,266 bp. The gene had a predicted molecular mass of 47.7 kDa and an isoelectric point of 5.99. The amino acid sequence coded by this gene showed the highest degree of identity (90.8%) and similarity (96.2%) with IRF8 from Oplegnathus fasciatus. The SsIRF8 mRNA was expressed ubiquitously, at varying levels, with the highest level of expression observed in the spleen. To confirm the role of SsIRF8 in mediating the immune response, we measured SsIRF8 mRNA expression in the splenic tissue at different time points after injection with LPS, poly I:C, or S. iniae. The qRT-PCR results showed that SsIRF8 mRNA expression in the poly I:C-injected group was highly upregulated 6 hr after exposure (P<0.05). Expression of SsIRF8 mRNA in the S. iniae-injected group peaked at 24 hr. These results suggest that SsIRF8 might be important in regulating the strength of the rockfish immune response to immunostimulatory agents.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

, 2015) 등에서 유전자의 특징이 보고되었다. 본 연구에서는 in silico 분석을 통하여 조피볼락, IRF8의 분자적 특성을 확인하였으며, 면역반응에서의 역할을 규명하기 위하여 LPS, poly I:C, Streptococcus iniae 등의 면역자극을 준 후 유전자의 발현양상을 비교하였다.

제안 방법

, 2013). SsIRF8의 조직별 발현양상을 확인하기 위해 건강한 조피볼락으로부터 분리한 9개 조직(gill, heart, head kidney, spleen, liver, intestine, kidney, testis, ovary)과 분리한 PBCs의 cDNA를 사용하여 qPCR을 수행하였다. Elongation factor 1-α (EF1α)를 reference gene으로 하였으며 근육 조직을 기준으로 상대적인 비교를 하였다.

대상 데이터

조피볼락(200±20g)은 수온 22±1℃로 설정한 400 L 수조에서 일주일 동안 순치한 뒤 실험을 진행하였다. 여러 조직에서의 SsIRF8의 발현분포를 확인하기 위해 다섯 마리의 건강한 조피볼락을 무작위로 선별하여 샘플링을 진행하였다. 건강한 어체로부터 gill, heart, head kidney, spleen, liver, intestine, kidney, testis, ovary 총 9개의 조직을 분리하였으며 분리한 조직은 액체질소에 급속 냉각한 뒤 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

데이터처리

실험의 유의성을 살펴보기 위한 통계분석은 SPSS version 18 program (IBM, USA)의 one-way ANOVA 방법을 사용하였고, 모든 mRNA 상대 발현량은 평균(Mean)±표준편차(Standard deviation)로 나타내어 면역 자극에 따른 조피볼락 IRF8의 mRNA 상대 발현 정도를 통계분석 하였다. 모든 실험결과는 대조군 대비 통계적인 유의성을 나타내는 P<0.

이론/모형

이후, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm을 이용하여 SsIRF8의 전체 서열과 이미 밝혀진 IRF family member와 서열을 비교 분석하였다. IRF family에서 보존되는 domain과 motif를 알아보기 위해 proteins, motif scan Pfam hidden Markov models (Local models) (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, Swiss) (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)를 이용하여 아미노산 서열을 분석하였으며 다른 종에서 기원한 IRF8과 조피볼락에서 기원한 IRF8의 homolog를 비교하기 위해 Matgat software와 ClustalW2 server (EMBLEBI, UK) (http://www.Ebi.ac.uk/Tools/clustalw2)를 이용하여 pairwise sequence alignment와 multiple sequence alignment strategies를 수행하였다. 계통 분류 분석은 Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) software version 7.
2 software를 이용하여 아미노산으로 번역되는 부분인 open reading frame (ORF)을 예측하였다. 또한 아미노산 서열을 이용하여 단백질이 가지는 물리화학적인 특징을 알아보기 위해 Expert Protein Analysis System ProtParam tool(SIB Swiss Institute of Bioinformatics, Swiss) (http://web.expasy.org/protparam)을 이용하여 각 분자량과 등전점을 추정하였다. 이후, Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm을 이용하여 SsIRF8의 전체 서열과 이미 밝혀진 IRF family member와 서열을 비교 분석하였다.

성능/효과

예측한 아미노산 서열을 이용하여 다른 종에서 기원한 IRF8과 조피볼락에서 기원한 IRF8를 비교하였을 때, Oplegnathus fasciatus IRF8과 동일성과 유사성이 각각 96.2%, 90.8%로 가장 높았으며 Epinephelus coioides, Miichthys miiuy, Dicentrarchus labrax 종에서도 각각 95.5%, 95.3%, 95.7%의 높은 동일성을 보였다(Table 1). Phylogenetic tree를 통해 SsIRF8의 계통발생학적 분류를 비교하였다.
, 2006). 특히 poly I:C를 주사한 실험군의 경우, 다른 실험군에 비해 컨트롤 대비 발현량이 급격하게 증가하는 패턴을 보였다. 이는 poly I:C 복강 주사 후 pathogen associated molecular pattern (PAMP)이 인식하고(Perdiguero and Esteban, 2009; Hu et al.
qPCR 결과 다양한 조직에서 mRNA 발현량이 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다. 특히 근육 조직에 비해 비장에서 256배로 가장 높게 발현하였고 표피, 장, 아가미, 혈액세포, 두신, 신장에서도 높은 발현을 보이며, 간 조직에서는 상대적으로 낮게 발현하였다(Fig. 4). 이러한 발현 양상은 myeloid progenitor cell의 분화와 B세포, T세포의 발달에 관여하는 것으로 알려진 IRF8의 기능(Lu, 2008)과 관련하여 SsIRF8가 비장에서 가장 높게 발현하는 것으로 보여지며, 다른 lymphomyeloid-rich 조직인 장, 아가미, 혈액세포, 두신, 신장 조직에서도 많이 분포하는 것으로 사료된다(Hu et al.

후속연구

본 연구에서는 SsIRF8의 분자유전학적 특성을 비교 분석하여 건강한 조피볼락의 조직에서의 SsIRF8의 발현양상과 여러 병원성 스트레스를 가했을 때 비장조직으로부터의 SsIRF8의 발현의 차이를 비교 분석함으로써 조피볼락의 내재면역 기초 자료로 이용할 수 있을 것이며 이후 조피볼락의 IRF8이 myeloid와 lymphoid cell에 어떠한 영향을 주는지 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	IRF의 역할은?	Interferon regulatory factor (IRF) family는 바이러스에 대한 방어, 병원체에 대한 초기 면역반응, 세포의 성장과 세포자멸, 림프구의 발달 등 의 역할을 하며(Barnes et al., 2002 ), 현재까지 척추동물에서는 11개의 IRF family가 보고되어 있다(Huang et al.
	인터페론의 기능은?	IRF에 의해 인터페론(interferon, IFN)과interferon stimulated genes (ISGs)의 전사가 조절된다고 알려져 있으며(Nguyen et al., 1997), 인터페론은 사이토카인 중 하나로 척추동물의 생체 내에서 항 바이러스 반응, 면역조절 기능, 세포의 성장과 분화, 세포자살 등과 같은 중요한 기능을 하고 있다(Pfeffer et al., 1998).
	인터페론이 바이러스에 대처하는 방법은?	, 1998). 그리고 구조와 기능에 따라 Type I 과 Type II IFN으로 나뉘며(Inkpen et al., 2015), 바이러스에 감염되었을 때 Type I IFNs (IFNα 와 IFNβ)이 생성되어 Type I IFNs이 세포의 특이적 수용체와 결합하여 하위 유전자의 전사를 유도한다(Mamane et al., 1999; Taniguchi et al.

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표제어: PCR

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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