[국내논문]Lactobacillus pentosus 발효에 의한 담쟁이덩굴 줄기 추출물의 항산화 및 세포보호 효과 Antioxidant and Cellular Protective Effects of Parthenocissus tricuspidata Stem Extracts Fermented by Lactobacillus pentosus원문보기
본 연구에서는 담쟁이덩굴 줄기 70% 에탄올 추출물과 발효균주 Lactobacillus pentosus를 이용하여 발효시킨 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물에 대하여 항산화 및 세포보호 효과를 측정하였다. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용한 자유라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물이 각각 42.3 및 $34.5{\mu}g/mL$로 발효 후의 라디칼 소거활성이 약 18.4% 더 높게 나타났다. Lumiol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$계에서의 총 항산화능($OSC_{50}$) 평가에서도 담쟁이덩굴 줄기 추출물과 발효추출물은 각각 2.6 및 $2.5{\mu}g/mL$로 발효 후가 약 4.2% 정도 더 높은 총 항산화능을 나타냈다. $^1O_2$로 유도된 적혈구 세포 손상에 있어서 추출물 및 발효추출물의 세포 보호 효과(${\tau}_{50}$)는 $50{\mu}g/mL$에서 각각 126.4 및 173.0 min을 나타내어 발효 후 세포 보호 효과가 약 34.0% 더 높게 나타났다. 발효추출물은 지용성 항산화제로 알려진 $(+)-{\alpha}$-tocopherol (43.4 min)보다도 3.9배 높은 세포 보호 활성을 보여주었다. 사람 섬유아세포인 Hs68을 대상으로 elastase 저해 활성을 조사하였다. Elastase 저해 활성($IC_{50}$)은 담쟁이덩굴 줄기 추출물과 발효추출물에서 각각 873.6 및 $687.8{\mu}g/mL$로 발효 후에 elastase 저해 활성이 약 21.3% 더 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과들은 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물이 항산화 작용과 더불어 주름개선 효과를 가지는 천연 화장품 소재로써 응용 가능성이 있음을 시사한다.
본 연구에서는 담쟁이덩굴 줄기 70% 에탄올 추출물과 발효균주 Lactobacillus pentosus를 이용하여 발효시킨 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물에 대하여 항산화 및 세포보호 효과를 측정하였다. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 이용한 자유라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물이 각각 42.3 및 $34.5{\mu}g/mL$로 발효 후의 라디칼 소거활성이 약 18.4% 더 높게 나타났다. Lumiol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$계에서의 총 항산화능($OSC_{50}$) 평가에서도 담쟁이덩굴 줄기 추출물과 발효추출물은 각각 2.6 및 $2.5{\mu}g/mL$로 발효 후가 약 4.2% 정도 더 높은 총 항산화능을 나타냈다. $^1O_2$로 유도된 적혈구 세포 손상에 있어서 추출물 및 발효추출물의 세포 보호 효과(${\tau}_{50}$)는 $50{\mu}g/mL$에서 각각 126.4 및 173.0 min을 나타내어 발효 후 세포 보호 효과가 약 34.0% 더 높게 나타났다. 발효추출물은 지용성 항산화제로 알려진 $(+)-{\alpha}$-tocopherol (43.4 min)보다도 3.9배 높은 세포 보호 활성을 보여주었다. 사람 섬유아세포인 Hs68을 대상으로 elastase 저해 활성을 조사하였다. Elastase 저해 활성($IC_{50}$)은 담쟁이덩굴 줄기 추출물과 발효추출물에서 각각 873.6 및 $687.8{\mu}g/mL$로 발효 후에 elastase 저해 활성이 약 21.3% 더 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과들은 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물이 항산화 작용과 더불어 주름개선 효과를 가지는 천연 화장품 소재로써 응용 가능성이 있음을 시사한다.
In this study, the antioxidant activities, cellular protective effects, and inhibitory effects on elastase of non-fermented and fermented extracts of Parthenocissus tricuspidata (P. tricuspidata) stem using Lactobacillus pentosus were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{...
In this study, the antioxidant activities, cellular protective effects, and inhibitory effects on elastase of non-fermented and fermented extracts of Parthenocissus tricuspidata (P. tricuspidata) stem using Lactobacillus pentosus were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 42.3 and $34.5{\mu}g/mL$, respectively, in which the activity after fermentation was approximately 18.4% higher. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system of non-fermented and fermented extracts were 2.6 and $2.5{\mu}g/mL$, respectively. The activity after fermentation was approximately 4.2% higher. In the $^1O_2$-induced cellular damage of erythrocytes, the cellular protective effects (${\tau}_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 126.4 and 173.0 min at $50{\mu}g/mL$, respectively. The activity after fermentation was approximately 34.0% higher. The effect of fermented extract was 3.9 times higher than $(+)-{\alpha}$-tocopherol (${\tau}_{50}=43.4min$), known as a lipophilic antioxidant at $50{\mu}g/mL$. The inhibitory effect of elastase was investigated to predict the anti-wrinkle efficacy using Hs68 human fibroblasts cells. The elastase inhibitory activities ($IC_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 873.6 and $687.8{\mu}g/mL$, respectively, and the activity after fermentation was approximately 21.3% higher. These results indicated that fermented extract of P. tricuspidata stem has potentials as natural cosmetic ingredients with antioxidant and anti-wrinkle effect.
In this study, the antioxidant activities, cellular protective effects, and inhibitory effects on elastase of non-fermented and fermented extracts of Parthenocissus tricuspidata (P. tricuspidata) stem using Lactobacillus pentosus were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 42.3 and $34.5{\mu}g/mL$, respectively, in which the activity after fermentation was approximately 18.4% higher. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system of non-fermented and fermented extracts were 2.6 and $2.5{\mu}g/mL$, respectively. The activity after fermentation was approximately 4.2% higher. In the $^1O_2$-induced cellular damage of erythrocytes, the cellular protective effects (${\tau}_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 126.4 and 173.0 min at $50{\mu}g/mL$, respectively. The activity after fermentation was approximately 34.0% higher. The effect of fermented extract was 3.9 times higher than $(+)-{\alpha}$-tocopherol (${\tau}_{50}=43.4min$), known as a lipophilic antioxidant at $50{\mu}g/mL$. The inhibitory effect of elastase was investigated to predict the anti-wrinkle efficacy using Hs68 human fibroblasts cells. The elastase inhibitory activities ($IC_{50}$) of non-fermented and fermented extracts were 873.6 and $687.8{\mu}g/mL$, respectively, and the activity after fermentation was approximately 21.3% higher. These results indicated that fermented extract of P. tricuspidata stem has potentials as natural cosmetic ingredients with antioxidant and anti-wrinkle effect.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물에 대하여 자유라디칼 소거 활성, Fe3+-EDTA/H2O2계에서 생성된 활성산소종에 대한 총항산화능, 1O2으로 유도된 세포 손상에 대한 세포보호효과를 조사하고, Hs68 사람 섬유아세포를 이용한 elastase 저해 활성을 측정하여 담쟁이덩굴 발효추출물이 항산화 및 항노화 소재로서 화장품에의 응용 가능성이 있는지를 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 Fe3+-EDTA/H2O2계를 이용하여 다양한 종류의 활성산소를 발생시키고 이들 소거 활성을 측정하였다. 철(Fe)과 구리(Cu) 같은 전이금속 이온들은 생체 내에도 존재하며 자외선에 의해 생성된 H2O2와 Fenton 반응을 일으켜 다양한 활성산소종이 생성된다.
특히 1O2은 광증감 반응의 주생성물이며 반응성이 매우 큰 활성산소로 세포막에 침투하여 인지질 및세포 구성성분들의 자동산화반응을 개시하여 세포막파괴 및 세포 손상을 야기하게 된다. 본 연구에서는 세포막의 지질 이중층과 유사한 적혈구 세포를 이용하여구축된 세포 보호 효과 측정 시스템으로 1O2로 유도된세포손상에 대한 보호효과를 평가하고자 하였다. 광증감제로써 rose-bengal을 사용하여 1O2을 발생시키고, 적혈구 세포의 용혈 정도를 통해 이를 판단하였다.
제안 방법
발효 유산 균주는 여러 미생물 중에서 bromo-phenol blue (BPB)를 이용한 산 생성 균주 선발[15], es-culin agar 방법을 통한 β-glucosidase를 생성하는 균주 선발[16], ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (ρNPG) 방법을 이용한 glucosidase 활성 균주 선발[17] 과정을 거쳐 최종 β-glucosidase 고역가 균주인 Lactobacillus pentosus (L. pentosus)를 선정하였으며 colony PCR을 이용한 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 유산균주 동정[18]으로부터 L. pentosus D79211 [19]와 99%의 상동성을 확인하였다.
pentosus D79211 [19]와 99%의 상동성을 확인하였다. 발효는 1% glucose를 함유한 액상 발효 방법을 사용하였다. 액상배양은 최소한의 영양원으로 1% glucose를 첨가한 증류수에 70% 에탄올 추출물 파우더를 1% 농도가 되도록 첨가한 후, au-toclave를 통해 멸균하고 발효 균주 L.
발효는 1% glucose를 함유한 액상 발효 방법을 사용하였다. 액상배양은 최소한의 영양원으로 1% glucose를 첨가한 증류수에 70% 에탄올 추출물 파우더를 1% 농도가 되도록 첨가한 후, au-toclave를 통해 멸균하고 발효 균주 L. pentosus seed 3%로 첨가하여 37 ℃에서 5일간 발효를 진행하였다. 이를 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물이라고 칭하였다.
생체에서 유리라디칼은 홀수 전자를 가지고 있는 화학종으로 매우 불안정한 상태이며 지질연쇄반응을 일으켜 세포를 손상시킬 수 있다. 비교적 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 천연물의 전자주개 작용에 의한 환원력을 나타내는 라디칼 소거활성을 측정하였다. 실험 방법은 메탄올에 용해시킨 0.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL를 혼합하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 공시험(blank), 시료를 넣지 않은 것을 대조군(control), 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 계산하였다. 자유라디칼 소거활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였으며, 자유라디칼(DPPH) 소거활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O 대신 증류수를 첨가 하였다.
담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈 되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다.
암소에서 30 min 간 pre-in-cubation시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (12 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 15 min 동안 광 조사 하였다.
화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 시간 간격으로 700 nm에서의 투광도(transmittance, %)를 통해 평가하였다. 적혈구 현탁액 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
사람 Hs68 섬유아세포(USA, CRL-1635TM)를 사용하여 elastase 저해 활성을 측정하였다[20,21]. 배양된 세포의 배양액을 제거한 후 phosphate-buffered saline(PBS)으로 세척하였다.
이후 37 ℃에서 90 min 동안 반응 후 405 nm에서 ELISA reader로 측정하였다. 대조군(control)은 시료 대신에 시료용액으로 사용된 용매만 넣었고, 공시험(blank)은 실험군(experiment)과 조건이 동일하나 elastase 용액 대신 Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 첨가하였다. Elastase 저해 활성은 elastase의 활성을 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도(inhibition con-centration, IC50)로 표기하였다.
수율은 건조된 담쟁이덩굴 줄기 무게를 기준으로 계산하였다(Table 1). 담쟁이덩굴 줄기 70% 에탄올 추출물 파우더의 수율은 10.
이와 같이 전자를 제공함으로써 라디칼을 소거하는 능력인 환원력을 통해서 시료의 자유라디칼 소거활성 FSC50을 측정할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 비교적 안정한 라디칼로 존재하는 DPPH를 이용하여 담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물의 라디칼 소거 활성을 측정하였다.
이 계에 항산화제를 첨가하여 화학발광이 감소하는 정도에 따라 활성산소 소거 활성을 측정할 수 있다. 이를 이용하여 총 항산화능 OSC50을 평가하였다. 활성산소가 50% 감소하는 농도인 OSC50은 담쟁이덩굴 줄기 추출물이 2.
본 연구에서는 세포막의 지질 이중층과 유사한 적혈구 세포를 이용하여구축된 세포 보호 효과 측정 시스템으로 1O2로 유도된세포손상에 대한 보호효과를 평가하고자 하였다. 광증감제로써 rose-bengal을 사용하여 1O2을 발생시키고, 적혈구 세포의 용혈 정도를 통해 이를 판단하였다.
대상 데이터
라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhy-drazyl (DPPH) radical, 화학발광 실험에 사용한 luminol과 ethylenediaminetetraacetic aicd (EDTA), H2O2, L-as-corbic acid, 세포보호효과 측정에 사용한 heparin, rose-bengal, (+)-α-tocopherol, 그리고 elastase 저해활성에 사용한 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 및 oleanolic acid는 Sigma-Aldrich (Korea)에서 구입하였다.
(Japan)에서 구입하였고, 에탄올 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, 적혈구 광용혈 실험에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을, pH 미터는 Hanna (Korea)사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용한 담쟁이덩굴 줄기는 2017년 1월경 서울 경동시장에서 국내에서 채취된 것을 구입 사용하였다.
(USA) 제품을, pH 미터는 Hanna (Korea)사의 제품을 사용하였다. 실험에 사용한 담쟁이덩굴 줄기는 2017년 1월경 서울 경동시장에서 국내에서 채취된 것을 구입 사용하였다.
담쟁이덩굴 줄기 발효추출물은 (주)지에프씨로부터 얻었다. 발효 유산 균주는 여러 미생물 중에서 bromo-phenol blue (BPB)를 이용한 산 생성 균주 선발[15], es-culin agar 방법을 통한 β-glucosidase를 생성하는 균주 선발[16], ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (ρNPG) 방법을 이용한 glucosidase 활성 균주 선발[17] 과정을 거쳐 최종 β-glucosidase 고역가 균주인 Lactobacillus pentosus (L.
본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 통계자료의 값은 mean ± S.D.로 표시하였다.
통계적 유의성 검증은 Graphpad Prism 5.0 (San Diego, CA)프로그램을 이용하였으며, one-way ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
성능/효과
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 30.3 min으로 오차범위 ± 1.3 min 이내로재현성이 양호하게 나타났다.
4% 활성이 증대되었다. 이를 통하여 발효 후에 자유라디칼 소거활성이 증가함을 확인하였다.
세포보호효과의 결과는 시료를 5, 10, 25, 50 µg/mL의 농도로 처리하였을 때, 적혈구가 50% 용혈되는데 걸리는 시간(τ 50)으로 나타내었으며(Figure 3), 먼저 시료를 넣지 않은 대조군으로 약 30.3 min에서 50%의 적혈구가 파괴되는 것으로 측정되었다.
2% 활성이 증대되었다. 이를 통하여 발효 후에 총 항산화능이 약간 증가함을 확인하였다.
0% 증가하였다. 자유라디칼 소거 활성 및 활성산소 소거 활성 결과에 비해 추출물과 발효추출물이 큰 차이로 세포보호 활성 증대를 보였다.
담쟁이덩굴 줄기 추출물 및 발효추출물의 elastase 저해 활성(IC50)은 각각 873.6 µg/mL, 687.8 µg/mL로 나타나 발효 후 elastase 저해 활성이 약 21.3% 증가함을 확인하였으며 비교물질로 oleanolic acid (IC50, 7.2 µg/mL)를 사용하였다(Figure 5).
이상의 결과들로부터 L. pentosus를 이용한 담쟁이덩굴 줄기 발효추출물은 자유라디칼 소거 활성, 활성산소 소거 활성(총 항산화능), 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 세포보호 효과, elastase 저해 활성이 증가함을 확인하였다. 이는 발효 후 발효균주 L.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
자외선에 노출된 피부에는 무엇이 생성되는가?
특히 자외선(UV)은 외인성 피부 광노화의 주요한 원인이다. 피부가 자외선에 노출되면 피부에서는 singlet oxygen (1O2), superoxide anion radical (O2∙-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (∙OH), alkoxyl radical (∙OR) 및 hydroperoxyl radical (∙OOR) 등 다양한 종류의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다[9]. 이들 ROS는 피부에 존재하는 지질, 단백질 및 DNA를 산화 손상시킬 뿐만 아니라 콜라젠이나 엘라스틴과 같은 매트릭스 구성 단백질들의 절단 및 비정상적인 가교결합을 통하여 주름생성을 동반하는 피부노화를 촉진시킬 수 있다.
과잉 활성산소 생성을 억제하는 것이 기능성 화장품 연구에 있어서 중요한 이유는 무엇인가?
피부가 자외선에 노출되면 피부에서는 singlet oxygen (1O2), superoxide anion radical (O2∙-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (∙OH), alkoxyl radical (∙OR) 및 hydroperoxyl radical (∙OOR) 등 다양한 종류의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다[9]. 이들 ROS는 피부에 존재하는 지질, 단백질 및 DNA를 산화 손상시킬 뿐만 아니라 콜라젠이나 엘라스틴과 같은 매트릭스 구성 단백질들의 절단 및 비정상적인 가교결합을 통하여 주름생성을 동반하는 피부노화를 촉진시킬 수 있다. 따라서 피부에서 생성되는 과잉의 활성산소 생성을 억제하거나 피부 세포외 매트릭스 성분인 콜라겐 및 엘라스틴 등을 분해시키는 ma-trix metalloproteinases (MMPs) 활성을 억제하는 효능이 있는 기능성 소재의 개발은 기능성 화장품 연구에 있어서 매우 중요하다.
발효과학은 무엇인가?
최근 인간에게 유익한 미생물을 이용하여 기능성 발효 성분을 함유한 화장품은 자연 친화적인 이미지를 내세우면서 연구와 개발 그리고 마케팅에 이르기까지 그 폭을 넓혀가고 있다. 발효과학이란 인체에 유익한 미생물이 여러 성분들을 작게 분해시켜서 체내에 흡수가 잘되도록 하거나 새로운 물질을 만들어서 유익한 기능을 나타내도록 돕는 것을 말한다[1]. 유산균, 효모등과 같은 미생물을 이용한 발효로 유효 성분의 함량은 크고 독성이 작아 인체에 안전한 소재를 개발하는 연구들이 주를 이루고 있다.
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