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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성의 효능을 지닌 우엉뿌리를 이용한 식초의 제조가능성을 검토하기 위하여 반응표면분석법을 통하여 우엉식초의 발효조건에 대하여 모니터링하고 최적화하였다. 또한, 우엉식초의 이용성과 효능 연구를 위하여 제조된 우엉 발효식초의 유효성분을 확인하였다.
- 본 연구에서는 우엉을 이용한 식초의 제조 가능성을 검토하였으며, 반응표면분석법을 통하여 우엉식초의 발효조건에 대한 영향을 모니터링하여 발효조건을 최적화하였다. 그리고 제조된 우엉 발효식초의 기능성 성분과 유효성분을 확인하였다.
제안 방법
- 각 성분의 반응표면을 superimposing 하여 예측된 최적 발효조건(발효온도 30°C, 발효시간 16일)에서 실제 발효 및 실험을 수행하여 예측치와 실제 실험치의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다(Table 13).
- )를 독립변수로 설정하고, 반응표면분석(repose surface methodology, RSM)(33)에 의하여 설정한 13가지의 발효조건으로 우엉식초를 발효하였다. 각 종속변수에 대한 회귀 방정식을 얻어 발효조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 발효조건을 구하였다. 발효조건의 회귀식에 의한 예측은 Statistical Analysis System(SAS) program(34)을 사용하였다.
- 6에 나타내었다. 각 항목의 최적 발효조건으로 도출된 최대 또는 최적값의 반응표면을 한 도면에 합한 결과 total sugar, chlorogenic acid,arctiin 및 acetic acid 함량 등 5항목의 반응표면의 그림이 완전 또는 부분적으로 적합하였고 그 일치하는 부분을 각독립변수의 범위를 읽어 최적 추출조건의 범위로 설정하였다. 이 반응표면으로부터 설정될 수 있는 최적 조건 범위는 Fig.
- 본 연구에서는 우엉을 이용한 식초의 제조 가능성을 검토하였으며, 반응표면분석법을 통하여 우엉식초의 발효조건에 대한 영향을 모니터링하여 발효조건을 최적화하였다. 그리고 제조된 우엉 발효식초의 기능성 성분과 유효성분을 확인하였다. 식초 제조를 위해 우엉 추출액에 사과 농축액을 15%첨가하여 알코올 발효시킨 결과, 5일 후 6.
- 따라서 본 연구에서는 다양한 생리활성의 효능을 지닌 우엉뿌리를 이용한 식초의 제조가능성을 검토하기 위하여 반응표면분석법을 통하여 우엉식초의 발효조건에 대하여 모니터링하고 최적화하였다. 또한, 우엉식초의 이용성과 효능 연구를 위하여 제조된 우엉 발효식초의 유효성분을 확인하였다.
- 사과 농축액을 농도별로 첨가하여 알코올 발효후 초산 발효를 행한 결과 초산 발효 전보다 발효 후 산도는증가하였고 pH는 발효 전보다 감소하는 것으로 나타나 초산 발효가 일어남을 알 수 있었다(Table 2). 사과 농축액 15%를 첨가한 우엉 추출물의 알코올 함량이 6.4%였고 초산 발효 후 산도 4.45%로 식초 제품 규격 산도 4% 이상에 도달하는 것으로 나타나, 이후 실험에서는 사과 농축액 15%를 첨가 후 알코올 발효와 초산 발효실험을 진행하였다. Seo 등(38)은 농축 사과주스를 이용한 식초 발효 연구에서 72°brix 사과 농축액을 이용하여 15°brix로 조절한 배양액을 6일간 100 rpm으로 발효하였을 때 알코올 함량이 7.
- 시료를 0.45 μm membrane filter로 여과하여 HPLC로 분석하였다.
- 식초 발효액 중의 acetic acid 함량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료를 0.
- 실험원료 우엉은 수세한 후 일정한 두께(0.5 cm)로 세절하여 건조기(OF22GW, Jeio Tech Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 50°C, 22시간 동안 건조처리를 한 우엉을 볶음기(JIS e04, Jeil-Tech Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 220°C에서 3분간 볶음처리하고 볶음이 완료되면 즉시 실온에서 냉각하여 전처리하였다.
- 알코올 발효를 위하여 Saccharomyces cerevisiae KSHY141029를 YM 액체배지(Merck Co., Darmstadt, Germany)에 접종하여 30°C에서 48시간 배양하여 알코올 발효전배양액으로 사용하였으며, 초산 발효는 초산균 배양배지(D-glucose 1%, glycerol 1%, polypeptone 0.2%, yeast extract 0.2 %, potato extract 10 mg%, acetic acid 1%, ethanol 4%, pH 4.0)에 Acetobacter tropicalis DUIS1701을 접종하여 30°C에서 200 rpm으로 120시간 진탕 배양(LSl-5149R, Daihan Labtech Co., Ltd., Namyangju, Korea)하여 초산 발효 전배양액으로 사용하였다.
- 우엉 추출물, 알코올 및 초산 발효액 시료의 pH는 pH meter(Mettler-Toledo AG 8603, Schwerzenbach, Switzerland)를 사용하여 측정하였으며, 적정산도는 시료를 0.1N NaOH로 pH 8.3으로 적정한 후, 적정에 소비되는 0.1N NaOH 용액의 소비량을 초산 함량으로 환산하여 총산 함량(%, v/v)으로 표시하였다.
- 우엉 추출물, 알코올 및 초산 발효액의 arctiin, arctigenin 및 chlorogenic acid(Sigma-Aldrich Co.)의 함량 분석을 위해 시료를 0.45 μm membrane filter로 여과하여HPLC(2695 Alliance HPLC, Waters, Milford, MA, USA)로 분석하였다.
- 우엉 추출물에 당원으로서 부원료의 첨가 효과를 검토하기 위하여 사과 농축액(65°Brix, Sanjung Food, Eumseong, Korea)을 농도별로 우엉 추출물에 첨가한 것을 90°C에서 30분간 멸균시킨 후, 효모 전배양액 3%(v/v)를 접종하여 30°C에서 5일간 정치 배양시키면서 알코올 발효 중의 당도, 알코올 함량 등을 측정하여 발효 경과를 비교하였다.
- 우엉 추출물의 초산 발효 최적화를 위하여 초산 발효액의 중요한 품질인자로 고려되는 초산 생성량을 최대로, pH를 최저로 설정하여 반응표면을 superimposing 하여 최적 추출조건 범위를 예측하였다. 또한, 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여 회귀식에 대입한 후 그 예측된 값들에 대하여 동일조건에서 실제 실험을 통하여 얻은 실험치를 비교하고 SAS program(34)의 Student’s t-test로서 P<0.
- 우엉식초 발효를 위하여 알코올 발효용 효모 및 초산균은 각종 과실 및 발효식품에서 순수 분리한 후, 우엉 추출물이 함유된 배양배지에서 순양하여 알코올 발효력이 뛰어난 효모 및 초산 생성능이 뛰어난 초산균을 최종 선별하였고, 이후 동정하여 균주보존기관에 기탁된 Saccharomyces cerevisiae KSH-Y141029(기탁번호 KCTC 12702BP) 및 Acetobacter tropicalis DUIS-1701(기탁번호 13181BP)을 사용하였다.
- 원료 및 발효물의 당도는 digital refractometer(PR101, ATAGO Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 알코올 함량은 배양액을 원심분리기(VS-24SMTi, Vision Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 7,989×g로 원심분리 한후, 그 상등액을 증류하여 15°C에서 주정계(211-DK-12, Daekwang, Seoul, Korea)로 측정하여 Gay Lussac 표에 대비하여 산출하였다(31).
- 4%의 알코올이 생성되었다. 초산 발효조건을 확립하기 위해 중심합성계획법에 따라 발효시간, 발효온도를 독립변수로 하여 실험을 계획하였고, 발효액의 특성을 반응변수로 하여 실험한 후발효조건을 최적화하였다. 17일간의 초산 발효 후 13개 실험구의 acetic acid 함량은 3.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 우엉은 경북 안동에서 재배되어 2015년 9월에 채취한 우엉을 농업회사법인 (주)들산초(Gyeongsan, Korea)로부터 제공받아 5°C에서 냉장 저장하여 사용하였다.
- 모든 표준물질은 Sigma-Aldrich Co. 제품으로 사용하였다(37).
- 칼럼은 X-bridge C18(150×4.6 mm, 3.5 μm, Waters)을 사용하였으며, 이동상으로는 acetonitrile(A)과 0.1% phosphoric acid(B)를 사용하였다.
데이터처리
- 또한, 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여 회귀식에 대입한 후 그 예측된 값들에 대하여 동일조건에서 실제 실험을 통하여 얻은 실험치를 비교하고 SAS program(34)의 Student’s t-test로서 P<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- 각 종속변수에 대한 회귀 방정식을 얻어 발효조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 발효조건을 구하였다. 발효조건의 회귀식에 의한 예측은 Statistical Analysis System(SAS) program(34)을 사용하였다. 중심합성계획에서 독립변수(Xn)는 발효시간(5~17 day, X1) 및 발효온도(26~34°C, X1)이며 실험계획은 -2, -1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화하여 실험값을 나타내었다.
이론/모형
- 사과 농축액을 첨가한 우엉 추출물의 알코올 발효 후, 식초 발효를 위하여 중심합성 계획법(central composite design)(32)에 따라 Table 1과 같은 발효시간(X1)과 발효온도(X2)를 독립변수로 설정하고, 반응표면분석(repose surface methodology, RSM)(33)에 의하여 설정한 13가지의 발효조건으로 우엉식초를 발효하였다. 각 종속변수에 대한 회귀 방정식을 얻어 발효조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 발효조건을 구하였다.
- 우엉 추출물, 알코올 및 초산 발효액의 총당 함량은 phenol-sulfuric acid법(35)으로 측정하였다. 즉 시료용액 1mL에 5%(v/v) 페놀용액 1 mL와 95% 황산 5 mL를 가하여 발열시킨 후 30분 동안 상온에서 방치하였으며, 분광광도계(UVmini-1240, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 초산 발효조건을 확립하기 위해 중심합성계획법에 따라 발효시간, 발효온도를 독립변수로 하여 실험을 계획하였고, 발효액의 특성을 반응변수로 하여 실험한 후발효조건을 최적화하였다. 17일간의 초산 발효 후 13개 실험구의 acetic acid 함량은 3.85~4.73%였으며, R2값은 0.9850으로 1% 이내 유의수준에서 유의성이 인정되었다. Arctiin함량의 범위는 0.
- 50 mg/100 mL의 범위로 나타났으며(Table 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 Table 9와 같다. Arctiin 함량의 R2값은 0.8380으로 회귀방정식에 대한 적합성이 높았으며, P-value는 5% 이내 유의수준을 보였으나 회귀식 매개변수(parameter)들의 유의수준은 10% 이상으로 나타났다(Table 9). 발효조건에 대한 영향은 발효온도보다 발효시간이 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다(Table 10).
- 각 성분의 반응표면을 superimposing 하여 예측된 최적 발효조건(발효온도 30°C, 발효시간 16일)에서 실제 발효 및 실험을 수행하여 예측치와 실제 실험치의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다(Table 13). 그 결과, 최적 발효조건에서의 arctiin 함량값은 예측된 조건에서의 값보다 실측된 값에서 그 함량이 높게 나타났고, 총당 함량과 chlorogenic acid 함량값은 실측값이 예측보다 다소 낮은 값을 나타내었다. 그 외의 측정된 함량값은 예측값과 실제 실험치를 비교하였을 때 대부분 유사한 수준으로 나타나 본 실험의 최적 발효조건 모델의 적합도가 적절하였으나 예측치와 실험치 간의 유의성(P<0.
- 그 외의 측정된 함량값은 예측값과 실제 실험치를 비교하였을 때 대부분 유사한 수준으로 나타나 본 실험의 최적 발효조건 모델의 적합도가 적절하였으나 예측치와 실험치 간의 유의성(P<0.05)은 떨어지는 것으로 나타났다.
- 9850으로 회귀방정식에 대한 적합도가 높았으며, P-value는 1% 이내 유의 수준을 보였다. 발효온도와 발효시간 모두 acetic acid 함량에 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었고(Table 5), acetic acid 함량값을 위한 발효조건 model에 대한 lack of fit의 P-value는 0.402로 나타나 model이 적합한 것으로 나타났다(Table 6). 발효조건에 따라 반응표면 모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났다.
- 8563으로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 5% 이내 유의수준을 보였다. 발효조건에 대한 영향에서 산도의 경우 발효온도보다 발효시간이 큰 영향을 미치는 것으로 확인된다(Table 5). Lee 등(39)은 감자식초의 발효에서 총산에 대한 초산 발효조건의 영향은 발효시간이 주로 영향을 미치고 있었다는 보고와 본 결과가 유사하였다.
- 8380으로 회귀방정식에 대한 적합성이 높았으며, P-value는 5% 이내 유의수준을 보였으나 회귀식 매개변수(parameter)들의 유의수준은 10% 이상으로 나타났다(Table 9). 발효조건에 대한 영향은 발효온도보다 발효시간이 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다(Table 10). 우엉식초의 arctiin 함량값 model에 대한 lack of fit의P-value는 0.
- 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 산도의 최대값은 5.23%이고 이때의 발효조건은 27.22°C, 15.31일로 나타났다(Table 7).
- 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 총당의 최대값은 1,342.13 mg/100 mL이며, 이때의 발효조건은 32.36°C, 15.84일로 나타났다(Table 7).
- 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점이 아닌 안장점으로 나타나 능선분석으로 하여 최대점을 산출한 결과, arctiin 함량의 최대값은 0.51 mg/100 mL이며, 이때의 발효조건은 32.33°C, 15.88일로 나타났다(Table 12).
- 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점이 아닌 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최대점을 산출한 결과 chlorogenic acid 함량의 최댓값은 12.14 mg/100 mL며, 이때의 발효조건은 26.57°C, 14.08일로 나타났다(Table 12).
- 따라서 우엉 추출물에 당원으로써 발효력과 맛 등을 고려하여 사과 농축액을 농도별로 첨가하여 알코올 발효를 시행한 결과는 Table 2와 같다. 사과 농축액 10%를 첨가하였을 때 알코올 함량이 4.6%였고, 첨가량이 많아질수록 알코올 함량이 높아지다가 25% 첨가하였을 때 알코올 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 효모 생균수는 사과 농축액 첨가량이 많아질수록 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 효모 생균수는 사과 농축액 첨가량이 많아질수록 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다. 사과 농축액을 농도별로 첨가하여 알코올 발효후 초산 발효를 행한 결과 초산 발효 전보다 발효 후 산도는증가하였고 pH는 발효 전보다 감소하는 것으로 나타나 초산 발효가 일어남을 알 수 있었다(Table 2). 사과 농축액 15%를 첨가한 우엉 추출물의 알코올 함량이 6.
- 그리고 제조된 우엉 발효식초의 기능성 성분과 유효성분을 확인하였다. 식초 제조를 위해 우엉 추출액에 사과 농축액을 15%첨가하여 알코올 발효시킨 결과, 5일 후 6.4%의 알코올이 생성되었다. 초산 발효조건을 확립하기 위해 중심합성계획법에 따라 발효시간, 발효온도를 독립변수로 하여 실험을 계획하였고, 발효액의 특성을 반응변수로 하여 실험한 후발효조건을 최적화하였다.
- 최적점을 산출한 결과 acetic acid의 최대값은 4.75%이며, 이때의 발효조건은 31.22°C, 16.72일로 나타났다(Table 7).
- 4와 같다. 한편 우엉의 지표성분인 arctiin의 aglycon 형태의 분해물로 알려진 arctigenin은 본 발효식초 과정에서는 함량값이 측정되지 않아 본 식초 발효과정에서는 분해에 관여하지 않는 것으로 나타났다. Liu 등(43)은 우엉 잎에서 약 3 mg/100 g의 arctiin 함량이 분석되었다고 보고하였다.
- 6%였고, 첨가량이 많아질수록 알코올 함량이 높아지다가 25% 첨가하였을 때 알코올 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 효모 생균수는 사과 농축액 첨가량이 많아질수록 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다. 사과 농축액을 농도별로 첨가하여 알코올 발효후 초산 발효를 행한 결과 초산 발효 전보다 발효 후 산도는증가하였고 pH는 발효 전보다 감소하는 것으로 나타나 초산 발효가 일어남을 알 수 있었다(Table 2).
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