[논문]다양한 스트레스에 유도되는 들잔디 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 분석

김우남; 송인자; 강홍규; 선현진; 양대화; 이용억; 권용익; 이효연

doi:10.5010/jpb.2017.44.3.220

[국내논문] 다양한 스트레스에 유도되는 들잔디 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 분석
Analysis of ZjWRKY3, ZjWRKY7 induced by multiple stress in Zoysia japonica 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.44 no.3, 2017년, pp.220 - 228

김우남 (제주대학교 생명자원과학대학) , 송인자 (제주대학교 아열대원예산업연구소) , 강홍규 (제주대학교 아열대원예산업연구소) , 선현진 (제주대학교 아열대원예산업연구소) , 양대화 (제주대학교 아열대원예산업연구소) , 이용억 (동국대학교 과학기술대학) , 권용익 (제주대학교 아열대원예산업연구소) , 이효연 (제주대학교 생명자원과학대학)

초록
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식용작물, 사료, 잔디를 포함하는 모든 작물은 건조, 염, 저온, 고온 등의 여러 가지 환경스트레스의 영향을 빈번히 받기 때문에 작물의 생산성이 떨어지게 된다. 식물은 환경스트레스 상황에서 스스로 벗어날 수 없다. 따라서 식물은 환경 스트레스를 극복하는 방향으로 진화하였다. ARF, ABI3, NAC, HSF, WRKY 같은 환경 스트레스에 반응하는 유전자들이 식물에서 보고되었다. 이 유전자들은 환경스트레스에 반응하는 전사인자로, 식물의 스트레스반응 경로에 연관되어 있다. OsWRKY76의 경우에는 저온 및 병원균에 대한 내성을 증가시켰고, AtWRKY28 의 경우 여러 가지 환경스트레스에 관련이 있는 것으로 보고되었다. 들잔디는 정원이나 골프코스에서 가장 흔하게 사용되는 잔디이다. 하지만 들잔디에서는 아직 WRKY 유전자가 알려지지 않았다. 본 연구에서는 들잔디로부터 1개의 WRKY domain을 포함하는 ZjWRKY3, ZjWRKY7 를 분리하였다. ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 저온, 건조, 염 스트레스에 발현이 증가하였다. 들잔디의 갈색퍼짐병을 일으키는 R. solani의 감염이 ZjWRKY3과 ZjWRKY7의 발현을 증가시켰다. 또한 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 Zjchi 유전자 promoter의 W-box에 결합하여 전사를 조절한다는 사실을 확인 하였다. 따라서 ZjWRKY3, ZjWRKY7 유전자는 전사인자로서 환경스트레스 및 병원균 관련 하위 유전자들을 조절할 것으로 예상된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Many crops including cereals, tuber crops, feeds, and turf grasses are often damaged by various environmental stresses such as drought, salt, cold, and high temperature, causing the reduction of their productivity. Plants are sessile and cannot escape from environmental stresses. Thus, plants evolve in the direction of overcoming the environmental stresses. Some plant genes such as ARF, ABI3, NAC, HSF, and WRKY are known to respond to environmental stresses as they transcriptionally regulate the stress response pathways. For example, the OsWRKY76 gene contributes to the enhanced resistance to low temperatures and pathogenic infections. The AtWRKY28 also plays a role in environmental stresses. Zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) is popularly grown for gardens and golf courses. However, the function of the WRKY gene, another environmental stress-related gene, is not known in zoysiagrass. In this study, the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes with one shared WRKY domain have been isolated in zoysiagrass. The expression of these genes increased in response to low temperature, drought, and salt stresses. Furthermore, the infection of the brown patch-causing Rhozoctonia solani induced the expression of ZjWRKY3 and ZjWRKY7. The corresponding proteins bind to the W-box of the Zjchi promoter, possibly regulating their transcriptions. The researchers suggest that the ZjWRKY3 and ZjWRKY7 genes transcriptionally regulate abiotic and biotic stress related downstream genes.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

2016). 본 연구는 다양한 스트레스에 노출되는 들잔디에서 환경스트레스에 관련된 전사인자로 알려진 WRKY 유전자를 분리하여 환경스트레스에 대한 반응을 분석하였다.
또한 간척지 및 해안가의 공원에서도 생존이 요구된다(Kim 2005). 따라서 본 연구에서는 들잔디의 활용에 요구되는 환경조건을 기준으로 들잔디에서 분리한 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 발현을 분석하였다. 저온(4℃)조건에서의 발현을 분석한 결과 ZjWRKY3은 저온 처리 후 24시간 까지 지속적으로 증가하여 대조구를 기준으로 발현이 약 4배 증가하였고, ZjWRKY7은 저온 처리 후 초기에는 큰 변화를 보이지 않았으나 48시간에서 대조구를 기준으로 발현이 약 2배 증가하였다[Fig4A].

제안 방법

) 의 잎을 이용하였다. 먼저 들잔디 종자는 종피를 제거한 후 0.02% Tween20과 2% NaOCl로 20분간 세척한 후 멸균된 증류수로 NaOCl을 씻어내고 1/2 MS배지에 파종 하였다. 애기장대는 상토와 펄라이트를 혼합한 토양에 식재하여 21℃, 장일 조건의 식물생장실에서 관리되었다.
기내 성장된 들잔디 seedling은 4℃에 24시간 처리한 후 WRKY유전자의 cloning을 위하여 수집하였다. 4℃ 처리된 들잔디잎은 수집 즉시 액체질소에 급속 냉각 시켰다.
증폭된 단편 유전자의 sequence에 기반하여, 5’'/3’'- Rapidamplification of cDNA ends (RACE) 는 Full RACE Core Set(Takara) 를 이용하여 수행되었다[Table 1, primer set 3 ~ 11;Table 2, condition 2 ~ 4].
1% Dierhyl pyrocarbonate (DEPC) 용액이 처리된 RNasefree water를 이용하여 녹였다. 이 후, 추출한 total RNA를 1%agarose gel 전기영동을 이용하여 확인하였다. 0.
이 후, 추출한 total RNA를 1%agarose gel 전기영동을 이용하여 확인하였다. 0.5 ul의 oligodT primer, M-MLV 5x reaction buffer, 10 mM dNTP, 25 unit RNasinRibonuclease inhibitor, 200 unit M-MLV reverse transcriptase(Promega), 1 ug의 RNA는 1 st strand cDNA합성을 위하여 사용되었으며, PCR Thermal Cycler Dice (Takara)를 이용하여 증폭하였다[Table 1, primer set 3].
들잔디로부터 WRKY유전자들을 분리하기 위하여 NCBIGeneBank data base는 이용되었다. 먼저 WRKY 단백질의 아미노산 서열을 수집한 후, 보존된WRKY domain으로부터degenerate primer를 제작하였다. 이 후, 합성된 cDNA를 주형가닥으로 이용하여 PCR을 진행하였다[Table 1, primer set 1,2;Table 2, condition 1].
먼저 WRKY 단백질의 아미노산 서열을 수집한 후, 보존된WRKY domain으로부터degenerate primer를 제작하였다. 이 후, 합성된 cDNA를 주형가닥으로 이용하여 PCR을 진행하였다[Table 1, primer set 1,2;Table 2, condition 1].
마지막으로, 5’`/3’`-RACE sequence에 기반하여 두 개의 full-length WRKY 유전자들은 cloning되었다[Table 1, primer set 12, 13; Table 2, condition 5]. 증폭된 모든 products는 pGEM-T easy vector (Promega) 를 이용하여 sequencing하였다.
Phylogenetic tree 분석에는 MEGA 6 program을 이용하였다. NCBI GenBank database를 이용하여 이미 보고된 다른 WRKY의 아미노산 서열을 수집하였으며, 들잔디로부터 분리된 두개의 WRKY유전자와 비교 분석 하였다. 이 후, bioedit progrem을 이용하여 WRKY 아미노산 서열을 정렬하였으며, neighborjoining 방법을 사용하여 phylogenetic tree 분석을 수행하였다.
NCBI GenBank database를 이용하여 이미 보고된 다른 WRKY의 아미노산 서열을 수집하였으며, 들잔디로부터 분리된 두개의 WRKY유전자와 비교 분석 하였다. 이 후, bioedit progrem을 이용하여 WRKY 아미노산 서열을 정렬하였으며, neighborjoining 방법을 사용하여 phylogenetic tree 분석을 수행하였다.분석에 이용된 WRKY는 TaWRKY16 (EU665428), GmWRKY13(DQ322694), AtWRKY18 (JN848519), AtWRKY60 (NM_001335968),OsWRKY76 (BK005079), AtWRKY40 (NM_106732), TaWRKY1 (KT285206), ZmWRKY52 (KJ728370), TaWRKY17 (EU665429),TaWRKY27 (EU665431), NtWRKY1 (AB022693), OsWRKY33(BK005036), TaWRKY13 (EU665426), TaWRKY18 (EU665443),TaWRKY42 (EU665456), TaWRKY5 (EU665434), AtWRKY53(NM_118512), TaWRKY19 (EU665430), AtWRKY6 (HM173628),AtWRKY31 (NM_001341527), AtWRKY42 (NM_001340482) 이다.
들잔디로부터 분리된 두 개의 ZjWRKY 유전자들의 발현분석을 위하여, 기내 배양된 들잔디의 seedling을 이용하였다. 저온에 대한 발현분석은 들잔디 유식물을 4℃에서 2, 12, 24, 48시간 처리한 후 수집 하였다. 염 스트레스와 건조 스트레스 대한 발현 분석은 들잔디 유식물을 배지로부터 조심스럽게 분리한 후, 100 mM NaCl용액과 100 mM Mannitol용액이 담긴50 ml tube에 뿌리가 잠기도록 처리한 후 1, 2, 4, 8, 12시간 간격으로 수집하였다.
저온에 대한 발현분석은 들잔디 유식물을 4℃에서 2, 12, 24, 48시간 처리한 후 수집 하였다. 염 스트레스와 건조 스트레스 대한 발현 분석은 들잔디 유식물을 배지로부터 조심스럽게 분리한 후, 100 mM NaCl용액과 100 mM Mannitol용액이 담긴50 ml tube에 뿌리가 잠기도록 처리한 후 1, 2, 4, 8, 12시간 간격으로 수집하였다. Razoctonia solani에 대한 발현분석은 들잔디 유식물에 균을 접종한 후 24시간 간격으로 수집하였다.
염 스트레스와 건조 스트레스 대한 발현 분석은 들잔디 유식물을 배지로부터 조심스럽게 분리한 후, 100 mM NaCl용액과 100 mM Mannitol용액이 담긴50 ml tube에 뿌리가 잠기도록 처리한 후 1, 2, 4, 8, 12시간 간격으로 수집하였다. Razoctonia solani에 대한 발현분석은 들잔디 유식물에 균을 접종한 후 24시간 간격으로 수집하였다.수집된 모든 샘플로부터 total RNA는 Trizol reagent 이용하여 추출하였으며, M-MLV Reverse transcriptase (Promega) 을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
Razoctonia solani에 대한 발현분석은 들잔디 유식물에 균을 접종한 후 24시간 간격으로 수집하였다.수집된 모든 샘플로부터 total RNA는 Trizol reagent 이용하여 추출하였으며, M-MLV Reverse transcriptase (Promega) 을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 1 ug을 IQtm SYBERGREENsupermix (BIO-RAD)를 이용하여 Real-time PCR을 수행하여 각 스트레스에 대한 발현을 분석하였다[Table 1, primerset 14,15, Table 2 condition 6].
수집된 모든 샘플로부터 total RNA는 Trizol reagent 이용하여 추출하였으며, M-MLV Reverse transcriptase (Promega) 을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 1 ug을 IQtm SYBERGREENsupermix (BIO-RAD)를 이용하여 Real-time PCR을 수행하여 각 스트레스에 대한 발현을 분석하였다[Table 1, primerset 14,15, Table 2 condition 6].
2016). 확인된 pBait-AbAivector를 BstB I을 사용하여 linearization하고 Y1H gold yeaststrain (Clontech)에 형질전환 한 후 PCR을 통하여 유전자의 삽입을 확인 하였다. Full - length ZjWRKY3과 ZjWRKY7을 PCR을 통하여 증폭 하였고 Hind III와 Xho I을 사용하여 pGADT7-ADvector에 삽입하여 실험에 사용하였다.
확인된 pBait-AbAivector를 BstB I을 사용하여 linearization하고 Y1H gold yeaststrain (Clontech)에 형질전환 한 후 PCR을 통하여 유전자의 삽입을 확인 하였다. Full - length ZjWRKY3과 ZjWRKY7을 PCR을 통하여 증폭 하였고 Hind III와 Xho I을 사용하여 pGADT7-ADvector에 삽입하여 실험에 사용하였다. 이전에 준비된 baitstrain을 SD/-Leu/AbA 배지에 plating 하여 테스트하고 baitstrain에 pGADT7-AD vector 를 형질전환 하였다.
Full - length ZjWRKY3과 ZjWRKY7을 PCR을 통하여 증폭 하였고 Hind III와 Xho I을 사용하여 pGADT7-ADvector에 삽입하여 실험에 사용하였다. 이전에 준비된 baitstrain을 SD/-Leu/AbA 배지에 plating 하여 테스트하고 baitstrain에 pGADT7-AD vector 를 형질전환 하였다. 형질전환 반응물을 희석하여 SD/-Leu, SD/-Leu/AbA, SD/AbA200 (for control)배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양 한 후 결과를 확인 하였다.
이전에 준비된 baitstrain을 SD/-Leu/AbA 배지에 plating 하여 테스트하고 baitstrain에 pGADT7-AD vector 를 형질전환 하였다. 형질전환 반응물을 희석하여 SD/-Leu, SD/-Leu/AbA, SD/AbA200 (for control)배지에 도말하고 30℃에서 3일간 배양 한 후 결과를 확인 하였다.
보존된 WRKYdomain 지역을 이용하여 degenerate PCR을 수행 하였고, 그 후3’'/5’' RACE 를 수행하였다.
WRKY family유전자를 클로닝하기 위하여 NCBI를 통하여 기존에 보고된 환경스트레스에 반응하는 다른 작물의 WRKYfamily 유전자들의 염기서열을 수집하였다. 보존된 WRKYdomain 지역을 이용하여 degenerate PCR을 수행 하였고, 그 후3’`/5’` RACE 를 수행하였다.
기존에 보고된 기능이 알려진 다른 작물들의 WRKY유전자들을 NCBI GeneBank에서 수집한 다음, MEGA6 프로그램을 이용하여 Full-length WRKY유전자의 전체 ORF부분을 기존에 기능이 알려진 다른 식물들의 WRKY family유전자들과 분석하였다[Fig. 3]. ZjWRKY3, ZjWRKY7 이외에도 ZjWRKY2,ZjWRKY5, ZjWRKY4 유전자도 분리를 하였지만 본 연구에서는 우선 연구가 진행된 ZjWRKY3, ZjWRKY7만 분석을 진행하였다.
2000). 들잔디에서 분리한ZjWRKY3,ZjWRKY7도 이미 보고된 바와 같이 환경스트레스에 대한 반응여부를 조사하였다. 들잔디를 활용하는 골프장 및 운동장에서 요구되는 조건은 저온에 강하며 건조를 잘 견디는 것이다.
들잔디에서 주요한 병원균의 하나인 갈색퍼짐병(large patch)의 병원균(Rhozoctonia solani)에 대한 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 반응을 조사하였다. R.
앞서 수행한 발현분석 결과에서 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병원균 감염에 의해 발현이 증가되는 경향을 보였다. 따라서 병저항성 유전자로 알려진 zoysiagrass chitinases (Zjchi)의 promoter 지역에 존재하는 W-box와 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 특이적 결합에 대해 yeast one-hybrid system을 사용하여 분석하였다. Prey vector인 pGADT7-AD vector의 GAL4 활성화 도메인과 ZjWRKY3, ZjWRKY7 유전자를 fusion 시킨 후 클로닝 하여 확인하였다.
따라서 병저항성 유전자로 알려진 zoysiagrass chitinases (Zjchi)의 promoter 지역에 존재하는 W-box와 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 특이적 결합에 대해 yeast one-hybrid system을 사용하여 분석하였다. Prey vector인 pGADT7-AD vector의 GAL4 활성화 도메인과 ZjWRKY3, ZjWRKY7 유전자를 fusion 시킨 후 클로닝 하여 확인하였다. 그리고 Bait vector인 pBait-AbAi vector의 Aureobasidin A (AbA) 에 저항성을 나타내는 AUR1-C와 zoysiagrass Zjchi 유전자 promoter지역의 W- box(TTGACC)를 포함하는 약 400 bp의 서열을 fusion 시킨 후 클로닝 하였다.
Prey vector인 pGADT7-AD vector의 GAL4 활성화 도메인과 ZjWRKY3, ZjWRKY7 유전자를 fusion 시킨 후 클로닝 하여 확인하였다. 그리고 Bait vector인 pBait-AbAi vector의 Aureobasidin A (AbA) 에 저항성을 나타내는 AUR1-C와 zoysiagrass Zjchi 유전자 promoter지역의 W- box(TTGACC)를 포함하는 약 400 bp의 서열을 fusion 시킨 후 클로닝 하였다. 그리고 Yeast strain Y1HGold에 형질전환 하였다.
하지만 들잔디에서는 아직 WRKY 유전자가 알려지지 않았다. 본 연구에서는 들잔디로부터 1개의 WRKY domain을 포함하는 ZjWRKY3, ZjWRKY7 를 분리하였다. ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 저온, 건조,염 스트레스에 발현이 증가하였다.

대상 데이터

들잔디는 형질전환이 쉽지 않아서 스트레스 저항성 작물의 개발을 위해 다양한 형질의 잔디를 인위적으로 교배시키는 전통육종방법을 주로 사용해왔지만 원하는 형질을 얻기까지의 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있었다. 1994년 건조에 강한 형질을 얻기 위해 들잔디(Zoysia japonica)와 금잔디(Zoysiamatrella) 등이 교잡된 잔디에서 건조에 강한 들잔디를 조사하여 스트레스저항성 잔디를 선별하였다(Marcum et al. 1994). 그러나 2003년 들잔디의 형질전환 방법이 개발되면서 보다 빠른 방법으로 원하는 형질을 얻을 수 있는 분자육종이 가능하게 되었다(Toyama et al.
본 연구에서 유전자 클로닝을 위하여 난지형 잔디인 들잔디(Zoysia japonica Steud.) 의 잎을 이용하였다. 먼저 들잔디 종자는 종피를 제거한 후 0.
분석에 이용된 WRKY는 TaWRKY16 (EU665428), GmWRKY13(DQ322694), AtWRKY18 (JN848519), AtWRKY60 (NM_001335968),OsWRKY76 (BK005079), AtWRKY40 (NM_106732), TaWRKY1 (KT285206), ZmWRKY52 (KJ728370), TaWRKY17 (EU665429),TaWRKY27 (EU665431), NtWRKY1 (AB022693), OsWRKY33(BK005036), TaWRKY13 (EU665426), TaWRKY18 (EU665443),TaWRKY42 (EU665456), TaWRKY5 (EU665434), AtWRKY53(NM_118512), TaWRKY19 (EU665430), AtWRKY6 (HM173628),AtWRKY31 (NM_001341527), AtWRKY42 (NM_001340482) 이다.
들잔디로부터 분리된 두 개의 ZjWRKY 유전자들의 발현분석을 위하여, 기내 배양된 들잔디의 seedling을 이용하였다. 저온에 대한 발현분석은 들잔디 유식물을 4℃에서 2, 12, 24, 48시간 처리한 후 수집 하였다.
3]. ZjWRKY3, ZjWRKY7 이외에도 ZjWRKY2,ZjWRKY5, ZjWRKY4 유전자도 분리를 하였지만 본 연구에서는 우선 연구가 진행된 ZjWRKY3, ZjWRKY7만 분석을 진행하였다. 그 결과 ZjWRKY7은 TaWRKY16, GmWRKY13, AtWRKY18, AtWRKY60, OsWRKY76, AtWRKY40을 포함하여 group II에 속한 것을 확인할 수 있었고, 이 group II에 속하는 유전자들은 염 스트레스와 삼투 스트레스 등에 반응하는것으로 보고되었다(L.

데이터처리

Phylogenetic tree 분석에는 MEGA 6 program을 이용하였다. NCBI GenBank database를 이용하여 이미 보고된 다른 WRKY의 아미노산 서열을 수집하였으며, 들잔디로부터 분리된 두개의 WRKY유전자와 비교 분석 하였다.

이론/모형

ZjWRKY가 W-box와의 결합 유무를 확인하기 위하여 Yeastone-hybrid assay (Matchmaker® Gold Yeast One-Hybrid LibraryScreening System, Clontech)를 수행 하였다.

성능/효과

마지막으로, 5’'/3’'-RACE sequence에 기반하여 두 개의 full-length WRKY 유전자들은 cloning되었다[Table 1, primer set 12, 13; Table 2, condition 5].
3’'/5’ RACE 결과를 통하여 각 유전자의 full-length 염기서열을 예상할 수 있었고, 이 염기서열을 바탕으로 full-length WRKY유전자를 PCR한 결과 첫번째 단편은 약 1.7 kbp, 두 번째 단편은 약 1 kbp에서 밴드가 형성되었다[Fig. 1A].
1A]. full-length WRKY유전자들의 염기서열을 분석한 결과 첫 번째 단편은 ZmWRKY52와 81%의 상동성을 나타냈으며 ZmWRKY52는 아직까지 기능이 보고되지 않았다[Fig. 2A]. 두 번째 단편은 OsWRKY76과 75%의 상동성을 보였다[Fig.
2013). 따라서 본 연구에서 분리된 두 단편 모두 환경스트레스에 유도되는 WRKY유전자일 것으로 예상하였고, 1702 bp 길이의 첫번째 단편은 ZjWRKY3로, 975 bp 길이의 두 번째 단편은 ZjWRKY7로 명명하였다[Fig. 1B].
따라서 본 연구에서는 들잔디의 활용에 요구되는 환경조건을 기준으로 들잔디에서 분리한 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 발현을 분석하였다. 저온(4℃)조건에서의 발현을 분석한 결과 ZjWRKY3은 저온 처리 후 24시간 까지 지속적으로 증가하여 대조구를 기준으로 발현이 약 4배 증가하였고, ZjWRKY7은 저온 처리 후 초기에는 큰 변화를 보이지 않았으나 48시간에서 대조구를 기준으로 발현이 약 2배 증가하였다[Fig4A]. 건조에 대한 반응을 분석하기 위해 건조와 동일한 효과를 보이는 mannitol을 처리한 결과 ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 각각 2시간, 8시간 후에 발현이 약 1.
저온(4℃)조건에서의 발현을 분석한 결과 ZjWRKY3은 저온 처리 후 24시간 까지 지속적으로 증가하여 대조구를 기준으로 발현이 약 4배 증가하였고, ZjWRKY7은 저온 처리 후 초기에는 큰 변화를 보이지 않았으나 48시간에서 대조구를 기준으로 발현이 약 2배 증가하였다[Fig4A]. 건조에 대한 반응을 분석하기 위해 건조와 동일한 효과를 보이는 mannitol을 처리한 결과 ZjWRKY3과 ZjWRKY7은 각각 2시간, 8시간 후에 발현이 약 1.5배 증가하였다[Fig. 4B].염에 대한 반응은 ZjWRKY3은 2시간 후에 발현이 약 2배 증가하였고, ZjWRKY7은 8시간후에 발현이 약 4배 증가하였다[Fig.
ZjWRKY3, ZjWRKY7 모두 저온 스트레스를 처리했을 때 시간이 지남에 따라 발현양이 증가하였다. ZjWRKY3은 건조, 염 스트레스 처리 시 2시간 후에 발현양이 소폭 증가하였고, ZjWRKY7은 건조, 염 스트레스 처리 시 8시간 후에 발현양이 증가하였다. 본 결과로 ZjWRKY3, ZjWRKY7 모두 저온, 건조, 염의 조건에서 발현이 증가한 결과는 이미 알려진WRKY와 동일하게 환경스트레스의 저항성에 기여할 것으로 예상된다.
ZjWRKY3은 건조, 염 스트레스 처리 시 2시간 후에 발현양이 소폭 증가하였고, ZjWRKY7은 건조, 염 스트레스 처리 시 8시간 후에 발현양이 증가하였다. 본 결과로 ZjWRKY3, ZjWRKY7 모두 저온, 건조, 염의 조건에서 발현이 증가한 결과는 이미 알려진WRKY와 동일하게 환경스트레스의 저항성에 기여할 것으로 예상된다. 특히 ZjWRKY3은 ZjWRKY7 보다 빠른 시간에 발현양이 증가한 것으로 보아 ZjWRKY3이 환경스트레스에 더 중요한 역할을 할 것으로 예상된다.
5]. R. solani를 처리한 결과에서는ZjWRKY3, ZjWRKY7 모두 발현양이 증가하였고, 특히 ZJWRKY7은 ZjWRKY3 비해 발현양이 약 10배 이상 증가하였다. ZjWRKY7과 상동성이 가장 높은 OsWRKY76은 벼 도열병에 대한 내성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Naoki et al.
2001). 앞서 수행한 발현분석 결과에서 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병원균 감염에 의해 발현이 증가되는 경향을 보였다. 따라서 병저항성 유전자로 알려진 zoysiagrass chitinases (Zjchi)의 promoter 지역에 존재하는 W-box와 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 특이적 결합에 대해 yeast one-hybrid system을 사용하여 분석하였다.
선별마커 AbA를 넣은 SD/-Leu/AbA배지에서는pGADT7-WRKY3/WRKY7과 pBait-W-box를 같이 넣은 경우에만 효모가 증식 하였다. 반면에 pGADT7-WRKY3/WRKY7 만 넣은 경우와 pBait-W-box만 넣은 경우에 효모가 자라지 않았음을 확인할 수 있었다. 음성대조구로 사용 된 pBait-AbAi, pGADT7-AD만 넣은 경우에서는 효모가 증식하지 않았으며, AbA를 넣지 않은 양성대조 구에서는 모두 효모가 증식하였다[Fig.
ZjWRKY3, ZjWRKY7은 들잔디의 병원균인R. solani에 의해 발현량이 증가하였으며 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병저항성 유전자 Zjchi 의 프로모터 W-box에 결합한 결과는 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병원균을 인식하여 전사인자로 병저항성 유전자를 발현시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서 들잔디에서 분리한ZjWRKY3, ZjWRKY7은 이미 보고된 WRKY와 동일하게 환경 및 병에 대한 저항성 유도에 중요한 역할을한다고 판단한다.
solani에 의해 발현량이 증가하였으며 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병저항성 유전자 Zjchi 의 프로모터 W-box에 결합한 결과는 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 병원균을 인식하여 전사인자로 병저항성 유전자를 발현시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서 들잔디에서 분리한ZjWRKY3, ZjWRKY7은 이미 보고된 WRKY와 동일하게 환경 및 병에 대한 저항성 유도에 중요한 역할을한다고 판단한다.
solani의 감염이 ZjWRKY3과 ZjWRKY7의 발현을 증가시켰다. 또한 ZjWRKY3, ZjWRKY7이 Zjchi 유전자 promoter의 W-box에 결합하여 전사를 조절한다는 사실을 확인 하였다. 따라서 ZjWRKY3, ZjWRKY7 유전자는 전사인자로서 환경스트레스 및 병원균 관련 하위 유전자들을 조절할 것으로 예상된다.
R. solani을 처리한 결과 ZjWRKY3은 처리 후 3일부터 증가하여 4일에 대조구 기준으로 발현이 약 2.5배 증가하였고, ZjWRKY7은 처리 후 지속적으로 증가하여 3일부터 4일까지 급속도로 증가하여 대조구 기준으로 발현이 약 35배 증가하였다[Fig. 5].

후속연구

특히 ZjWRKY3은 ZjWRKY7 보다 빠른 시간에 발현양이 증가한 것으로 보아 ZjWRKY3이 환경스트레스에 더 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. ZjWRKY7이 건조, 염 스트레스에서 발현양의 증감을 반복한 이유에 대해서는 추후연구가 필요하다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	환경 스트레스에 반응하는 유전자들에는 어떤 것들이 있는가?	따라서 식물은 환경 스트레스를 극복하는 방향으로 진화하였다. ARF, ABI3, NAC, HSF, WRKY 같은 환경 스트레스에 반응하는 유전자들이 식물에서 보고되었다. 이 유전자들은 환경스트레스에 반응하는 전사인자로, 식물의 스트레스반응 경로에 연관되어 있다.
	식물들이 가뭄, 저온, 고온 같은 다양한 환경 스트레스로 인해 어떤 영향을 받는가?	1988). 이로 인하여 생장지연, 종자생산량 감소, 잎의 노화 등이 대표적으로 관찰되며, 작물의 상품 가치를 떨어뜨리고 작물의 생산량을 감소시키는 주요원인이 된다. 특히 잔디와 같은 조경 식물은 공원, 스포츠 공원, 골프장 등에 식재 되어 일반작물보다 지속적으로 더 많은 환경스트레스에 노출되는 경우가 많다.
	잔디에 발생하는 병에는 어떤 것들이 있는가?	또한 잔디에 발생하는 병으로 인해서 시각적 효과감소, 골프장에서는 매출 감소로 이어진다. 잔디에 발생하는 병은 갈색 퍼짐 병(largepatch), 동전 마름병(dollar spot), 피시움마름병(Pythium blight),갈색 마름병(brown patch), 탄저병(anthracnose), 황색엽부병(yellow patch)등 약 10여종이 알려져 있으며, 들잔디의 경우에는 Rhozoctonia solani AG-2-2 (IV)에 의하여 발생하는 갈색 퍼짐 병이 가장 큰 문제가 되고 있다(Jung et al. 2008).

참고문헌 (22)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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