Objectives: This study was performed to evaluate the effect of Guibi-tang water extract (GB) on osteoporosis. Methods: We examined the effect of GB on osteoclast differentiation using murine pre-osteoclastic RAW 264.7 cells treated with receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Th...
Objectives: This study was performed to evaluate the effect of Guibi-tang water extract (GB) on osteoporosis. Methods: We examined the effect of GB on osteoclast differentiation using murine pre-osteoclastic RAW 264.7 cells treated with receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). The effect of GB on osteoclast was measured by counting TRAP (+) multinucleated cells and measuring TRAP activity. The mRNA expressions of osteoclastogenesis-related genes (Cathepsin K, MMP-9, TRAP, NFATc1, MITF, TNF-${\alpha}$, IL-6, COX-2) were measured by real-time PCR. We examined the effect of GB on osteoblast proliferation, ALP activity, bone matrix protein synthesis and collagen synthesis using murine calvarial cell. Results: GB decreased the number of TRAP (+) multinucleated cells and inhibited TRAP activity in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. GB decreased the expression of genes related osteoclastogenesis such as Cathepsin K, MMP-9, TRAP, NFATc1, MITF, COX-2 in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. But GB did not decrease the expression of iNOS and increased the expression of TNF-${\alpha}$, IL-6 in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. These genes (iNOS, TNF-${\alpha}$, IL-6) are thought to be related with the inflammatory bone destruction. GB increased cell proliferation of rat calvarial cell and also increased ALP activity in rat calvarial cell. GB did not increase bone matrix protein synthesis but increased collagen synthesis in rat calvarial cell. Conclusions: This study suggests that GB may be effective in treating osteoporosis by inhibiting osteoclast differentiation and its related gene expression and by increasing osteoblast proliferation.
Objectives: This study was performed to evaluate the effect of Guibi-tang water extract (GB) on osteoporosis. Methods: We examined the effect of GB on osteoclast differentiation using murine pre-osteoclastic RAW 264.7 cells treated with receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). The effect of GB on osteoclast was measured by counting TRAP (+) multinucleated cells and measuring TRAP activity. The mRNA expressions of osteoclastogenesis-related genes (Cathepsin K, MMP-9, TRAP, NFATc1, MITF, TNF-${\alpha}$, IL-6, COX-2) were measured by real-time PCR. We examined the effect of GB on osteoblast proliferation, ALP activity, bone matrix protein synthesis and collagen synthesis using murine calvarial cell. Results: GB decreased the number of TRAP (+) multinucleated cells and inhibited TRAP activity in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. GB decreased the expression of genes related osteoclastogenesis such as Cathepsin K, MMP-9, TRAP, NFATc1, MITF, COX-2 in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. But GB did not decrease the expression of iNOS and increased the expression of TNF-${\alpha}$, IL-6 in RANKL-stimulated RAW 264.7 cell. These genes (iNOS, TNF-${\alpha}$, IL-6) are thought to be related with the inflammatory bone destruction. GB increased cell proliferation of rat calvarial cell and also increased ALP activity in rat calvarial cell. GB did not increase bone matrix protein synthesis but increased collagen synthesis in rat calvarial cell. Conclusions: This study suggests that GB may be effective in treating osteoporosis by inhibiting osteoclast differentiation and its related gene expression and by increasing osteoblast proliferation.
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문제 정의
7 세포에 처리하여 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 생성능을 측정하고, 관련 유전자인 TRAP, Cathepsin K, MMP-9, MITF, NFATc1, iNOS, TNF-α, IL-6, COX-2의 발현을 측정하였다. 또한 골 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 rat의 두개골 세포에 歸脾湯 추출물을 처리하여 조골세포의 분열능, ALP 활성, 골기질 단백질과 collagen 합성에 미치는 영향을 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 益氣補血의 효능이 있으며, 상기의 연구 보고에 따라 골다공증에 유효할 것으로 추측되는 歸脾湯의 골다공증에 대한 구체적인 작용 기전을 밝히고자 본 연구를 시행하였다. 歸脾湯의 골 흡수 억제에 대한 효과를 알아보기 위하여 歸脾湯 추출물을 Receptor activator of nuclear factor kappa-B(RANKL)유도 RAW 264.
제안 방법
이에 저자는 益氣補血의 효능이 있으며, 상기의 연구 보고에 따라 골다공증에 유효할 것으로 추측되는 歸脾湯의 골다공증에 대한 구체적인 작용 기전을 밝히고자 본 연구를 시행하였다. 歸脾湯의 골 흡수 억제에 대한 효과를 알아보기 위하여 歸脾湯 추출물을 Receptor activator of nuclear factor kappa-B(RANKL)유도 RAW 264.7 세포에 처리하여 Tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 생성능을 측정하고, 관련 유전자인 TRAP, Cathepsin K, MMP-9, MITF, NFATc1, iNOS, TNF-α, IL-6, COX-2의 발현을 측정하였다. 또한 골 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 rat의 두개골 세포에 歸脾湯 추출물을 처리하여 조골세포의 분열능, ALP 활성, 골기질 단백질과 collagen 합성에 미치는 영향을 평가하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
歸脾湯이 파골세포의 분화와 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 GB를 처리한 RANKL 유도 RAW 264.7 세포의 TRAP(+) 세포 형성과 골 흡수 관련 인자들의 유전자 발현을 측정하였으며, rat의 두개골로부터 분리한 조골세포의 분열능 및 ALP 활성, 골 기질 단백질 합성, Collagen 합성을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
대상 데이터
동물은 출산 예정 2일 전인 체중 약 250 g 정도의 임신한 Sprague-Dawley(SD)系 rat를 대한바이오링크에서 공급받아 실험실에서 출산 때까지 사육하였다. 실험에 사용하는 조골세포를 얻기 위하여 생후 1일 된 rat의 두개골을 적출하고 세포를 분리하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 약물은 대전대학교 둔산한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다.
7 세포에 RANKL을 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하였다.
실험에 사용된 파골세포 전구세포는 mouse macrophage 세포주인 RAW 264.7 세포에 RANKL을 처리하여 유도된 세포 모델을 사용하였다. 사용된 RAW 264.
데이터처리
각 군과의 유의성 검증을 위하여 Student's t-test를 이용해 통계처리 하였고 p값이 0.01 및 0.05보다 작은 경우(p<0.01 및 p<0.05) 유의성이 있는 것으로 인정하였다.
이론/모형
Alkaline phosphatase(ALP) 활성은 ALP-K Kit를 이용하여 측정하였다. cell을 배양한 plate를 냉각한 PBS로 세척한 후 cell을 scraper로 긁어내어 5 mM dithiothreitol(DTT)이 함유된 PBS에 현탁하였다.
성능/효과
1. GB는 RANKL에 의해 분화되는 파골세포의 형성 지표인 TRAP(+) 다핵세포의 형성을 억제하였으며 분화된 파골세포에서 TRAP 활성을 억제하였다.
6. GB는 rat의 두개골 조골세포의 골 기질 단백질의 합성에는 영향을 미치지 못하였으나 collagen 합성을 증가시켰다.
실험 결과, GB는 파골세포의 분화와 활성을 억제하였으며 파골세포의 분화를 촉진시키는 Cathepsin K, MMP-9, TRAP, MITF, NFATc1 유전자의 발현을 억제함을 확인하였다. 그러나 COX-2를 제외한 그 외의 염증성 골 파괴를 유발하는 인자들인 iNOS, TNF-α, IL-6의 발현은 억제하지 못하여 염증 반응을 매개로 발생하는 골 소실에는 GB가 효과 없는 것으로 판단된다.
이상의 결과로 GB가 파골세포의 분화와 활성을 억제함을 알 수 있으며 이를 바탕으로 GB가 파골세포의 기능에 관여하는 유전자들의 발현에 미치는 영향을 측정하여 GB의 구체적인 작용 기전을 밝히고자 하였다.
후속연구
이상으로 보아 GB는 파골세포의 분화와 활성을 억제하고 파골세포 분화를 촉진시키는 인자들을 억제하였으며 조골세포의 활성을 촉진하여 향후 골다공증에 유효한 치료제로써 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
그러나 염증 환경을 유발하여 파골세포의 분화를 촉진하는 인자들에는 유효성을 나타내지 못하였는데 이는 GB가 골다공증의 虛證性 병리 기전에 더 유효함을 시사하며 補劑로써 GB의 한의학적 약리 기전을 명확히 보여준 결과로 사료된다. 향후 GB가 골 대사의 어느 기전에 가장 유효한 지에 대한 심화 연구가 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
골다공증은 무엇인가?
골다공증은 골량의 감소와 골의 미세구조 악화를 특징으로 하는 전신적인 골격계 질환으로 골강도의 감소로 인해 골절의 위험이 증가되는 상태이다1). 정상적인 상태에서 골 흡수가 일어난 뼈는 동량의 새로운 골 조직으로 대체되지만 30~45세 이후에는 골 흡수와 골 형성 과정에 불균형이 발생하여 골 흡수가 골 형성을 능가하게 된다.
과도한 골 소실이 발생하는 이유는 무엇인가?
정상적인 상태에서 골 흡수가 일어난 뼈는 동량의 새로운 골 조직으로 대체되지만 30~45세 이후에는 골 흡수와 골 형성 과정에 불균형이 발생하여 골 흡수가 골 형성을 능가하게 된다. 과도한 골 소실은 골 흡수 작용을 하는 파골세포의 활성도 증가나 골 형성에 관여하는 조골세포의 활성도 감소에 의해 발생될 수 있다2). 따라서 골다공증의 치료에 있어서 파골세포의 분화를 억제하거나 조골세포의 활성을 증가시키는 것이 중요할 것으로 사료된다.
GB가 파골세포에 미치는 영향 평가 중 독성 평가 시 어떠한 영향을 미치는 것으로 나타났는가?
GB의 세포 독성 유무를 확인하기 위하여 실험한 결과 GB는 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 1).
참고문헌 (33)
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