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문제 정의
- 따라서 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수 추출물, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올 추출물이 스트레스로 인해 억제된 면역기능을 회복시킬 수 있는 지 확인하기 위해서 대식세포의 식세포작용과 NO 함량의 변화 실험을 진행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- . 이에 뇌의 해마체 치상회(Dentate Gyrus, DG) 부위에서 iNOS 발현 세포수를 계측하여 iNOS의 발현양을 확인하였는데, 개체수가 적어 유의한 통계 결과가 나오지 않아 실험결과에는 기재하지 않았지만 향후 연구에 참고할 수 있도록 결과를 보고한다. 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 직후에 생쥐의 대뇌를 적출하여 Microtome을 이용하여 절편하고, Rabbit anti-mouse iNOS IgG (ab15323, abcam) 항체를 결합하여 발색했다.
- 이에 저자는 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)의 열수추출물, 치자시탕(梔子豉湯)의 30% 에탄올추출물을 구속스트레스를 부여한 생쥐에 투여하고 삼환계 항우울제인 이미프라민을 투여한 약물대조군과 비교하여 체중의 변화, 대식세포의 식세포작용(phagocytosis)과 산화질소(NO) 함량의 변화, 혈중의 부신피질자극호르몬(ACTH)과 corticosterone 함량의 변화를 관찰하여 치자(梔子), 향시(香豉),치자시탕(梔子豉湯)의 항스트레스 효과에 대한 의미 있는지견을 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이에 치자시탕(梔子豉湯)이 ≪상한론(傷寒論)≫12)에 ‘허번부득면(虛煩不得眠), 심중오뇌(心中懊憹), 흉중질(胸中窒), 심중결통(心中結痛)’의 효능으로 최초로 기재되었고,≪동의보감(東醫寶鑑)≫13)에서 심울불서(心鬱不舒)로 오뇌(懊憹)하는 자에게 처방되었던 점에 착안하여 치자시탕(梔子豉湯)의 항스트레스 효과에 주목하였으며, 최근 중국에서 치자시탕(梔子豉湯)의 심신증과 우울증 등의 스트레스 질환에 대한 치료 사례가 보고14)되고 있어 향후 항스트레스제로서의 응용 가능성을 규명하고자 한다.
- 이와 같은 연구 결과를 바탕으로 치자(梔子), 향시(香豉),치자시탕(梔子豉湯)이 항스트레스 약물로서 유의미하다고 판단하여, 향후 항스트레스 제제로의 응용 가능성에 대해 규명하고자 한다.
제안 방법
- 5일간의 약물투여 및 스트레스 자극을 가한 후 생쥐를 이산화탄소 마취한 후 생쥐의 복부의 외피를 절개한 후 주사기(10 ml, 18 G)를 이용하여 10 ml의 인산완충액(PBSLB204, Sigma)를 복강 내로 주사하였다. 1분 동안 복부를 마사지 하여 복강 내의 대식세포가 잘 혼합될 수 있도록 한 후 다시 주사기를 이용하여 대식세포 인산완충액 혼탁액을 추출하였다.
- NOR군과 CON군에는 아무것도 투여하지 않고, PC군에는 이미프라민을 증류수에 100 mg/ml로 희석하여 생쥐 체중 1 g 당 500 μg을 투여하고, FG군, FS군, CJSTW군,CJSTE군에는 각각 10 mg/ml로 희석하여 체중 1 g당 50μg을 증류수에 희석하여 동일 시간대에 약물을 경구 투여하였다. 1시간 동안 안정화 시킨 후에 각 그룹마다 각 15분, 60분 그리고 180분 동안 상기의 구속 스트레스를 가하였다. 그 후에 혈액채취로 인한 스트레스의 변수를 제어하기 위하여 엔토발(펜토바르비탈나트륨)을 이용하여 마취 후 혈액을 채취하였다.
- 5일 동안 매일 약물 투여 전에 생쥐의 체중을 측정하여 반복적 스트레스에 대한 체중변화를 확인하였다(Table 1). 5일차의 체중 변화로 NOR, CON, PC, FG, FS, CJSTW, CJSTE군으로 모든 군에서 NOR군에 비해 유의하게 낮은 체중을 나타내었다(p＜0.
- 이에 뇌의 해마체 치상회(Dentate Gyrus, DG) 부위에서 iNOS 발현 세포수를 계측하여 iNOS의 발현양을 확인하였는데, 개체수가 적어 유의한 통계 결과가 나오지 않아 실험결과에는 기재하지 않았지만 향후 연구에 참고할 수 있도록 결과를 보고한다. 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 직후에 생쥐의 대뇌를 적출하여 Microtome을 이용하여 절편하고, Rabbit anti-mouse iNOS IgG (ab15323, abcam) 항체를 결합하여 발색했다. 해마체의 일정면적(가로 790 μm, 세로 260 μm)에서의 발현양 결과는 PC군(132)을 제외하고 NOR (14),FG (21), FS (49), CJHSW (15), CJHSE (82)군 모두 CON군(82)에 비하여 발현양이 적었으며, FG군과 CJHSW군은 뚜렷한 iNOS 발현양의 감소를 보였고 특히 CJHSW는 NOR군과 유사한 수준이었다.
- 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 후 효모세포에 복강에서 추출한 대식세포를 반응시키고 남은 효모세포수를 측정하여 식세포작용을 확인하였다(Table 2). 효모세포수의 측정결과 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 낮은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 낮은 수치를 나타내었다.
- 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 후 효모세포에 복강에서 추출한 대식세포를 반응시키고 남은 효모세포수를 측정하여 식세포작용을 확인하였다. 식세포작용은 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 높은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 높은 수치를 나타내었다.
- 5일간의 약물투여 및 스트레스 자극을 가한 후 생쥐를 이산화탄소 마취한 후 생쥐의 복부의 외피를 절개한 후 주사기(10 ml, 18 G)를 이용하여 10 ml의 인산완충액(PBSLB204, Sigma)를 복강 내로 주사하였다. 1분 동안 복부를 마사지 하여 복강 내의 대식세포가 잘 혼합될 수 있도록 한 후 다시 주사기를 이용하여 대식세포 인산완충액 혼탁액을 추출하였다.
- 먼저 혈액을 채취하여 iced EDTA 시험관에 담아 −70°C에서 보관하며 사용 전까지 안정화 시켰다. ACTH 측정은 혈청 100 ul를 ACTH ELISA kit (AC018T, Calbiotech)를이용하여 혈액내의 ACTH양을 측정하였다. 결과 값은 ELISA reader (VERSAMAX, Molecular Devices)를 이용하여 판독하였다.
- 구속스트레스 후 검사를 위한 채혈 과정에서 발생되는스트레스가 혈중 호르몬 함량에 영향을 미치므로, 동일한 생쥐를 이용해서 180분 동안 스트레스를 가하면서 15분에 채혈, 60분에 채혈, 180분에 채혈하는 방법을 사용하지 않고, 구속 시간별로 다른 생쥐를 사용하여 실험함으로써 실험에 보다 정확도를 기하였다. ACTH함량은 일간변동이 심하고 오전에 높은 수치를 나타내므로 모두 오전 9시를 기준으로 하여 같은 날 같은 시간대에 약물을 투여하였다.
- NOR군과 CON군에는 아무것도 투여하지 않고, PC군에는 이미프라민을 증류수에 100 mg/ml로 희석하여 생쥐 체중 1 g 당 500 μg을 투여하고, FG군, FS군, CJSTW군, CJSTE군에는 각각 10 mg/ml로 희석하여 체중 1 g당 50μg을 증류수에 희석하여 5일 동안 매일 동일한 시간대에 약물을 경구 투여 하였다.
- NOR군과 CON군에는 아무것도 투여하지 않고, PC군에는 이미프라민을 증류수에 100 mg/ml로 희석하여 생쥐 체중 1 g 당 500 μg을 투여하고, FG군, FS군, CJSTW군,CJSTE군에는 각각 10 mg/ml로 희석하여 체중 1 g당 50μg을 증류수에 희석하여 동일 시간대에 약물을 경구 투여하였다.
- PC, FG, FS, CJHSW, CJHSE군에 각각에 해당하는 약물을 투여하였다. 약물 투여 한 시간 후부터 CON, PC, FG, FS, CJHSW, CJHSE군은 2시간 동안 구속스트레스를 가하고, 이튿날 동일 시간대에 또 다시 동일한 방법으로 약물을 투여하고 한 시간 후에 2시간 구속스트레스를 가하는 방법으로 총 5일간 진행 후에 CON, NOR군과 함께 대식세포를적출한다.
- ≪영추(靈樞)ㆍ본신편(本神篇)≫6)에서 “우추자(愁憂者), 기폐색이불행(氣閉塞而不行)”이라 하였고, ≪소문(素問)ㆍ본병론(本病論)≫30)에서 “인우수사려즉상심(人憂愁思慮卽傷心)”“인혹에노(人或恚怒), 기역상이불하(氣逆上而不下), 즉상간야(卽傷肝也)”라고 하여 정서적 스트레스와 기(氣)의 변화에 대하여 다루었다.
- 각기 다른 군에 15분, 60분 그리고 180분 동안 구속스트레스를 가한 후, 안정을 취하고 나서 생쥐의 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후, ACTH 함량을 측정하였다. 그 결과 FG, CJSTE군은 NOR군에 비해 15분, 60분, 180분대에서 모두 유의 하게 낮았으며(p＜0.
- 같은 방법으로 15분, 60분 그리고 180분 동안 구속스트레스를 가한 후에 혈액을 채취하여 혈청을 분리 후, corticosterone 함량을 측정하였다. 각 시간대별 corticosterone의 함량을 확인한 결과, 스트레스 초기인 15분대에서는 CJSTW, CJSTE군이 NOR군에 비해 유의하게 낮았으며(p＜0.
- 개체 간 체중변화를 알아보기 위해 매일 약물 투여 전 체중을 측정하여 5일간 체중변화를 관찰하였다.
- 구속스트레스 후 검사를 위한 채혈 과정에서 발생되는스트레스가 혈중 호르몬 함량에 영향을 미치므로, 동일한 생쥐를 이용해서 180분 동안 스트레스를 가하면서 15분에 채혈, 60분에 채혈, 180분에 채혈하는 방법을 사용하지 않고, 구속 시간별로 다른 생쥐를 사용하여 실험함으로써 실험에 보다 정확도를 기하였다. ACTH함량은 일간변동이 심하고 오전에 높은 수치를 나타내므로 모두 오전 9시를 기준으로 하여 같은 날 같은 시간대에 약물을 투여하였다.
- PC, FG, FS, CJHSW, CJHSE군에 각각에 해당하는 약물을 투여하였다. 그리고 약물 투여 1시간 후부터 3개의 각기 다른 장소에서 CON군과 함께 각 15분, 60분, 180분 동안 구속스트레스를 가하였고, 안정화시킨 후에 NOR군과 함께 채혈하였다.
- 대식세포내의 NO 함량을 통해 치자(梔子), 향시(香豉),치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올 추출물의 항상성 조절을 통한 스트레스 환경에서의 회복능력을 알아보기 위해서, 복부 외피세포를 제거하여 추출한 대식세포에 LPS와 γ-IFN를 첨가한 전후 NO함량의 차이를 검사하였다.
- 2)을 이용하여 평균±표준편차를 구하였고, 모든 변수는 군 간의 유의한 차이를 보기 위하여 일원배치 분산분석을 사용하였으며, 사후 검정으로 Bonferroni를 사용하였다. 또한 체중은 반복측정분산분석을 추가로 분석하였다. 통계적 유의수준인 p값은 0.
- 37°C 항온수조에서 30분 동안 안정화 시킨 후 고열 사멸 시킨 효모세포를 40×106 cells/ml이 되도록 세포 혼탁액에 넣어준다. 모든 그룹의 대식세포를 동일하게 처리 후 60분간 항온수조 내에서 반응시킨 후 효모세포 수를 혈구계산기(hemocytometer)로 측정하여 식세포작용을 측정한다.
- 반복적인 스트레스를 주는 실험에서는, 5마리 생쥐를 한 군으로 하여, 정상군(NOR), 대조군(CON), 양성대조군(PC),실험군으로 나누었다. 실험군은 치자 투여군(FG), 향시 투여군(FS), 치자시탕 열수추출물군(CJSTW), 치자시탕 30% 에탄올추출물군(CJSTE)으로 나누었다.
- 배양액 100 ul와 Griess (G4410, Sigma) 시액 100 ul를 혼합하여 96 well plate에 넣고 37°C에서 10분간 방치한 후 570 nm의 파장으로 측정하여 LPS와 γ-IFN로 NO를 활성화시킨 그룹과 그렇지 않은 그룹을 비교하여 각 그룹간의 차이를 확인하였다.
- 스트레스 시 HPA축에 의해 ACTH가 증가하여 연쇄적으로 corticosterone이 증가하나 corticosterone이 지속적으로 증가하면 음성되먹임기전에 의해 ACTH가 감소하여 corticosterone 증가속도를 억제하므로, ACTH 함량과 corticosterone 함량의 변화를 시간별로 실험하였다.
- 반복적인 스트레스를 주는 실험에서는, 5마리 생쥐를 한 군으로 하여, 정상군(NOR), 대조군(CON), 양성대조군(PC),실험군으로 나누었다. 실험군은 치자 투여군(FG), 향시 투여군(FS), 치자시탕 열수추출물군(CJSTW), 치자시탕 30% 에탄올추출물군(CJSTE)으로 나누었다. 이상의 7개의 실험군을 구성하여 1일 1회 실험 방법에 따라 5일까지 약물을 투여하였다.
- PC, FG, FS, CJHSW, CJHSE군에 각각에 해당하는 약물을 투여하였다. 약물 투여 한 시간 후부터 CON, PC, FG, FS, CJHSW, CJHSE군은 2시간 동안 구속스트레스를 가하고, 이튿날 동일 시간대에 또 다시 동일한 방법으로 약물을 투여하고 한 시간 후에 2시간 구속스트레스를 가하는 방법으로 총 5일간 진행 후에 CON, NOR군과 함께 대식세포를적출한다.
- 우울증과 불면의 밀접한 관계에 대한 여러 보고34,35)와 현재까지 정리된 연구결과를 토대로 불면에 다용하는 치자시탕(梔子豉湯)이 항스트레스 효과 뿐 아니라 항우울 효과가 있을 것으로 판단하여 본 연구를 계획하였으며, 체중의 변화, 대식세포의 식세포작용과 NO함량의 변화, 혈중 ACTH 함량과 corticosterone 함량의 변화 등을 측정하여 연구를 진행하였다. 또한 1950년대 후반 이후 처방되어 왔으며, 임상적으로 우울증 환자들의 65%에서 효과를 나타내는36) 삼환계 항우울제이자 항스트레스 약물인 이미프라민을 약물 대조군으로 하여 임상적인 효용성을 검토하였다.
- 실험군은 치자 투여군(FG), 향시 투여군(FS), 치자시탕 열수추출물군(CJSTW), 치자시탕 30% 에탄올추출물군(CJSTE)으로 나누었다. 이상의 7개의 실험군을 구성하여 1일 1회 실험 방법에 따라 5일까지 약물을 투여하였다. 시간별 스트레스를 주는 실험군에서는 동일하게 7개의 실험군으로 분류하고 군마다 총 9마리로 실험을 진행하였으며, 꼬리매달기실험은 정상군을 제외한 6개의 실험군에서 각 3마리로 진행하였다.
- 치자(梔子) 200 g, 향시(香豉) 200 g, 치자시탕(梔子豉湯, 열수추출) 240 g, 치자시탕(梔子豉湯, 30% 에탄올추출용) 240 g을 취하여, 다음과 같은 제조공정을 거쳐 치자(梔子) 건조엑스 8.3 g, 향시(香豉) 건조엑스 3.3 g, 치자시탕(梔子豉湯, 열수추출) 건조엑스 3.0 g, 치자시탕(梔子豉湯, 30% 에탄올추출) 건조엑스 9.8 g을 획득하여, 실험 전 상온에 보관하였다
- 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)의 항스트레스 효과를 규명하기 위하여 생쥐에 각각 약물을 투여하고,구속스트레스를 부여한 후에 체중의 변화, 복강 내 대식세포의 식세포작용과 산화질소(NO) 함량의 변화, 혈청 내 부신피질자극호르몬(ACTH)과 corticosterone 함량의 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- (1) 실험에 사용된 약재는 치자(梔子, 옴니허브, 전라남도 완도산)과 전통적 제조 기법으로 제조된 향시(香豉, 바른한약국)를 사용하였다. 치자시탕(梔子豉湯)의 구성은 龍野20)의 처방에 의거하여 치자(梔子) 20 g과 향시(香豉) 100 g으로 실험을 진행하였다. 비교 약물은 삼환계 항우울제인 이미프라민(환인제약(주))을 사용하였고, 정제 형태로 상온에 보관하였다.
- . 특히 우울증은 ≪경악전서(景岳全書)≫9)에서 울증의 일부인 노울(怒鬱), 사울(思鬱), 우울(憂鬱)과 같은 정서지울(情志之鬱)로 언급하여 정서적 스트레스와 연관성을 포괄적으로 논하였다.
대상 데이터
- (1) 실험에 사용된 약재는 치자(梔子, 옴니허브, 전라남도 완도산)과 전통적 제조 기법으로 제조된 향시(香豉, 바른한약국)를 사용하였다. 치자시탕(梔子豉湯)의 구성은 龍野20)의 처방에 의거하여 치자(梔子) 20 g과 향시(香豉) 100 g으로 실험을 진행하였다.
- 실험에서 5주령의 ICR 생쥐(수컷, 나라바이오텍)를 사용하였다. 5주령의 총 120마리에 대해 육안적으로 검사한 후,시험 동물실에서 7일 이상 순화하며 일반증상을 관찰한 후에 약물 투여 개시 시점에서는 7주령(116마리)를 실험에 사용하였다.
- RPMI-1640 (LM011, WelGENE) 10%FBS (090450, WISENT Icn.) 배양액으로 2회 세척 후 배양접시에서 도포하여 배양기(5% CO2, 37°C) 2시간 동안 배양하여 바닥에 붙지 않은 부유세포를 제거하고, 붙어있는 세포를 모아HBSS (LB003, WelGENE) 10% FBS에 2×106 cells/ml이되도록 세포를 분유시킨다.
- 치자시탕(梔子豉湯)의 구성은 龍野20)의 처방에 의거하여 치자(梔子) 20 g과 향시(香豉) 100 g으로 실험을 진행하였다. 비교 약물은 삼환계 항우울제인 이미프라민(환인제약(주))을 사용하였고, 정제 형태로 상온에 보관하였다.
- 이상의 7개의 실험군을 구성하여 1일 1회 실험 방법에 따라 5일까지 약물을 투여하였다. 시간별 스트레스를 주는 실험군에서는 동일하게 7개의 실험군으로 분류하고 군마다 총 9마리로 실험을 진행하였으며, 꼬리매달기실험은 정상군을 제외한 6개의 실험군에서 각 3마리로 진행하였다.
- 시약으로는 인산완충액(PBS LB204, Sigma), 배양액RPMI-1640 10% FBS, HBSS 10% FBS, LPS, γ-IFN, Griess 시액, Rabbit anti-mouse iNOS IgG 항체, 인산완충액(0.02% Tween 20) 세척액, mouse anti rabbit IgG conjugated HPR 항체, DAB 발색액, ACTH ELISA kit 등 표준화된 일반 시약을 사용하였다.
- 02% Tween 20) 세척액, mouse anti rabbit IgG conjugated HPR 항체, DAB 발색액, ACTH ELISA kit 등 표준화된 일반 시약을 사용하였다. 실험기기로는 ELISA reader, Vib ratome, CO2 incubator 등을 사용하였다.
-
1) 실험동물
실험에서 5주령의 ICR 생쥐(수컷, 나라바이오텍)를 사용하였다. 5주령의 총 120마리에 대해 육안적으로 검사한 후,시험 동물실에서 7일 이상 순화하며 일반증상을 관찰한 후에 약물 투여 개시 시점에서는 7주령(116마리)를 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 각 측정치는 R program (3.3.2)을 이용하여 평균±표준편차를 구하였고, 모든 변수는 군 간의 유의한 차이를 보기 위하여 일원배치 분산분석을 사용하였으며, 사후 검정으로 Bonferroni를 사용하였다.
이론/모형
- 구속, 소음, 그리고 추위 스트레스 중 직접적인 신체적 통증을 유발하지 않으므로 현대인들이 자주 노출되는 정신적 스트레스와 유사한 정서적 스트레스 모델37)인 구속스트레스를 본 연구에 적용하였다.
- 의 종자를 쪄서 발효시켜 가공한 것으로 성미(性味)는 한(寒), 고(苦), 무독(無毒)하며, 귀경(歸經)은 폐(肺), 위(胃)로 소산해울(疏散解鬱), 선울제번(宣鬱除煩)의 효능을 가진다27). 담두시의 약명(藥名)은 SEMEN SOJAE PREPARATUM으로, 향시(香豉)의 제조법과 차이가 있어 본 연구에서는 Fermented SEMEN SOJAEPREPARATUM라 기재하였다.
성능/효과
- 1. 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 약물 대조군에 비해 유의하게 적은 체중의 감소를 보였다. 식세포작용은 모든 군에서 대조군보다 높은 수치를 나타냈으며, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군에서 정상군에 비해 유의하게 높은 식세포작용을 나타냈다.
- 01). 180분대에서는 NOR군에 비해 CON, PC, FG, FS, CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.01), CON군에 비해 PC, FS, CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았다(p＜0.01).
- 2. 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)은 ACTH과 corticosterone의 함량 증가를 유의하게 억제하였다. 특히 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물은 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 corticosterone의 함량증가를 유의하게 억제하였다.
- 5일 동안 매일 약물 투여 전에 생쥐의 체중을 측정하여 반복적 스트레스에 대한 체중변화를 확인하였다(Table 1). 5일차의 체중 변화로 NOR, CON, PC, FG, FS, CJSTW, CJSTE군으로 모든 군에서 NOR군에 비해 유의하게 낮은 체중을 나타내었다(p＜0.01). 또한 1일차와 5일차의 체중 변화에 있어서 NOR군의 체중만이 증가 하였고, 나머지 모든 군의 체중이 감소하였다.
- 01). 60분대에서는 NOR군에 비해 CON, PC, FG,CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.01), CON군에 비해 PC, FG, FS, CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았다(p＜0.01). 180분대에서는 NOR군에 비해 CON, PC, FG, FS, CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.
- 반면, 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 NO의 함량에는 영향을 주지 못하였다. ACTH의 함량은 구속시간 15분에서 치자(梔子)군이 정상군에 비해 유의하게 낮았으며, 60분에서는 모든 약물군이 정상군과 대조군에 비해 유의하게 낮았고, 180분대에서는 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군이 정상군과 대조군에 비해 유의하게 낮아 ACTH 함량 증가를 억제하였다. corticosterone의 함량은 치자(梔子)군이 구속시간 15분과 60분에서 정상군에 비해 유의하게 낮았고, 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물군은 15분에서 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 유의하게 낮았으며, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군은 60분을 제외한 모든 시간대에서 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 유의하게 낮아 corticosterone의 함량증가를 유의하게 억제하였다.
- ACTH의 함량을 확인한 결과(Table 4), 15분대에서는 NOR군에 비해 CON, PC, FG, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.01), CON군에 비해 PC군에서 유의하게 낮았다(p＜0.01). 60분대에서는 NOR군에 비해 CON, PC, FG,CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.
- 대식세포내의 NO 함량을 통해 치자(梔子), 향시(香豉),치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올 추출물의 항상성 조절을 통한 스트레스 환경에서의 회복능력을 알아보기 위해서, 복부 외피세포를 제거하여 추출한 대식세포에 LPS와 γ-IFN를 첨가한 전후 NO함량의 차이를 검사하였다. NO 함량 변화를 측정한 결과 모든 군에서 CON군보다 높은 값을 나타내었으며, CJSTW, FG, PC, FS, CJSTE군 순으로 증가 하였으나 유의성 있는 값을 보이진 않았다. 다만, 비슷한 실험 모델인 이 등31)의 대황(大黃), 황련(黃連), 대황황련사심탕(大黃黃連寫心湯)의 NO함량 변화를 봤을 때 CON군의 NO 함량 변화가 5.
- NO의 함량을 측정한 결과(Table 3), 모든 군에서 CON군보다 높은 값을 나타내었으며, CJSTW, FG, PC, FS, CJSTE군의 순으로 증가 하였으나 유의성 있는 값을 보이지 않았다. PC, FS, CJSTE군에서 NOR군 보다 높은 값을 나타내었지만 통계학적 유의성은 없었다.
- ACTH의 함량은 구속시간 15분에서 치자(梔子)군이 정상군에 비해 유의하게 낮았으며, 60분에서는 모든 약물군이 정상군과 대조군에 비해 유의하게 낮았고, 180분대에서는 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군이 정상군과 대조군에 비해 유의하게 낮아 ACTH 함량 증가를 억제하였다. corticosterone의 함량은 치자(梔子)군이 구속시간 15분과 60분에서 정상군에 비해 유의하게 낮았고, 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물군은 15분에서 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 유의하게 낮았으며, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군은 60분을 제외한 모든 시간대에서 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 유의하게 낮아 corticosterone의 함량증가를 유의하게 억제하였다.
- 각 시간대별 corticosterone의 함량을 확인한 결과(Table 5), 15분대에서는 NOR군에 비해 CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았으며(p＜0.01), CON군에 비해 FG,CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았고(p＜0.01), PC군에 비해 CJSTW, CJSTE군에서 유의하게 낮았다(p＜0.01). 60분대에서는 NOR군에 비해 FG군이 유의하게 낮았으며(p＜0.
- 같은 방법으로 15분, 60분 그리고 180분 동안 구속스트레스를 가한 후에 혈액을 채취하여 혈청을 분리 후, corticosterone 함량을 측정하였다. 각 시간대별 corticosterone의 함량을 확인한 결과, 스트레스 초기인 15분대에서는 CJSTW, CJSTE군이 NOR군에 비해 유의하게 낮았으며(p＜0.01), 60분대에서는 NOR군에 비해 FG군만이 유의하게 낮았고(p＜0.05), 180분대에서는 CJSTE군이 NOR, CON, PC군에 비해 유의하게 낮아(p＜0.05, p＜0.01, p＜0.01)치자시탕(梔子豉湯)의 corticosterone 함량 증가를 억제하는 효능을 확인하였다.
- 각기 다른 군에 15분, 60분 그리고 180분 동안 구속스트레스를 가한 후, 안정을 취하고 나서 생쥐의 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 후, ACTH 함량을 측정하였다. 그 결과 FG, CJSTE군은 NOR군에 비해 15분, 60분, 180분대에서 모두 유의 하게 낮았으며(p＜0.01), CJSTW군은 60분대와 180분대에서 NOR군과 CON군에 비해 유의하게 낮았고(p ＜0.01, p＜0.01), FS군은 60분대에서는 CON군에 비해 유의하게 낮았으며(p＜0.01), 180분대에서는 NOR군과 CON군에 비해 유의하게 낮아(p＜0.01, p＜0.01), ACTH 함량증가를 억제하는 효능을 확인하였다.
- 효모세포수의 측정결과 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 낮은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 낮은 수치를 나타내었다. 그 중 FS군과 CJSTE군에서 NOR군과 유사한 수치를 나타내었으며, CJSTE군은 NOR군에 비해 유의하게 낮은 수치를 나타냈다(p＜0.05).
- 또한 1일차와 5일차의 체중 변화에 있어서 NOR군의 체중만이 증가 하였고, 나머지 모든 군의 체중이 감소하였다. 그 중 FS군과 CJSTW군에서 CON군에 비해 유의하게 적은 체중 감소를 보였고(p＜0.01),FG, FS, CJSTW, CJSTE군 PC에 비해 유의하게 적은 체중감소를 보였다(p＜0.01).
- 식세포작용은 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 높은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 높은 수치를 나타내었다. 그 중 FS와 CJSTE군에서 NOR군과 유사한 수치를 나타내었으며, CJSTE군의 식세포작용은 NOR군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타냈다(p＜0.05).
- 01). 그 중 FS와 CJSTW군에서 CON군에 비해 유의하게 적은 체중 감소를 보였고(p＜0.01), FG, FS, CJSTW, CJSTE군은 PC군에 비해 유의하게 적은 체중 감소를 보였으므로(p＜0.01), 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)이 구속스트레스로 인한 체중의 감소를 억제함을 알 수 있다.
- 따라서 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수 추출물 및 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물이 ACTH를 조절하며 또한 corticosterone을 낮추어 스트레스 회복 능을 보인다는 것을 알 수 있다.
- 이상의 결과를 종합하여 보면, 구속스트레스 상황에서 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 약물대조군에 비해 유의하게 적은 체중의 감소를 보였으며, 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물군은 대조군에 비해서도 유의하게 적은 체중 감소를 보였다. 또한 식세포작용은 모든 약물군에서 대조군보다 높은 수치를 나타냈으며, 특히치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군은 정상군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내어 식세포작용 저하의 억제에 유효한 결과를 보였다. 반면, 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 NO의 함량에는 영향을 주지 못하였다.
- 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 후 효모세포에 복강에서 추출한 대식세포를 반응시키고 남은 효모세포수를 측정하여 식세포작용을 확인하였다. 식세포작용은 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 높은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 높은 수치를 나타내었다. 그 중 FS와 CJSTE군에서 NOR군과 유사한 수치를 나타내었으며, CJSTE군의 식세포작용은 NOR군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타냈다(p＜0.
- 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 약물 대조군에 비해 유의하게 적은 체중의 감소를 보였다. 식세포작용은 모든 군에서 대조군보다 높은 수치를 나타냈으며, 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군에서 정상군에 비해 유의하게 높은 식세포작용을 나타냈다. 모든 실험약물은 산화질소(NO)의 함량에 영향을 주지 못하였다.
- 이상의 결과를 종합하여 보면, 구속스트레스 상황에서 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)군은 약물대조군에 비해 유의하게 적은 체중의 감소를 보였으며, 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯) 열수추출물군은 대조군에 비해서도 유의하게 적은 체중 감소를 보였다. 또한 식세포작용은 모든 약물군에서 대조군보다 높은 수치를 나타냈으며, 특히치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물군은 정상군에 비해 유의하게 높은 수치를 나타내어 식세포작용 저하의 억제에 유효한 결과를 보였다.
- 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)은 ACTH과 corticosterone의 함량 증가를 유의하게 억제하였다. 특히 치자시탕(梔子豉湯) 30% 에탄올추출물은 정상군, 대조군, 약물대조군에 비해 corticosterone의 함량증가를 유의하게 억제하였다.
- 해마체의 일정면적(가로 790 μm, 세로 260 μm)에서의 발현양 결과는 PC군(132)을 제외하고 NOR (14),FG (21), FS (49), CJHSW (15), CJHSE (82)군 모두 CON군(82)에 비하여 발현양이 적었으며, FG군과 CJHSW군은 뚜렷한 iNOS 발현양의 감소를 보였고 특히 CJHSW는 NOR군과 유사한 수준이었다.
- 5일간 약물 투여 및 2시간의 구속 스트레스를 반복적으로 가한 후 효모세포에 복강에서 추출한 대식세포를 반응시키고 남은 효모세포수를 측정하여 식세포작용을 확인하였다(Table 2). 효모세포수의 측정결과 CJSTE, FS, CJSTW, PC, FG군 순으로 낮은 값을 나타내었으며, 모든 군에서 CON군보다 낮은 수치를 나타내었다. 그 중 FS군과 CJSTE군에서 NOR군과 유사한 수치를 나타내었으며, CJSTE군은 NOR군에 비해 유의하게 낮은 수치를 나타냈다(p＜0.
후속연구
- 65 μm의 증가만 있었으므로 대조군의 NO함량 변화 차이로 실험군 결과의 해석이 달라질 수 있는 점도 참고가 필요하다. 따라서 본 연구결과만으로 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)이 NO함량에 크게 영향을 주지 못했다고 단정하기는 힘들므로 향후에 보완 연구가 필요하다고 사료된다.
- 이처럼 치자(梔子), 향시(香豉), 치자시탕(梔子豉湯)은 스트레스 호르몬 조절에서 이미프라민과 유사한 효과를 나타내면서도 이미프라민에 비하여 체중과 식세포작용 감소를 억제해 면역력 유지에서 장점을 보이는 항스트레스 약물로서의 효과를 확인하였으며, 향후 용량에 대한 보완연구를 통해 항스트레스 제제화 등 임상적 활용을 위한 연구가 지속되어야 할 것이다.
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