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문제 정의
- 본 연구에서는 농약 사용량을 저감시키고 곰팡이 병원균에 의한 발병률을 낮추어 방대한 지역의 잔디를 구제하기 위해 PR-protein 중 하나인 β-1,3-glucanase유전자를 클로닝하여 들잔디 형질전환을 위한 검증을 하였다.
제안 방법
- 한국형 들잔디에 존재하는 β-1,3-glucanase 유전자의 분리는 계통학적으로 근연관계가 가까운 단자엽 식물인 옥수수, 밀, 보리, 벼에서 이미 β-1,3-glucanase 유전자들의 기능분석이 되어있는 염기서열을 이용하여 유사성이 높은 부분에서 특이적primer를 제작하였다(Table 1).
- 프로모터 작동을 유도하기 위해 균농도가 OD600 = 0.5~0.6이 되었을 때 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 0.1, 0.5, 1 mM 농도로 넣은 후 배양온도를 18, 25, 37°C로 설정하여 배양 후 각 조건별로 균을 수확하였다.
- DNA-free kit (Ambion,미국)을 사용하여 섞여있는 DNA를 제거한 total RNA에 OligodT primer (dT15)를 0.5 ug 넣고 70°C에서 5분간 가열 한 후 얼음에 식히고, RNasin Ribonuclease inhibitor 25 unit, RTase 200 unit, 5x reaction buffer, dNTP 혼합액을 섞어 42°C에서 90분간 반응시킴으로써 1쇄 cDNA를 합성하였다.
- 분리된 유전자는 Gene Fishing™ DEG Kits (씨젠, 한국)에 제공된 adaptor서열이 달린 oligo dT primer (Table 1)을 이용하여 cDNA를 합성한 후, pGEM T-easy vector system을 이용하여 β-1,3-glucanase의 full-length cDNA sequence를 얻어냈다.
- 클로닝이 끝난 β-1,3-glucanase의 아미노산서열을 NCBI 에서 blast한 후 상동성이 높은 단자엽과 쌍자엽 식물인 Setaria italica (XM_004971176.1), Phyllostachys edulis (FP092366.1), Triticum aestivum (Y18212.1), Oryza sativa (AF443600.1), Secale cereal (AM181309.1), Hordeum vulgare (M23548.1), Avena sativa (AF155932.1), Zea mays (HM641756.1), Brachypodium distachyon (XM_003565006.1), Arabidopsis thaliana (NC_003074.8), Capsella rubella (XM_006291382.1), Brassica rapa (XM_009118181.1), brassica oleracea (EF484879.1), Brassica juncea (DQ359126.1), Citrus sinensis (XM_006491438.1), Citrus unshiu (EF121321.1), Arabidopsis lyrata (XM_002878094.1), Prunus persica (AAL30426.1), Malus hupehensis (ADR71671.1) 등으로부터 β-1,3-glucanase의 아미노산서열을 확보하여 ZjGlu1와의 비교하였다.
- 식물체는 상토와 모래를 약 5:1로 혼합한 토양에 식재하여 자연채광의 유리온실에 있는 들잔디의 식물체의 flower, blade, sheath, stolon, root에서 total RNA를 추출하였다. DNA-free kit (Ambion,미국)을 사용하여 섞여있는 DNA를 제거한 total RNA에 OligodT primer (dT15)를 0.
- 재조합 들잔디 β-1,3-glucanase단백질을 정제하기 위해 E.coli의 단백질 발현 시스템을 이용하였으며, 발현 및 정제를 위한 벡터로는 GST (Glutathione-S-Transferase)tag을 가지고 있는 pGEX4T-1 (Novagen,독일)을 사용하였다(Fig. 4).
- 디스크 방산법을 이용한 항균활성 검정을 위해 PDA배지에 paper disk를 치상하고 디스크당 정제한 ZjGlu1 단백질을 236 ug과 PBS buffer를 control로 점적 한 후 중앙에 시험균주를 치상하고 25°C에서 암배양 하며 균사의 생장을 관찰하여 항균활성을 비교하였다.
- 13000 rpm에서 30분간 원심분리하여 불용성의 단백질들을 제거하고 상층액으로부터 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, 미국)를 이용하여 GST-tag이 fusion된 β-1,3-glucanase단백질을 정제하였다.
- 유전자의 도입을 위해 pGEX4T-1의 MCS지역에 5'-BamH 1, 3'-Not 1 제한효소 인식부위를 이용하여 신호서열이 제외된 단백질 부위를 암호화하는 ZjGlu 1염기서열을 도입하였으며, TA 클로닝을 수행하여 pGEX 4T-1벡터 안에 β1,3-glucanase 서열이 돌연변이가 일어나지 않고 온전히 삽입이 되었는지 확인하였다.
- 얻어진 단백질 추출물을 SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 발현의 유도 및 수용성여부를 판단하였다. 겔의 Acrylamide농도는 Stocking gel 3%, Separation gel 12%로 하였으며 영동 후 0.
- 13000 rpm에서 30분간 원심분리하여 불용성의 단백질들을 제거하고 상층액으로부터 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, 미국)를 이용하여 GST-tag이 fusion된 β-1,3-glucanase단백질을 정제하였다. 정제 방법은 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, 미국)에 있는 procotol을 따랐으며 Elution buffer의 조성은 50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH8.0으로 사용하였다.
- NCBI에서, 클로닝된 ZjGlu1의 아미노산 sequence를 blast한 결과 Glycosyl hydrolases family 17에 속하였으며, VSESGWPSAG서열을 보존하고 있어 glycosyl hydrolase motif (LGIVISESGWPSAG)와 비교해 봤을 때 상당부분 일치하는 것을 보였다. 신호서열 분석을 위하여 Protcomp와 Plant mPloc 두 개의 소프트웨어를 사용하였다. Protcomp에서 ZjGlu1이 액포와 세포외에 존재하고, Plant mPloc에서는 액포에 존재하는 것으로 예측하였다.
- 신호서열 분석을 위하여 Protcomp와 Plant mPloc 두 개의 소프트웨어를 사용하였다. Protcomp에서 ZjGlu1이 액포와 세포외에 존재하고, Plant mPloc에서는 액포에 존재하는 것으로 예측하였다.
- 다양한 식물체와 들잔디 β-1,3-glucanase의 계통도 분석을 위해 NCBI에서 Blastx를 통해 ZJGlu1의 sequence 상동성이 가장 높은 β-1,3-glucanase중 클로닝 및 기능분석이 된 쌍자엽과 단자엽식물의 amino acid sequence와 alignment하고 MEGA 6.0의 Neighbor joining algorithm을 이용하여 Phylogenetic tree를 분석하였다(Fig. 2).
- 한국형 들잔디에서 가장 문제가 되고 있는 라이족토니아잎마름병(라지패취)의 병원균인 Rhizoctonia solani AG2-2(IV)에 대한 내병성을 가지고 있는 형질전환 들잔디를 개발하기 위해 β-1,3-glucanase를 클로닝하였다.
- GST-β-1,3-glucanase fusion protein은 60 kDa의 크기이며, thrombin을 처리한 후 GST를 제거한 순수한 β-1,3-glucanase protein을 정제하여 항균활성 테스트를 하는데 이용하였다.
- 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2 (IV)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 β-1,3-glucanase를 들잔디로부터 클로닝 하였다.
- β-1,3-glucanase 단자엽식물 중 내병성에 대한 연구가 되어있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 클로닝 하였다.
- β-1,3-glucanase 단자엽식물 중 내병성에 대한 연구가 되어있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 클로닝 하였다. E.coli overexpression을 수행하여 목표 단백질을 대량 정제하여 invitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다.
- coli overexpression을 수행하여 목표 단백질을 대량 정제하여 invitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R.
대상 데이터
- 상기 균주들은 균사체 조각을 PDA (Potato Dextrose Agar) plate에 25°C, 암조건으로 유지되는 growth chamber에서 약 14일간 배양한 후 실험에 사용하였다.
- , Rhizoctonia cerealis, Rhizoctonia solani AG 2-2(IV), Rhizoctonia solani AG 2-2(IIIB), Rhizoctonia solani AG-1(1A), Rhizoctonia solani AG-1(1B) 등 9개의 균주를 β-1,3-glucanase의 항균 활성 측정하는데 이용하였다.
- 야외 온실에서 생육된 들잔디(Zoysia japonica S. var 덕창)의 뿌리와 잎을 β-1,3-glucanase 유전자의 클로닝에 이용하였다.
- 5 ug 넣고 70°C에서 5분간 가열 한 후 얼음에 식히고, RNasin Ribonuclease inhibitor 25 unit, RTase 200 unit, 5x reaction buffer, dNTP 혼합액을 섞어 42°C에서 90분간 반응시킴으로써 1쇄 cDNA를 합성하였다. RTase는 Promega (미국) 사에서 판매하는 Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT)를 사용하였다.
데이터처리
- 사용한 program은 BioEdit ver 7.7.0 (www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)의 ClustalW Multiple alignment 알고리즘을 이용하여 비교 분석하였으며, Alignment 결과를 fasta file로 저장 한 후 MEGA 6.0 (www.Megasoftware.net/mega.php)에서 불러오기하여 Neightbor-joing method를 통해 계통수로 전환하여 분석하는데 이용하였다.
이론/모형
- 들잔디의 total RNA는 ChomczynskiP and SacchiN.1987의 방법에 따라 trizol reagent (MRC,미국)를 이용하여 추출하였으며, 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 β-1,3-glucanase 유전자가 분리되었다.
- 유전자의 도입을 위해 pGEX4T-1의 MCS지역에 5`-BamH 1, 3`-Not 1 제한효소 인식부위를 이용하여 신호서열이 제외된 단백질 부위를 암호화하는 ZjGlu 1염기서열을 도입하였으며, TA 클로닝을 수행하여 pGEX 4T-1벡터 안에 β1,3-glucanase 서열이 돌연변이가 일어나지 않고 온전히 삽입이 되었는지 확인하였다. 완성된 vector는 E.coli DE3 (BL21) 균주에 Heat-shock 방법을 통해 도입하여 100 mg/L Ampicillin이 포함된 Luria-Bertani (LB, Sigma, 미국) 고체 배지에 선발하였다.
- 2 Phylogenetic tree of deduced sequences of β-1,3-glucanase genes from plants. Plyogenetic analysis was generated using MEGA 5.0 by the neighbor -joing method. One gene from zoysia japonica steud.
성능/효과
- 본 연구에서는 농약 사용량을 저감시키고 곰팡이 병원균에 의한 발병률을 낮추어 방대한 지역의 잔디를 구제하기 위해 PR-protein 중 하나인 β-1,3-glucanase유전자를 클로닝하여 들잔디 형질전환을 위한 검증을 하였다. 더불어, ZjGlu1 효소의 기능을 확인하고자 항균활성 테스트를 진행 한 결과 몇 개의 균주에서 항균활성을 보여 후에 형질전환 식물체에도 곰팡이 병원균에 대한 활성이 있을 것으로 예측이 된다.
- 99로 계산되었다. NCBI에서, 클로닝된 ZjGlu1의 아미노산 sequence를 blast한 결과 Glycosyl hydrolases family 17에 속하였으며, VSESGWPSAG서열을 보존하고 있어 glycosyl hydrolase motif (LGIVISESGWPSAG)와 비교해 봤을 때 상당부분 일치하는 것을 보였다. 신호서열 분석을 위하여 Protcomp와 Plant mPloc 두 개의 소프트웨어를 사용하였다.
- ZjGlu1의 Full-length 염기서열은 Phyllostachys edulis (FP092366.1)와 82%, Oryza sativa (AF443600.1)와 81% 상동성을 보였다(Fig. 1). 다양한 식물체와 들잔디 β-1,3-glucanase의 계통도 분석을 위해 NCBI에서 Blastx를 통해 ZJGlu1의 sequence 상동성이 가장 높은 β-1,3-glucanase중 클로닝 및 기능분석이 된 쌍자엽과 단자엽식물의 amino acid sequence와 alignment하고 MEGA 6.
- ZjGlu1의 정제를 위해 벡터 균주, IPTG 농도, 발현 유도 후 배양시간 등 여러가지 최적의 조건을 찾기 위해 테스트를 한 결과, DE3 (BL21)균주를 이용하여 pGEX 4T-1벡터에서 37°C에서 OD600=0.6까지 자랐을 때 IPTG농도가 0.5 mM이 되도록 넣고 18°C에서 6시간 가량 배양하였을 때 insoluble protein보다 대부분 soluble protein으로 가는 것을 SDS-PAGE를 통해 가장 높은 수율로 단백질을 얻을 수 있는 것으로 확인 되었다(Fig. 4).
- 2011). ZjGlu1의 잔디 기관별 발현량을 분석하기 위해서 RT-PCR을 수행한 결과 잎과 꽃, 줄기, 뿌리, stolon의 모든 기관에서 발현됨을 확인하였다(Fig. 3).
- 재조합 단백질의 항균활성을 검정하기 위해 정제된 ZjGlu1 단백질과 Rhizoctonia solani AG2-2 (IV)외 9종의 균주를 고체배지에 올려 관찰한 결과 모든 균주에 대해 활성을 보이지는 않았으나 한국 잔디류를 기주로 발생하는 봄 마름병(춘고병), 황색마름병(옐로우패취)를 일으키는 R. cerealis와, foot and root rot과 head bright를 일으키는 F.culmorum, 갈색잎 마름병(브라운패취)을 일으키는 R.solani AG-1 (1B) (Kim et al. 2013), 그리고 푸른곰팡이의 한 종류인 T.atroviride 등 4개의 균주에서 항균활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 균주가 커 가는 것을 매 시간 관찰한 결과 조금 더 높은 농도의 ZjGlu1 protein을 치상하였을때에 다른 균주에 대해서도 활성이 있을 것으로 기대가 되므로 ZjGlu1 protein의 농도를 더 높여서 실험해 볼 필요성이 있다고 사료된다.
- 또한, ZjGlu1유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R. cerealis, F. culmorum, R.solani AG-1 (1B), T. atroviride 에서 항균활성을 보였으며, 형질전환체를 이용해 18s 유전자의 발현량을 상대로 한 각 유전자의 기관별 발현량은 크게 차이없이 모든기관에 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 5). 균주가 커 가는 것을 매 시간 관찰한 결과 조금 더 높은 농도의 ZjGlu1 protein을 치상하였을때에 다른 균주에 대해서도 활성이 있을 것으로 기대가 되므로 ZjGlu1 protein의 농도를 더 높여서 실험해 볼 필요성이 있다고 사료된다. 그리고 Fungi 균주 4개에 대해서 활성을 확인하였으므로 들잔디의 형질전환체에서도 항균활성이 있을 것으로 기대 할 수 있을 것으로 판단된다.
- 균주가 커 가는 것을 매 시간 관찰한 결과 조금 더 높은 농도의 ZjGlu1 protein을 치상하였을때에 다른 균주에 대해서도 활성이 있을 것으로 기대가 되므로 ZjGlu1 protein의 농도를 더 높여서 실험해 볼 필요성이 있다고 사료된다. 그리고 Fungi 균주 4개에 대해서 활성을 확인하였으므로 들잔디의 형질전환체에서도 항균활성이 있을 것으로 기대 할 수 있을 것으로 판단된다.
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