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문제 정의
- 한우의 경우도 예외가 아니며 증체율과 대사 효율을 떨어트려 경제적 손실을 야기하는 것으로 판단되며 더 많은 에너지를 소비하는 젖소의 경우, 산유량 감소 등그 파급효과는 훨씬 클것으로 판단된다. 무엇보다 번식 효율의 감소가 수정란의 발생부터 시작되면 대가축의 생산성에 직접적인 타격을 줄 것으로 예상되기에 본 연구에서 혹서기의 체온 상승도과 동일한 조건을 난자의 체외성숙과정에 실시하여 HS의 영향을 조사하였으며 추후 수정란 배양체계 개선 연구를 위한 기본 기술을 확립하고자 실험을 실시하였다. 한우의 경우, 본 연구소의 축군을 대상으로 혹서기 체온 상승 도를 직장내 온도로 측정한 결과에 따르면 혹서기의 체온 상승도는 젖소에 비하여 다소 낮은 것으로 조사되었으며(미 발표자료) 그 이유는 젖소의 경우 평균 체중이 더 높고 표면적이 한우보다 상대적으로 작은 특징에 기인할 것으로 추정되었다.
- 본 연구에서는 HS의 영향을 조사하기 위하여 한우 난소 시료를 도축장에서 얻었으며 회수된 COCs를 활용하여 체외성숙 과정에서 배양 후기에 HS노출되는 시간을 조절하였다. 소난자의 성숙에는 약 22시간이 소요됨에 따라, 난자의 핵성숙이 완료되는 시점에서 HS를 유도하였으며 배양기의 온도를 설정하여 38.
제안 방법
- 3% FAFBSA, 10µg/ml insulin이 첨가된mSOF 소 수정란 발생용 배양 액을 이용하여 8일동안 배양하였다. 2일 동안 5% CO2, 5% O2 와 90% N2 로 조정된 배양기에서 초기 발생을 유도하였으며 배양 3일째에 FBS 10%를 첨가하였다(Holm 등, 1999;Takahashi와 First 1992). 배양 3일, 5일 및 8일에 수정란의 발생단계를 난할율, 8세포기, 상실기 및 배반포 형성율을 관찰 하였다.
- 세포사멸의 존재를 확인하기 위하여 TUNEL분석 키트(In Situ Cell Detection Kit, Roche Applied Science)를 이용하여 발생 8일자 배반포를 염색하였다. 3.7%의 paraformadehyde로 30분간 고정하고 0.5% Triton X에서 20분간 처리하여 효소와 시약의 침투성을 유도하였다. 각 단계별로 PBS로 배반포를 세정하였고, 단편화 사슬 DNA에 fluorescein-dUTP를 효소적 으로 말단에 중합하기 위하여 1시간 동안 37 ℃에서 반응시 켰으며 DAPI로 핵을 염색하여 전체할구수에 대한 세포사멸 할구의 비율을 조사하였다.
- COCs의 성숙배양 후기에 HS를 유도하였을 때, 난자의 성숙도에 미치는 영향이 없는 조건(1 및 4시간)으로 생산된 성숙난자를 체외수정을 실시하였다(Fig. 2) 대조군으로 난자를 정상 배양 온도인 38.5℃에서 22시간 배양하여 체외수정을 실시하였으며 실험군으로 후 배양을 40.5℃에서 1 및 4시간 동안 실시하여 체외수정을 실시하였다. mSOF배양액에서 2일을 배양하고 수정란의 할구분열을 관찰하였을때, 대조군은64.
- COCs의 성숙배양 후기에서 HS를 1시간 또는 4시간 유도 하고 체외수정을 실시하고 수정란을 배양하였을때, 8세포기와 배반포 발생율을 조사하였다(Fig. 3). 수정란의 8세포기 출현율은 대조군에서는 43.
- 본 연구에서는 도축장에서 채취한 난소에서 난자를 확보하여 체외 성숙을 실시하고 HS를 유도하였다. HS유도에 따른 난자 성숙율과 수정란 발생율을 비교하였으며, 생산된 배반포의 배반포의 세포사멸도를 비교 검토하였다. 우리나라의 체외 수정기법을 이용한 소 수정란의 생산은 지구 온난화 현상으로 점차 고온기가 증가할 것으로 예상되므로 질적인 저하현상이 예상되고 있으며 이는 체내 수정란의 경우에도 적용될 것으로 판단된다.
- 5% Triton X에서 20분간 처리하여 효소와 시약의 침투성을 유도하였다. 각 단계별로 PBS로 배반포를 세정하였고, 단편화 사슬 DNA에 fluorescein-dUTP를 효소적 으로 말단에 중합하기 위하여 1시간 동안 37 ℃에서 반응시 켰으며 DAPI로 핵을 염색하여 전체할구수에 대한 세포사멸 할구의 비율을 조사하였다.
- 한우 난소에서 회수한 COCs를 TCM-199배양액에서 난자 성숙을 22시간 간 실시할 때, 성숙배양 후기의 HS처리가 난자의 핵 성숙율에 미치는 영향을 조사하였다(Fig 1). 대조군으로서 소 난자의 성숙과정을 정상 배양온도인 38.5℃에서 22시간 성숙시켜 딸세포(polar body)가 방출되어 MII stage 난자의 출현율을 조사하였다(83.7%). 실험군으로 40.
- 2일 동안 5% CO2, 5% O2 와 90% N2 로 조정된 배양기에서 초기 발생을 유도하였으며 배양 3일째에 FBS 10%를 첨가하였다(Holm 등, 1999;Takahashi와 First 1992). 배양 3일, 5일 및 8일에 수정란의 발생단계를 난할율, 8세포기, 상실기 및 배반포 형성율을 관찰 하였다.
- 본 연구에서는 도축장에서 채취한 난소에서 난자를 확보하여 체외 성숙을 실시하고 HS를 유도하였다. HS유도에 따른 난자 성숙율과 수정란 발생율을 비교하였으며, 생산된 배반포의 배반포의 세포사멸도를 비교 검토하였다.
-
3. 난자의 체외성숙
성숙배양액은 TCM-199배양액을 12.5 mM HEPES와 26.2mM NaHCO 3를 이용하여 5% CO2 배양기에서 전 배양을 12시간 이상(overnight)하였을 때, pH수치가 7.4~7.5로 측정되는 조건으로 조제하였다. 회수된 COCs의 배양은 5% FBS(Gibco, USA)와 0.
- 성숙배양이 끝난 난자는 한우개량사업소에서 구매한 한우 후보씨 수소(KPN 999) 동결 정액을 이용하여 수정을 실시하였으며 기본 배양액으로 Brackett과 Oliphant(1975)가 보고한 BO배지를 변형하여 사용하였다. 동결정액은 37 ℃에서 45초간 융해하고 calcium과 magnesium이 없는 PBS 6 ml로 800 g 에서 7분간 원심분리하여 글리세롤과 난황을 제거하였다.
- 세포사멸의 존재를 확인하기 위하여 TUNEL분석 키트(In Situ Cell Detection Kit, Roche Applied Science)를 이용하여 발생 8일자 배반포를 염색하였다. 3.
- 본 연구에서는 HS의 영향을 조사하기 위하여 한우 난소 시료를 도축장에서 얻었으며 회수된 COCs를 활용하여 체외성숙 과정에서 배양 후기에 HS노출되는 시간을 조절하였다. 소난자의 성숙에는 약 22시간이 소요됨에 따라, 난자의 핵성숙이 완료되는 시점에서 HS를 유도하였으며 배양기의 온도를 설정하여 38.5℃와 40.5℃에 노출되는 시간을 조절하여 성숙시킨 후 난자의 성숙도와 이를 이용한 수정란의 발생율을 조사하였다.
- 85% 생리식염수(saline)에 세척하였으며 100 U/ml penicillin과 100µg/ml streptomycin이 첨가된 saline을 23~28 ℃로 맞추어 보온병에 담고 6시간 이내에 실험실로 운반하였다. 수집한 난소는 생리 식염수로 4-5회 세척후 난포액에서 직경 3.0~6.0 mm 크기의 COCs를 18 G 주사침으로 흡입하여 회수하였으며, TCM-199배양액으로 약 22시간동안 성숙배양을 유도하였다.
- 정자의 운동성을 증진시키기 위하여 0.45 µg/ml 농도의 theophyllin 과 0.4% (w/v)의 fatty acid free BSA를 BO 배양액에 첨가하였다.
- 체외수정을 실시한 후 난구세포가 제거된 난자는 1% BME amino acid, 2% MEM non-essential amino acid, 0.3% FAFBSA, 10µg/ml insulin이 첨가된mSOF 소 수정란 발생용 배양 액을 이용하여 8일동안 배양하였다.
- 한우 난소에서 회수한 COCs를 TCM-199배양액에서 난자 성숙을 22시간 간 실시할 때, 성숙배양 후기의 HS처리가 난자의 핵 성숙율에 미치는 영향을 조사하였다(Fig 1). 대조군으로서 소 난자의 성숙과정을 정상 배양온도인 38.
- 한우의 경우 젖소에 비하여 혹서기 반응도가 낮다고 판단되므로, 소의 난자 체외성숙 과정에서 대조군은 38.5℃로 조절된 배양기에서 COCs 10~15개를 TCM-199 300 µl의 소적에서 22시간 배양하였으며 실험군은 38.5℃에서 21, 18 및 12시간동안 전배양하고 HS를 유도하기 위하여 40.5 ℃로 조절된 배양기에서1, 4 및 12시간으로 후배양하여 총 배양시간이 소난자가 성숙에 필요한 22시간을 넘지 않도록 배양하였다
- 5로 측정되는 조건으로 조제하였다. 회수된 COCs의 배양은 5% FBS(Gibco, USA)와 0.1 U/ml FSH를 첨가하였으며 Ball 등의 방법(1983) 을 변형하여 이용하였다. 성숙이 완료된 난자는 hyaluronidase 300U/ml을 처리하여 난구세포를 제거 하였으며, 0.
대상 데이터
- 도축장에서 한우 암소의 자궁에서 난소를 적출하고 0.85% 생리식염수(saline)에 세척하였으며 100 U/ml penicillin과 100µg/ml streptomycin이 첨가된 saline을 23~28 ℃로 맞추어 보온병에 담고 6시간 이내에 실험실로 운반하였다.
- 특별히 언급되지 않은 경우, 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA)의 한국 대리점을 통하여 구입하였으며 난자의 성숙 및 수정란 배양액 제조에 이용된 물은 Irvine Scientific (Santa Ana, USA)에서 제조한 체외수정 클리닉 등급 (Water for Assisted Reproductive Technology)을 이용하였다
데이터처리
- 각 실험은 5번을 반복하여 실시하였으며, 난자의 성숙율, 난할율 및 발생율에 대한 분석은 Student’s t-test로 분석을 실시하였다.
이론/모형
- HS처리에 의한 수정란에 있어 질적인 차이를 조사하고자 생산된 수정란의 세포사멸 현상을 TUNEL assay방법을 이용 하여 관찰하였다(Fig 4). TUNEL assay 염색에 의하여 positive 로 판별되는 할구의 수를 전체 세포수에 대한 비율을 조사하였을 때, 대조군에서는 3.
성능/효과
- 1시간동안 40.5℃에서 후 배양된 실험군에서 높은 난할율을 관찰되었으나 대조군과 유의적 차이가 관찰되지 않았으며 4시간의 HS처리도 난할에 유의 적인 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다(p > 0.05).
- 05). 1시간동안 HS를 유도할 때, 난자의 성숙율과 난할율에 영향이 없는 것으로 판단되었으나 8세포기와 배반포기의 출현이 낮아지는 경향을 관찰 할 수 있었다.
- 8세포기 발생율은 처리군 간 유의적 차이가 없었으며, 오히려 1시간 40.5℃ 배양이 약간 높은 경향을 나타내었고, 4시간 배양 처리군에서는 낮은 경향을 관찰되었다(p> 0.05).
- TUNEL assay 염색에 의하여 positive 로 판별되는 할구의 수를 전체 세포수에 대한 비율을 조사하였을 때, 대조군에서는 3.4%의 비율로 존재하는 반면 1시간 처리군은 2.9%로 유의적 차이가 존재하지 않았으나, 4시간 처리군의 경우 5.5%의 세포사멸 할구수 증가로 유의적 차이가 있는 것을 관찰 할 수 있었다 (p < 0.05).
- 5℃에서 1 및 4시간 동안 실시하여 체외수정을 실시하였다. mSOF배양액에서 2일을 배양하고 수정란의 할구분열을 관찰하였을때, 대조군은64.4%의난자가 정상적인 2세포기로 난할을 시작하였으며, 40.5℃에서후 배양을 1 및 4시간 처리한 실험군에서는 각각 73.6% 및 70.4%의 난할율을 관찰하였다. 1시간동안 40.
- 또한, 배반포 형성율에 있어서 대조군은 31.5% 로, 1시간 및 4시간동안 HS를 유도한 실험군은 29.2%와 21.1%로 관찰되어HS유도를 4시간동안 실시한 실험군은 대조군과 비교할 때 차이가 존재하는 것을 알수 있었다(p < 0.05).
- 본 연구에서 도축장 유래 난소에서 채취한 COCs를 정상적인 온도로 전배양을 실시하고 후 배양으로 40.5℃에서 각각 1, 4 및 12시간 HS를 유도하였을 때, HS 4시간 처리는 체외성 숙에 영향을 주지 않는것으로 판단되나, 12시간 가까이 지속 적으로 고온에 노출될 경우, 난자의 핵성숙율이 감소하는 것으로 관찰되었다.
- 이러한 변화는 후배양의 체외성숙 시간이 길어질수록 HS에 대한 영향을 더 많이 받았기 때문으로 추정되었다. 본 연구에서는 성숙한 난자는 체외수정 후 난할율은 HS로 인한 손실이 나타나지 않으나 흥미롭게도 1시간의 고온 처리군에서는 대조군에 비해 약 간 높은 성적으로 나타나는 경향이 관찰되었다. HS처리는 난할 분할기작에 일시적인 효과가 작용하는 것으로, 이 효과는 고온에 저항하기 위한 세포내에서 여러 가지 생화학적 반응들 중에서 HSP과 같은 분자들의 작용에 의해 부수적으로 생산된 어떤 물질들이 배발달에 영향을 주고 있을 가능성이 보고된 바 있다(Nover와 Scharf, 1991).
- HS처리는 난할 분할기작에 일시적인 효과가 작용하는 것으로, 이 효과는 고온에 저항하기 위한 세포내에서 여러 가지 생화학적 반응들 중에서 HSP과 같은 분자들의 작용에 의해 부수적으로 생산된 어떤 물질들이 배발달에 영향을 주고 있을 가능성이 보고된 바 있다(Nover와 Scharf, 1991). 뿐만 아니라, 본 연구 결과에서 HS 유도시간이 길어질수록 배발생의 저하 현상이 8 세포기와 배반포기 형성율이 저하되었고 배반포에는 세포사가 일어난 할구의 수가 증가하는 결과를 관찰 할 수 있었다. 이러한 연구 결과는 젖소의 초기 발생단계의 배에 있어서 4 2℃의 고온 스트레스를 받았을 때 상실배의 배발생율이 감소하는 연구 결과(Putney 등, 1989; Ealy 등, 1993)와 동일한 결과를 보여주고 있으며, 수정란의 초기 발생과정에서 직접적인 온도 충격은 없더라도 난자의 성숙과 발육과정에서 온도 충격을 받게되면 영향이 잔존할 수 있음을 보여주고 있다.
- 7%). 실험군으로 40.5℃로 조정된 배양기에서 1, 4 및 12시간을 처리하였을 때, 성숙율은 각각 84.5%, 84.8% 및 63.0%로 조사되었다. 이러한 결과는 COCs의 HS처리는 1및 4시간 동안의 비교적 짧은 시간 동안 처리 하였을 때, 난자의 핵 성숙율에는 유의적 차이가 없는 것으로 관찰되었고(p > 0.
- Ju 등(2005) 에 의한 연구 결과에 따르면, 20 h동안 정상조건에서 전배양을 실시하고42℃에서 4시간동안 HS를 후배양 방법으로 부가 하였을 때 난할율이 88%로 유의적차이가 없음을 보고하였으나 배반포의 형성율은 44%에서 27%로 낮아짐을 보고하였다. 이러한 결과는 40.5℃의 HS유도와 유사한 결과로 본 연구의 난할 결과와 동일한 경향으로 체외 성숙 난자의 HS유도 방법의 차이에도 불구하고 난자의 성숙도에는 큰 영향을 미치지 않을 수 있음을 보여주고 있다. 또한, 생체 내 난자에서는 HS 에 대한 방어기작이 존재할 수 있기 때문에 이와 같은 결과가 생체내의 수정란 생산을 위하여 극복할 수 있는 방법을 강구 하는 것도 중요한 연구영역으로 판단되며, 점차 난자의 체외 배양과 체외수정기법이 생검된 난자의 이용성 증진에 활용되고 있으므로 HS에 대한 적절한 방어기작 개발에 중요한 정보 라고 여겨진다.
- 이러한 결과는 COCs의 HS처리는 1및 4시간 동안의 비교적 짧은 시간 동안 처리 하였을 때, 난자의 핵 성숙율에는 유의적 차이가 없는 것으로 관찰되었고(p > 0.05), 12시간의 정상온도에서 전배양하고 HS 을 12시간동안 유도하면, MII기의 출현율이 유의적으로 감소하는 것으로 관찰되었다(p < 0.05).
- 무엇보다 번식 효율의 감소가 수정란의 발생부터 시작되면 대가축의 생산성에 직접적인 타격을 줄 것으로 예상되기에 본 연구에서 혹서기의 체온 상승도과 동일한 조건을 난자의 체외성숙과정에 실시하여 HS의 영향을 조사하였으며 추후 수정란 배양체계 개선 연구를 위한 기본 기술을 확립하고자 실험을 실시하였다. 한우의 경우, 본 연구소의 축군을 대상으로 혹서기 체온 상승 도를 직장내 온도로 측정한 결과에 따르면 혹서기의 체온 상승도는 젖소에 비하여 다소 낮은 것으로 조사되었으며(미 발표자료) 그 이유는 젖소의 경우 평균 체중이 더 높고 표면적이 한우보다 상대적으로 작은 특징에 기인할 것으로 추정되었다.
후속연구
- 그러므로, 한우에 있어서 번식 효율성은 인공수정을 통한 임신율과 체외수 정란 생산 효율에서 점차 문제점이 발생할 것으로 예상된다. 또한, 2016년 하절기 도축장 유래 한우 난소를 관찰할 때, 난포수도 작으며, 난소에서 회수된 난구세포난자복합체 (cumulus oocyte complex; COCs)의 품질 또한 저하되어 체외 수정율과 발생율을 낮아지는 문제가 발생하는 것으로 미루어볼 때, 기후 변화에 따른 번식효율 저하는 명백하게 나타나게될 것으로 추정된다.
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