본 연구는 어성초의 메탄올 추출물을 이용하여 항산화 효능이 가장 좋은 fraction을 찾고, 항산화 효능을 나타내는 성분을 분석하였다. 메탄올 추출에 의한 유기 용매 별 분획에서 항산화 효과가 가장 좋은 ethyl acetate 분획물을 칼럼 크로마토그래피하여 12가지의 fraction 중 가장 높은 항산화 효과를 보인 Fr. 10을 이용하여 DPPH 라디칼의 소거활성, 환원력, 지질과산화, 세포독성, DNA 산화 및 DCFH-DA를 이용한 세포내 과산화수소 제거효과를 조사하였다. DPPH radical scavenging activity, reducing power, TBARS, cell viability, DNA oxidation and DCF fluorescence 12가지의 fraction들 중 항산화 효능이 가장 좋은 Fr. 10의 DPPH radical 소거 활성 결과로 $64{\mu}g/ml$ 농도에서 양성대조군에 근접하는 60%의 억제능을 보였다. Reducing power 결과로 $32{\mu}g/ml$의 농도에서 140%로 양성대조군과 비슷한 결과 값을 보였다. TBARS 결과로 $2{\mu}g/ml$에서 양성대조군과 같은 값의 활성산소 억제능이 나타난다. 또한 cell viability 결과로 $32{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 세포 독성에 의해 생존율이 감소하였고, DCF fluorescence 결과로 농도의존적으로 $H_2O_2$에 의한 산화적 손상을 억제하는 것으로 나타났다. DNA oxidation 실험결과 $1{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 DNA의 손상을 감소시킴을 확인할 수 있었다. IR 및 LC-MS를 이용하여 Fr. 10의 유효성분을 조사한 결과 rutin (분자량, 610)으로 확인 되었다. 결론적으로 어성초의 메탄올 추출물로부터 분리한 Fr. 10은 농도 의존적으로 항산화 효능이 우수하게 나타났고, 어성초는 화장품 및 기능성 식품의 소재로 활용될 수 있음을 시사한다.
본 연구는 어성초의 메탄올 추출물을 이용하여 항산화 효능이 가장 좋은 fraction을 찾고, 항산화 효능을 나타내는 성분을 분석하였다. 메탄올 추출에 의한 유기 용매 별 분획에서 항산화 효과가 가장 좋은 ethyl acetate 분획물을 칼럼 크로마토그래피하여 12가지의 fraction 중 가장 높은 항산화 효과를 보인 Fr. 10을 이용하여 DPPH 라디칼의 소거활성, 환원력, 지질과산화, 세포독성, DNA 산화 및 DCFH-DA를 이용한 세포내 과산화수소 제거효과를 조사하였다. DPPH radical scavenging activity, reducing power, TBARS, cell viability, DNA oxidation and DCF fluorescence 12가지의 fraction들 중 항산화 효능이 가장 좋은 Fr. 10의 DPPH radical 소거 활성 결과로 $64{\mu}g/ml$ 농도에서 양성대조군에 근접하는 60%의 억제능을 보였다. Reducing power 결과로 $32{\mu}g/ml$의 농도에서 140%로 양성대조군과 비슷한 결과 값을 보였다. TBARS 결과로 $2{\mu}g/ml$에서 양성대조군과 같은 값의 활성산소 억제능이 나타난다. 또한 cell viability 결과로 $32{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 세포 독성에 의해 생존율이 감소하였고, DCF fluorescence 결과로 농도의존적으로 $H_2O_2$에 의한 산화적 손상을 억제하는 것으로 나타났다. DNA oxidation 실험결과 $1{\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 DNA의 손상을 감소시킴을 확인할 수 있었다. IR 및 LC-MS를 이용하여 Fr. 10의 유효성분을 조사한 결과 rutin (분자량, 610)으로 확인 되었다. 결론적으로 어성초의 메탄올 추출물로부터 분리한 Fr. 10은 농도 의존적으로 항산화 효능이 우수하게 나타났고, 어성초는 화장품 및 기능성 식품의 소재로 활용될 수 있음을 시사한다.
This study was carried out to evaluate the antioxidant effect of methanolic extract of Houttuynia cordata (HCME) and to identify a compound having antioxidant effect. The ethyl acetate fraction of HCME showed the highest antioxidant effect in organic solvent fractions. The fraction was then separate...
This study was carried out to evaluate the antioxidant effect of methanolic extract of Houttuynia cordata (HCME) and to identify a compound having antioxidant effect. The ethyl acetate fraction of HCME showed the highest antioxidant effect in organic solvent fractions. The fraction was then separated into 12 fractions by open column chromatography. Among these fractions, the fraction 10 (Fr. 10) with the highest antioxidant activity was isolated, and its antioxidant effect was evaluated by DPPH radical scavenging activity, reducing power, TBARS, cell viability, DNA oxidation and DCF fluorescence. The Fr. 10 at a $64{\mu}g/ml$ showed 60% of inhibitory effect similar to that of vitamin C at $10{\mu}g/ml$, compared with blank group. The Fr. 10 at $64{\mu}g/ml$ showed 264% of reducing power, compared with blank group. TBARS assay showed that the Fr. 10 at $64{\mu}g/ml$ had 35.5% of inhibitory effect similar to that of vitamin E at $1,000{\mu}g/ml$, compared with blank group. The Fr. 10 above $32{\mu}g/ml$ displayed cytotoxicity. However, it was observed that the Fr. 10, above $1{\mu}g/ml$ reduced DNA damage. DCF fluorescence assay showed that the Fr. 10 inhibited oxidative stress by $H_2O_2$ in a dose dependent manner. The compound of Fr. 10 was identified to be rutin whose molecular weight is 610 by the IR and LC-MS analyses. Therefore, these results suggest that the rutin of Fr. 10 could use as a natural antioxidant for development of cosmetics and functional foods.
This study was carried out to evaluate the antioxidant effect of methanolic extract of Houttuynia cordata (HCME) and to identify a compound having antioxidant effect. The ethyl acetate fraction of HCME showed the highest antioxidant effect in organic solvent fractions. The fraction was then separated into 12 fractions by open column chromatography. Among these fractions, the fraction 10 (Fr. 10) with the highest antioxidant activity was isolated, and its antioxidant effect was evaluated by DPPH radical scavenging activity, reducing power, TBARS, cell viability, DNA oxidation and DCF fluorescence. The Fr. 10 at a $64{\mu}g/ml$ showed 60% of inhibitory effect similar to that of vitamin C at $10{\mu}g/ml$, compared with blank group. The Fr. 10 at $64{\mu}g/ml$ showed 264% of reducing power, compared with blank group. TBARS assay showed that the Fr. 10 at $64{\mu}g/ml$ had 35.5% of inhibitory effect similar to that of vitamin E at $1,000{\mu}g/ml$, compared with blank group. The Fr. 10 above $32{\mu}g/ml$ displayed cytotoxicity. However, it was observed that the Fr. 10, above $1{\mu}g/ml$ reduced DNA damage. DCF fluorescence assay showed that the Fr. 10 inhibited oxidative stress by $H_2O_2$ in a dose dependent manner. The compound of Fr. 10 was identified to be rutin whose molecular weight is 610 by the IR and LC-MS analyses. Therefore, these results suggest that the rutin of Fr. 10 could use as a natural antioxidant for development of cosmetics and functional foods.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 어성초를 메탄올 추출하여 Fr. 10의 ROS에 대한 억제효과와 이러한 효과를 일으키는 생리활성물질에 관한 연구를 하였다. HCME에 대한 각각의 유기 용매 별 분획물들의 항산화력을 비교한 결과로 ethyl acetate 분획물과 butanol 분획물의 결과 값이 비슷한 양상을 보였다.
Fr. 10이 H₂O₂를 얼마나 소거하는지를 확인해 보았다. Fig.
제안 방법
10,0.75 mM FeSO4와 0.25 mM H2O2 28 μl, B16F1세포의 DNA 5 μl를 첨가 하였다.
fraction 중 가장 높은 항산화 효과를 보인 Fr. 10을 이용하여 자유라디칼의 소거 정도 분석, ROS 제거 정도 분석, 활성산소 억제능 분석, DNA손상에 대한 항산화 효과, DCFH-DA 보호능력 효과를 수행하였다. Fr.
Fr. 10의 DNA손상에 대한 항산화 효과를 조사하기 위해 B16F1 세포로부터 DNA를 분리 하여 fenton reaction에 의하여 생성된 hydroxyl radical에 노출 시켰다. Fig.
Reducing power를 통해 Fr. 10의 ROS 제거 정도를 조사하였다. Fig.
Fr. 10의 정성분석을 위해 액체 크로마토그래피 질량분석기(LC-MS)는 이온의 진행방향에 대한 변화를 이용해 Liquid Chromatography (LC)에서 분석된 시료를 연속해서 Mass Spectrometer (MS)로 보내어 각 peak의 물질에 대해 분석하였다. 이동상으로 acetonitrile과 1% formic 그리고 D.
Fr. 10의 항산화력을 나타내는 생리활성물질의 성분 분석을 위하여 FT-IR과 LC-MS를 이용하였다. IR을 이용한 성분 분석 결과 rutin이라는 물질을 발견했으며, LC-MS를 이용하여 분자량 610인 물질을 확인하였다.
Fr. 10의 활성산소 억제능을 조사하기 위하여 TBARS 시험을 수행하였다. Fig.
HCME 의 항산화력을 나타내는 생리활성물질이 hexane 분획물에 비해 상대적으로 더 극성을 띄고 단일성분으로 볼 수 없다고 간주된다. ethyl acetate 분획물과 butanol 분획물 중 더 뛰어난 항산화력을 나타낸 ethyl acetate 분획물로 칼럼 크로마토그래피를 통해 fraction을 나누어 각각의 항산화력을 비교하였다. 총 12개의 fraction 중 Fr.
그리하여 본 연구는 어성초의 메탄올 추출(Methanolic extract of Houttuynia cordata, HCME)에 의한 유기용매 별 분획 및 칼럼 크로마토그래피를 하여 각각의 분획물들을 자유라디칼의 소거 정도 분석, ROS 제거 정도 분석, 활성산소 억제능분석을 통해 항산화 효과를 확인하고, DNA 산화억제에 대한 항산화 효과 분석, DCFH-DA 보호능력 효과 분석을 수행하여 살아있는 세포실험을 통해 기존의 보고된 연구들과의 차별성을 두어 항산화 효과를 나타내는 분획물의 성분을 분석하고 확인하였다
1 l의 여과 액을 감압농축하였다. 농축된 어성초 메탄올 추출물을 각각의 유기 용매 별 분획물들의 항산화력을 비교한 결과, 뛰어난 항산화력을 나타낸 ethyl acetate 분획물로 크로마토그래피를 통해 fraction을 나누어 각각의 항산화력을 비교하였다. 총 12개의 fraction 중 양성대조군에 비해 가장 높은 항산화 효과를 보인 Fr.
세포독성의 농도를 조사하기 위해 24시간 후에 MTT assay를 수행하였다. 시료의 세포독성을 측정한 결과, Fig.
양성 대조군으로는 vit C 10 μg/ml를 사용하여 비교하여 측정하였다.
양성대조군으로는 vit E 1,000 μg/ml를 사용하여 비교하여 측정하였다.
10의 정성분석을 위해 액체 크로마토그래피 질량분석기(LC-MS)는 이온의 진행방향에 대한 변화를 이용해 Liquid Chromatography (LC)에서 분석된 시료를 연속해서 Mass Spectrometer (MS)로 보내어 각 peak의 물질에 대해 분석하였다. 이동상으로 acetonitrile과 1% formic 그리고 D.W를 사용하였고, instrument conditions으로 column temperature 30℃, flow rate 1.000 ml/min, Pressure 441.7 bar, MSD instrument conditions으로 quad temperature 100℃, gas temperature 300℃, drying gas 13 l/min의 조건에서 7분간 측정하였다.
이 DCF가 형광을 띄게 된다. 이를 한 시간마다 excitation: 488 nm, emission: 530 nm 조건으로 측정한 후 MTT처리하였다.
전기영동 한 것을 LAS3000®image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo,Japan)를 이용하여 관찰하였다.
최종 volume 500 μl에서 농도가 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 μg/ml가 되도록 하였고, 각 시료를 시험농도로 처리하고 잘 혼합한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
항산화제로 잘 알려진 vit C 100 μg/ml를 양성대조군으로 사용하여 비교하여 측정하였다.
대상 데이터
항산화 효과가 가장 좋은 Fr. 10의 성분분석을 위해 IR과 LC-MS를 이용하였다. Fig.
Hansen [13]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 Fr. 10의 세포독성을 MTT(3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenylterrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
10의 정성분석을 위해 IR(Fourier Transform Infrared spectroscopy, FT-IR Spectrometer)은 Thermo Scientific(Waltham, MA,USA) 제품을 사용하였고 정성분석을 위해 LC-MS(Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, LC-MS)는isocratic pump(G1310), quaternary pump (G1311)와 UV-vis detector (G1314), 칼럼은 SB-C18 column(1.8 μm × 2.1 × 50 mm)로 구성된 Agilent(Santa Clara, CA, USA)의 제품을 사용하였다.
세포배양을 위한Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), TrypsinEDTA, penicillin (10,000 U/ml) / strepto-mycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland, UK)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로 부터 구입 하였다. MTT reagent,agarose와 기타시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co.
B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로 부터 구입 하였다. MTT reagent,agarose와 기타시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis,MO, USA)로 부터 구입하였다. Fr.
본 실험에 사용된 어성초(Houttuynia cordata)는 진주에 위치한 남윤식품에서 제공되었으며, 건조시킨 후 실온 보관 하여 실험에 사용되었다. 추출 및 분획 용매로 methanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol을 사용하였다.
본 실험에 사용된 어성초(Houttuynia cordata)는 진주에 위치한 남윤식품에서 제공되었으며, 건조시킨 후 실온 보관 하여 실험에 사용되었다. 추출 및 분획 용매로 methanol, n-hexane, ethyl acetate, n-butanol을 사용하였다. 세포배양을 위한Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), TrypsinEDTA, penicillin (10,000 U/ml) / strepto-mycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland, UK)로 부터 구입하였다.
데이터처리
Level of significance was identified statistically using Student's t test.
각 시료농도 군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 student’stest 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Fr. 10의 정성분석을 위해 적외선분광기(FT-IR Spectrometer)는 분자에 적외선을 조사하여 진동과 회전에 대응하는 같은 크기의 에너지가 흡수될 때 분자 spectrum을 이용하여 고체표면의 흡착물질을 감쇠 전반사(attenuated total reflection,ATR)측정법으로 분석하였다.
Genomic DNA는 약간 변형된 표준과정에 따라 B16F1세포로부터 추출 하였다[37]. Fenton반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA산화는 기존의 실험방법에 따라 수행하였다[30]. 먼저 4 μl의 DNA 용액에 시험농도의 Fr.
성능/효과
Fr. 10의 농도가 증가할수록 세포 내 과산화 수소를 억제하는 효과가 뛰어난 것을 확인 할 수 있었다.
10이 1 μg/ml 이상의 농도에서 DNA 분해가 억제되어 hydroxyl radical에 의한 DNA의 손상을 감소시킴을 확인할 수 있었다.
10의 항산화력을 나타내는 생리활성물질의 성분 분석을 위하여 FT-IR과 LC-MS를 이용하였다. IR을 이용한 성분 분석 결과 rutin이라는 물질을 발견했으며, LC-MS를 이용하여 분자량 610인 물질을 확인하였다. rutin의 분자량이 610인 것으로 보아 Fr.
10, 11, 12는 ethyl acetate와 methanol의 10:1 비율이다. 따라서 항산화력을 나타내는 생리활성물질이 전개용매 hexane에 비해 상대적으로 더 극성을 띈다고 재차 확인할 수 있었다. fraction 중 가장 높은 항산화 효과를 보인 Fr.
양성대조군으로 사용된 vit C (100 μg/ml)이 75%의 억제능을 보였으며, 64 μg/ml 농도에서 양성대조군에 근접하는 60%의 억제능을 보였다.
양성대조군은 138%의 환원력을 보였고, 32 μg/ml 의 농도에서 140%로 양성대조군과 비슷한 결과 값을 보였고, 64 μg/ml 의 농도에서는 264%로 양성대조군보다 뛰어난 환원력을 보였다.
후속연구
rutin은 뛰어난 자유라디칼 소거능력과 세포 보호 효과 등이 있다고 보고되어 지고 있으며[34, 38], 출혈을 예방하는 작용이 있어 출혈성 질병예방에 효과가 있고 항암 항균 물질의 비타민 P라는 것을 확인할 수 있었다[9, 15, 18]. 그러므로 HCME의 rutin 성분을 이용하여 ROS를 억제할 수 있고 뿐만 아니라 각종 화장품 및 기능성 식품 소재로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
reactive oxygen species의 과잉생산은 무엇을 변형시키는가?
인체는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 정상적인 세포기능의 일부로서 생성한다[12]. 그러나 내부적 요인과 외부적 요인으로 발생하는 ROS의 과잉생산은 산화적 손상을 유발시켜 모든 세포 성분의 구조를 변형시킨다. 이러한 ROS는 세포의 노화와 퇴행을 초래하여 각종 질병의 원인으로 밝혀지고 있다[19, 35, 41].
활성산소는 인체가 어떻게 생성하는가?
인체는 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 정상적인 세포기능의 일부로서 생성한다[12]. 그러나 내부적 요인과 외부적 요인으로 발생하는 ROS의 과잉생산은 산화적 손상을 유발시켜 모든 세포 성분의 구조를 변형시킨다.
ROS를 소거하는 대표적인 항산화제는 무엇인가?
각종 질병들의 원인이 될 수 있는 ROS의 문제점에 대한 해결책으로 항산화제 등과 같은 약재를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다[3, 22, 33]. 산화적 손상을 억제시키고 ROS를 소거하는 대표적인 항산화제로는 vitamin C (vit C), vitamin E (vit E), β-carotin 그리고 selenium 등이 있다. 그 외에도 합성 항산화제로 butylated hydroxyl anisole (BHA)와 butylated hydroxyl toluene (BHT)가 주로 사용되고 있다.
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