[논문]Well-Plate를 사용한 치과용 유니트 수관 바이오필름 모델 확립

윤혜영; 이시영

doi:10.17135/jdhs.2017.17.4.283

Well-Plate를 사용한 치과용 유니트 수관 바이오필름 모델 확립
Establishment of a Dental Unit Biofilm Model Using Well-Plate 원문보기

치위생과학회지 = Journal of dental hygiene science, v.17 no.4, 2017년, pp.283 - 289

윤혜영 (강릉원주대학교 치과대학 구강미생물학교실 및 구강과학연구소) , 이시영 (강릉원주대학교 치과대학 구강미생물학교실 및 구강과학연구소)

초록
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DUWL에 형성한 바이오필름을 효율적으로 제거할 수 있는 새로운 소독제는 개발되어야 하며, 실험실에서 소독제의 효과를 확인하기 위해 DUWL 바이오필름 시료는 필요하다. 이 연구의 목적은 well plate를 사용하여 간단하고 재현 가능한 DUWL 바이오필름 모델을 개발하는 것이다. 사용중인 4대의 DUWL에서 배출된 1 L의 물을 여과지에 여과시켜 세균을 얻었다. 여과지를 PBS (pH 7.4) 용액 20 ml에 현탁시킨 후, 현탁액을 R2A 액체배지에 접종하고 $25^{\circ}C$에서 10일 동안 배양하였다. 10일 배양한 세균 배양액을 $-70^{\circ}C$에 보관하였고 매 실험에 사용하였다. 세균배양액을 R2A 배지에서 5일 동안 회분 배양하였다. 12-well plate에 회분 배양한 세균 배양액과 멸균한 폴리우레탄 튜빙 조각을 넣고 정체된 상태로 $25^{\circ}C$에서 바이오필름을 형성시켰다. R2A 액체배지는 2일마다 2 ml씩 교체해주었다. 폴리우레탄 내형성된 바이오필름의 축적량을 확인하기 위해 폴리우레탄 튜빙 조각을 내면에서 수집한 바이오필름을 R2A 고체배지에 도말하였다. 도말한 R2A 고체배지는 $25^{\circ}C$에서 7일 배양하고 $CFU/cm^2$를 계산하였다. 그리고 바이오필름의 두께와 구성 세균의 형태 및 분포를 확인하기 위해 CLSM과 SEM을 사용하였다. 4일 동안 배양시킨 바이오필름의 평균 축적량은 $1.15{\times}10^7CFU/cm^2$였다. 바이오필름은 구균, 짧은 길이의 간균, 그리고 중간길이의 간균을 포함하고 있었고 폴리우레탄 튜빙 내면에 넓게 분포하고 있었다. 바이오필름두께는 위치에 따라 차이가 있지만 $2{\mu}m{\sim}7{\mu}m$였다. 이 연구에서 제작된 DUWL 바이오필름 model은 DUWL에서 수집된 모든 세균을 사용하여 세균의 다양성을 확보했고 또한 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 well-plate를 사용했기 때문에 비용 효율적이고 재현이 간단하다. 본 연구의 DUWL 바이오필름 모델은 새로운 소독방법의 개발하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

The water discharged from dental unit waterlines (DUWLs) is heavily contaminated with bacteria. The development of efficient disinfectants is required to maintain good quality DUWL water. The purpose of this study was to establish a DUWL biofilm model using well-plates to confirm the effectiveness of disinfectants in the laboratory. Bacteria were obtained from the water discharged from DUWLs and incubated in R2A liquid medium for 10 days. The bacterial solution cultured for 10 days was made into stock and these stocks were incubated in R2A broth and batch mode for 5 days. Batch-cultured bacterial culture solution and polyurethane tubing sections were incubated in 12-well plates for 4 days. Biofilm accumulation was confirmed through plating on R2A solid medium. In addition, the thickness of the biofilm and the shape and distribution of the constituent bacteria were confirmed using confocal laser microscopy and scanning electron microscopy. The average accumulation of the cultured biofilm over 4 days amounted to $1.15{\times}10^7CFU/cm^2$. The biofilm was widely distributed on the inner surface of the polyurethane tubing and consisted of cocci, short-length rods and medium-length rods. The biofilm thickness ranged from $2{\mu}m$ to $7{\mu}m$. The DUWL biofilm model produced in this study can be used to develop disinfectants and study DUWL biofilm-forming bacteria.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

DUWL 바이오필름 모델은 치과에서 DUWL 내에 부착한 바이오필름 제거를 위한 효율적인 소독방법의 개발을 위해 필요하다. 우리가 알고 있는 한, well-plate를 이용하여DUWL 바이오필름을 형성시킨 첫 번째 연구이다. 본 연구의 well-plate 모델은 바이오필름 형성을 위해 DUWL에서 수집된 모든 세균을 사용했으며, 실험실에서 재현이 쉽다는 장점을 가진다.
이 연구에서 우리는 간단한 방법으로 실험실에서 재현이 가능한 DUWL 바이오필름 모델을 개발하고 모델에서 형성된 바이오필름을 평가하는 것을 목표로 하였다. 바이오필름을 형성하기 위해, DUWL의 물에서 배양 가능한 모든 세균과 실제 DUWL인 폴리우레탄 튜빙을 사용했다.
이 연구의 목적은 well-plate를 사용하여 실험실에서 재현이 간단한 DUWL 바이오필름 모델을 개발하고, 모델에서 형성된 바이오필름의 구성 및 특징을 공초점 현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)과 주사전자 현미경(scanning electron microscope, SEM)으로 평가하는 것이다.

가설 설정

바이오필름 형성 후 2일부터 바이오필름 축적량이 증가하기 시작했으며, 6일에는 최대 축적량을 보였다. 따라서 바이오필름 축적량이 증가한 기간 중 중간 지점에 해당하는 4일이 바이오필름의 축적량과 성숙도 측면에서 가장 적절하다고 판단했기 때문에 4일을 바이오필름 형성 기간으로 정하였다. CLSM과 SEM 분석으로 바이오필름을 평가했을 때 본 연구의 모델에서 4일 형성한 바이오필름이 구균, 짧은 길이의 간균, 그리고 중간 길이의 간균으로 구성되어있는 것을 확인했고,이 세균 유형은 미국 치과대학 병원 내 DUWL 바이오필름을 구균, 짧은 길이의 간균, 중간 길이의 간균, 그리고 나선균이 구성하고 있다는 것을 보여준 Cobb 등¹⁴⁾과 일본 치과대학병원에 DUWL 설치 52일 후 응집된 간균과 적은 양의 중간 길이의 간균의 부착을 확인한 Yabune 등¹⁵⁾의 결과와 유사하였다.

제안 방법

5% glutaraldehyde로 처리하여 1시간 동안 고정시켰다. 고정된 시료를 0.1 M phosphate buffer 용액을 사용하여 10분 동안 2번 씻어낸 후, 연속적으로 높은 농도의 에탄올(30%, 50%, 70%, 90%, 100%)에 처리하여 탈수시켰다. 건조 후, 시료를 stub 위에 고정시켰다.
그 후 멸균증류수로 세척하고 CLSM (IX71 Olympus, Tokyo, Japan)으로 1,000× 배율에서 관찰하였다.
바이오필름 형성 후 70% 에탄올로 폴리우레탄 튜빙 조각의 내면을 제외하고 모든 외면을 닦아주었다. 그 후 폴리우레탄 튜빙 조각을 PBS 용액에 2번 세척하여 느슨하게 부착한 세균을 제거하였고 내면을 멸균한 dental probe로 긁어서 0.09 mm 유리비드를 넣은 PBS 1 ml에 바이오필름을 모은 후 폴리우레탄 튜빙 조각을 PBS 1 ml에 넣고 함께 와류 시켰다. 바이오필름을 분리시킨 용액을 10배수로 희석시켜 희석액을 R2A 고체배지(Becton)에 spiral plate (IUL, Barcelona, Spain)를 이용하여 도말하였다.
건조 후, 시료를 stub 위에 고정시켰다. 그리고 금으로 코팅하였고 SEM으로 관찰하였다
모델에서 형성한 바이오필름을 구성하는 세균의 분포와 바이오필름 두께를 확인하기 위해 폴리우레탄 튜빙 조각을 LIVE/DEAD^Ⓡ BacLight^TM bacterial viability kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 염색했다. SYTO^Ⓡ 9 3μl와 propidium iodide 3 μl를 멸균증류수 1 ml에 희석하고 폴리우레탄 튜빙 조각당 희석한 시약을 200 μl씩 넣어주고 상온의 어두운 곳에서 20분 동안 반응시켰다.

대상 데이터

그 후 멸균증류수로 세척하고 CLSM (IX71 Olympus, Tokyo, Japan)으로 1,000× 배율에서 관찰하였다. SYTO^Ⓡ 9로 염색된 살아있는 세균은 여기파장 480 nm, 방출파장 500 nm에서 측정했고, propidium iodide로 염색된 손상된 세균은 여기파장 490 nm, 방출파장 635 nm에서 측정하였다. CLSM 촬영은 1μm 두께 간격으로 수행되었다.
하지만 이들의 모델은 특수하거나 자동화된 장비를 사용했기 때문에 실험실에서 재현하는 것이 쉽지 않다. Yoon과 Lee¹⁰⁾는 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 재료들을 사용하여 DUWL 바이오필름 모델을 제작하였다. 비록 고가의 재료들은 아니지만, 이 재료들로 바이오 필름 형성 장비를 제작해야 되는 과정이 필요하다.
5 ml를 R2A 액체배지 10 ml에 접종했고 25℃에서 5일간 회분 배양(batch culture)했다. 바이오필름을 형성하기 위해 내경 2 mm인 폴리우레탄 튜빙(Nitta Moore Corp., Gumi, Korea)을 가로로 1 cm, 그리고 세로로 반으로 잘라 사용하였다. 12-well plate (SPL, Seoul, Korea)의 각 well에 멸균한 폴리우레탄 튜빙 조각과 R2A 액체배지 3 ml를 넣었다(Fig.
이 연구에서 우리는 간단한 방법으로 실험실에서 재현이 가능한 DUWL 바이오필름 모델을 개발하고 모델에서 형성된 바이오필름을 평가하는 것을 목표로 하였다. 바이오필름을 형성하기 위해, DUWL의 물에서 배양 가능한 모든 세균과 실제 DUWL인 폴리우레탄 튜빙을 사용했다. 바이오필름 형성 후 2일부터 바이오필름 축적량이 증가하기 시작했으며, 6일에는 최대 축적량을 보였다.
치과대학 임상실습을 위해 사용되는 치과용 유니트 4대의 초음파 스케일러와 연결된 수관에서 1 L의 물을 멸균된 유리병에 수집하였다. 수집한 물은 즉시 실험실로 옮겨졌고 0.

이론/모형

모델에서 형성한 바이오필름 내 구성 세균의 형태를 확인하기 위해 SEM (UHR-SEM; Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하였다. 폴리우레탄 튜빙 조각은 2.
은 CDC biofilm reactor를 사용하여 DUWL 내에서 발견되는 3종의 미생물로 DUWL 바이오필름 모델을 제작했다. 반면, 본 연구의 모델은 DUWL 물에서 수집한 모든 세균을 바이오필름 형성을 위해 사용했다. 즉, 세균의 다양성 측면에서 본 연구의 모델이 실제 치과에서 사용하고 있는 DUWL과 더 유사하다고 할 수 있다.

성능/효과

또한 Walker와 Sedlacek¹²⁾, Sánchez 등¹³⁾은 치은 연하 치태의 실험실 모델을 제작하기 위해 well-plate를 사용했다. 두 연구 모두 well-plate 모델이 간단하고 높은 재현성을 가지면서 구강 바이오필름의 군집 과정, 구조와 역학을 연구하기에 적합한 것을 입증하였다. 하지만 현재까지 well-plate를 사용하여 DUWL 바이오필름을 재현한 연구는 없다.
우리가 알고 있는 한, well-plate를 이용하여DUWL 바이오필름을 형성시킨 첫 번째 연구이다. 본 연구의 well-plate 모델은 바이오필름 형성을 위해 DUWL에서 수집된 모든 세균을 사용했으며, 실험실에서 재현이 쉽다는 장점을 가진다. 치과 치료 시 생기는 DUWL 내 물의 흐름은 교반기(shaker)를 사용하여 생기는 배지의 와류로 대체할 수 있으며, 추후 바이오필름 형성 시 교반기를 사용하는 발전된 well-plate 바이오필름 모델의 확립은 필요하다.
반면, 본 연구의 모델은 DUWL 물에서 수집한 모든 세균을 바이오필름 형성을 위해 사용했다. 즉, 세균의 다양성 측면에서 본 연구의 모델이 실제 치과에서 사용하고 있는 DUWL과 더 유사하다고 할 수 있다. 바이오 필름 내 세균의 다양성은 세균 사이 상호작용으로 부착 능력에 영향을 줄 수 있으며, 또한 바이오필름의 소독제에 대한 내성에도 영향을 줄 수 있기 때문에 바이오필름 형성 시중요하다²²⁾.

후속연구

비록 고가의 재료들은 아니지만, 이 재료들로 바이오 필름 형성 장비를 제작해야 되는 과정이 필요하다. 따라서 실험실에서 더 재현이 간단한 DUWL 바이오필름 모델을 확립하기 위한 추가적 연구는 수행되어야 한다.
본 연구의 DUWL 바이오필름 모델은 새롭게 개발된 DUWL 소독제의 효과 및 다양한 소독 방법의 효과 확인을 위해 사용될 수 있다. 또한, DUWL 바이오필름을 구성하는 세균의 부착 특성 조사를 위해 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
치과 치료 시 생기는 DUWL 내 물의 흐름은 교반기(shaker)를 사용하여 생기는 배지의 와류로 대체할 수 있으며, 추후 바이오필름 형성 시 교반기를 사용하는 발전된 well-plate 바이오필름 모델의 확립은 필요하다. 본 연구의 DUWL 바이오필름 모델은 새롭게 개발된 DUWL 소독제의 효과 및 다양한 소독 방법의 효과 확인을 위해 사용될 수 있다. 또한, DUWL 바이오필름을 구성하는 세균의 부착 특성 조사를 위해 사용될 수 있을 것으로 예상된다.
본 연구의 well-plate 모델은 바이오필름 형성을 위해 DUWL에서 수집된 모든 세균을 사용했으며, 실험실에서 재현이 쉽다는 장점을 가진다. 치과 치료 시 생기는 DUWL 내 물의 흐름은 교반기(shaker)를 사용하여 생기는 배지의 와류로 대체할 수 있으며, 추후 바이오필름 형성 시 교반기를 사용하는 발전된 well-plate 바이오필름 모델의 확립은 필요하다. 본 연구의 DUWL 바이오필름 모델은 새롭게 개발된 DUWL 소독제의 효과 및 다양한 소독 방법의 효과 확인을 위해 사용될 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	SEM 사진에서 주로 발견된 세균은?	3). 이 중 짧은 길이의 간균이 주로 발견되었다. 세균들은 대부분 튜빙 내면에 넓게 분포하고 있었고 부분적으로 세균 덩어리도 관찰되었다.
	치과용 유니트 수관에서 배출되는 물의 상태는 어떤가?	치과용 유니트 수관(dental unit waterline, DUWL)에서 배출되는 물이 세균에 높은 수준으로 오염되어 있다는 것은 많은 연구를 통해 밝혀져 왔다1-3). 현재까지 DUWL에서 배출되는 물 내 세균 수준을 줄이기 위해 다양한 방법이 사용되고 있으며, 이 중 수관에 형성된 바이오필름을 제거하고 감소시키는 방법으로 화학제재를 포함한 소독제의 사용이 언급되고 있다4).
	Well-plate는 어디에 사용되는가?	Well-plate는 실험실에서 바이오필름을 형성시키기 위해 광범위하게 사용되어왔다. Christensen 등11)은 well-plate을 사용하여 Staphylococcus sp.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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