[논문]Lactobacillus pentosus에 의한 발효 전후 마가목 가지 추출물의 항산화 활성 및 Matrix Metalloproteinases 발현 억제 효과

박영민; 박소현; 차미연; 강희철; 박수남

doi:10.14478/ace.2017.1093

Lactobacillus pentosus에 의한 발효 전후 마가목 가지 추출물의 항산화 활성 및 Matrix Metalloproteinases 발현 억제 효과
Comparison of Antioxidant and Matrix Metalloproteinases Inhibitory Effects of Sorbus commixta Twig Extracts before and after Fermentation with Lactobacillus pentosus 원문보기

공업화학 = Applied chemistry for engineering, v.28 no.6, 2017년, pp.696 - 704

박영민 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소) , 박소현 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소) , 차미연 ((주)지에프씨 생명과학연구원) , 강희철 ((주)지에프씨 생명과학연구원) , 박수남 (서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 마가목 가지 비발효 추출물과 발효균주 Lactobacillus pentosus를 이용하여 발효시킨 발효 추출물에 대하여 항산화 및 MMPs 발현 억제 효과를 조사하고 유효 성분을 분석하였다. 마가목 가지 비발효 추출물과 발효 추출물의 자유 라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)에서 비발효 추출물은 $41.0{\mu}g/mL$, 발효 추출물은 $58.2{\mu}g/mL$이었다. $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$계에서 활성산소 소거 활성($OSC_{50}$)은 각각 2.6, $3.0{\mu}g/mL$로 나타났다. 진피 섬유아세포에서 세포내 활성산소 소거활성은 $10{\mu}g/mL$에서 각각 35.3, 40.2%를 나타났다. 진피 섬유아세포에서 MMPs (MMP-1, MMP-2 및 MMP-3) 발현은 $10{mu}g/mL$에서 비발효 추출물은 각각 68.3, 35.0 및 24.2%이었고, 발효 추출물은 각각 84.3, 70.5 및 69.2% 억제되었다. 마가목 발효 전후 추출물의 성분 변화는 TLC, HPLC 및 LC/ESI-MS/MS를 이용하였다. 그 결과, caffeic acid, (-)-epicatechin, isoquercitrin 및 quercetin을 확인하였다. 이상의 결과들은 L. pentosus를 이용한 마가목 가지 발효 추출물은 비발효 추출물보다도 ROS 소거 활성이 크게 나타났고 또한 MMPs 발현 억제 효능도 보여주었다. 따라서 마가목 가지 발효 추출물은 항노화 화장품 소재로서 응용 가능성이 있음을 시사하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, we investigated antioxidative and matrix metalloproteinases (MMPs) inhibitory effects of Sorbus commixta twig extracts and fermented extracts with Lactobacillus pentosus and analyzed active ingredients. The free radical scavenging activity ($FSC_{50}$) of non-fermented and fermented extracts of S. commixta twig' were 41.04 and $58.2{\mu}g/mL$, respectively. In the $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system, the active oxygen scavenging activity ($OSC_{50}$) was 2.6 and $3.0{\mu}g/mL$, respectively. In the dermal fibroblasts, the intracellular reactive oxygen species (ROS) scavenging activity was 35.3% for non-fermented extract and 40.2% for fermented extracts at the concentration of $10{\mu}g/mL$. Also at the same concentration, the expression of MMPs (MMP-1, -2, -3) by western blot was 68.3, 35.0 and 24.2%, respectively for non-fermented extracts and 84.3, 70.5 and 69.2% for fermented extracts. TLC, HPLC, and LC/ESI-MS/MS were used for measuring the changes in the components of the extract before and after fermentation. As a result, caffeic acid, (-)-epicatechin, isoquercitrin, and quercetin were identified. From the results, S. commixta twig fermented extracts by L. pentosus showed greater ROS scavenging activity and inhibitory effects on MMPs expression than those of using non-fermented extracts. Therefore, it is suggested that S. commixta twig fermented extracts can be used as an anti-aging cosmetic material.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

따라서 본 연구에서는 마가목 가지 추출물과 발효 추출물에 대하여 항산화 및 MMPs 발현 저해 효능을 비교함으로써 발효를 활용한 마가목 가지 추출물의 피부노화 예방 및 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하고자 했다.
다양한 MMPs의 발현 억제는 항노화 효능을 입증할 수 있다[5-9]. 본 실험에서는 MMP-1 (collagenase 1), MMP-2 (gelatinase) MMP-3 (stromelysin 1)등의 다양한 MMPs의 발현에 대한 마가목 가지 추출물과 발효물의 억제 효과를 확인하고자 하였다. MMPs 단백질 발현은 western blot을 통해 확인하였다.
본 연구에서는 마가목 가지 에탄올 추출물과 L. pentosus를 이용한 발효물의 항산화 활성 및 MMPs 발현 억제 효과를 비교하였다. 항산화 활성은 DPPH법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성, 루미놀을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서 활성산소 소거 활성, H₂DCF-DA를 이용한 세포 내 ROS 억제 활성을 통해 확인하였다.

제안 방법

마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 10,000 µg/mL를 Table 1의 조건으로 HPLC 기기를 이용하여 정량 분석하였다.
0.4-400 µg/mL 농도의 마가목 가지 발효 전후 추출물을 HDF 세포에 24 h 처리 후 세포생존율을 확인하였다.
20 µM H2DCFH-DA로 30min 동안 37 ℃에서 처리한 후, CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에서 80 mJ/cm2 UVB를 조사하여 세포 내 ROS를 생성시켰다.
HDF 세포를 100 mm dish에 분주하여 70-80% 배양 후, 여러 농도의 마가목 가지 추출물, 발효물을 무혈청 배지에 희석하여 처리하였다. 24 h 배양 후, PBS로 2번 세척하여 PBS를 넣고 UVB 조사량은 이전연구 결과[27]를 통해 MMPs 발현 조사량인 80 mJ/cm²를 처리한 후 무혈청 배지로 교체해주었다. 72 h 배양 후 세포 상층액을 Amicon(Millipore, USA)으로 농축하여 이용하였다.
3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-di-phenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를 이용하여 세포 독성평가를 확인하였다.
유의성 있는 검량선을 얻기 위해 4가지 농도에서 실험을 실시하였다. Caffeic acid, (-)epicatechin, isoquercitrin은 100% 에탄올에 녹여 1,0.5, 0.25, 0.125 mM의 농도를 제조하였고, quercetin은 2, 1, 0.5, 0.25mM의 농도를 제조하여 검량선을 작성하였다. Regression equation을 y = ax + b의 형태로 구하여 검량선을 작성하였고 작성된 검량선은R² 값을 통하여 직선성을 판단하였고, R² 값이 0.
이러한 효능차이는 MMPs 억제 효과에서 더욱 두드러졌다. HDF 세포를 이용하여 마가목 가지 추출물, 발효물 처리에 따른 UVB로 유도된 MMPs 발현저해 효과를 확인하였다. 실험결과, 최고농도(10 µg/mL)에서 MMP-1,2, 3의 발현은 추출물의 경우 각각 68.
성분 확인은 표준물질과 같이 전개시킨 TLC 크로마토그램을 NP발색시약, vanillin 발색시약과 자외선(UV-365 nm)을 통해 띠의 색상,Rf value를 비교하고 HPLC 크로마토그램에서 표준물질의 peak retention time과 UV-Visible 흡수스펙트럼을 비교하여 분석하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.5% acetic acid를 함유한 50% acetonitrile 수용액을 이용해 기울기 용리법으로 분석하였고, HPLC 분리조건은 Table 1에 나타내었다.
99일 때 성분의 함량을 평가하는 검량선을 사용하였다. HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram에서 성분들의 각각의 면적을 회귀직선 방정식에 대입하여 각각성분들의 함량을 구하였다.
MTT assay를 통해 마가목 가지 발효 전후 추출물이 사람유래 섬유아세포인 HDF 세포에 대한 독성 평가를 평가함으로써 앞으로의 노화효능 평가를 위한 샘플의 농도 범위를 결정하였다. 0.
25mM의 농도를 제조하여 검량선을 작성하였다. Regression equation을 y = ax + b의 형태로 구하여 검량선을 작성하였고 작성된 검량선은R² 값을 통하여 직선성을 판단하였고, R² 값이 0.99일 때 성분의 함량을 평가하는 검량선을 사용하였다. HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram에서 성분들의 각각의 면적을 회귀직선 방정식에 대입하여 각각성분들의 함량을 구하였다.
45µm)를 이용하여 여과시킨 추출물 용액을 이용하여 TLC 및 HPLC 분석에 이용하였다. TLC 분석 시 사용한 전개 용매는 상대적으로 극성인 성분을 분석하기 위하여 ethyl acetate : chloroform : formic acid :D.W = 8 : 1 : 1 : 1을 사용하였고, 상대적으로 비극성인 성분을 분석하기 위하여 n-hexane : ethyl acetate : acetic acid = 21 : 14 : 5를 사용하였다. TLC로 분리된 여러 띠 중 발효 전후 양의 차이를 보이는 띠를 긁은 후 70% 에탄올 추출, 여과, 감압⋅건조 과정을 거쳐 성분을 추출하여 한 후 100% 에탄올에 녹이고 syringe filter (Milipore 0.
TLC로 분리된 여러 띠 중 발효 전후 양의 차이를 보이는 띠를 긁은 후 70% 에탄올 추출, 여과, 감압⋅건조 과정을 거쳐 성분을 추출하여 한 후 100% 에탄올에 녹이고 syringe filter (Milipore 0.45µm)를 이용하여 여과하고 그 여액을 UV-Visible 흡수스펙트럼,HPLC, LC/ ESI-MS/MS 분석에 이용하였다.
따라서 본 실험에서는 마가목 가지 비발효 추출물과 발효 추출물을 같은 농도로 효능을 비교하기 위해 10 µg/mL을 최고 농도로 설정하였다.
발효 전후 양의 차이가 있는 3개의 띠를 긁어서 추출하여 얻은 물질을 LC/ESI-MS/MS 분석하였다(Table 2). 또한 TLC, HPLC, UV-visible 흡수스펙트럼에서 표준물질과 비교하여 종합하여 성분을 확인하였다(Figure 6, Table 2).
마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 caffeic acid, quercetin, (-)epicatechin, isoquercitrin의 함량을 측정하기 위하여 먼저 각각의 표준물질을 이용하여 검량선을 작성하였다. Regression equation을 y = ax + b의 형태로 구하였으며, R² 값을 통하여 직선성을 판단하여 R² 값이 0.
마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 크로마토그램(Figure 7)에서 peak 1 (caffeic acid), peak 2((-)epicatechin), peak 3 (isoquercitrin), peak 4 (quercetin)의 피크 면적을 각각 표준물질의 검량선의 회귀직선 방정식에 대입하여 양을 구한후 마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 수율을 고려하여 원재료인 건조된 마가목 가지 중량당 각각의 성분들의 함량을 계산하였다(Table 3). Caffeic acid의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 278% 증가하였으며, (-)epicatechin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 25% 감소하였으며, isoquercitrin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 13% 감소하였으며, quercetin의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 46% 증가하였다.
마가목 가지 비발효 추출물, 발효 추출물(1.5-3.5 µg/mL) 및 대조군으로 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid의 총 항산화능을 luminol 발광법을 이용하여 측정하여 OSC50으로 나타냈다(Figure 2a).
발효 유산 균주는 여러 미생물 중에서 bromophenol blue(BPB)를 이용한 산 생성 균주 선발[22], esculin agar 방법을 통한 β-glucosidase를 생성하는 균주 선발[23], ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (ρNPG) 방법을 이용한 glucosidase 활성 균주 선발[24] 과정을 거쳐 최종 β-glucosidase 고역가 균주인 L. pentosus를 선정하였으며 colony PCR을 이용한 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통한 유산균주 동정[25]으로부터 L. pentosus D79211[26]와 99%의 상동성을 확인하였다.
TLC띠의 발색의 진하기를 비교하여 보았을 때, 그중 SCT1이 발효 후에 양이 증가한 것으로 보이고, SCT2, 3이 발효 후에 양이 감소한 것으로 보인다. 발효 전후 양의 차이가 있는 3개의 띠를 긁어서 추출하여 얻은 물질을 LC/ESI-MS/MS 분석하였다(Table 2). 또한 TLC, HPLC, UV-visible 흡수스펙트럼에서 표준물질과 비교하여 종합하여 성분을 확인하였다(Figure 6, Table 2).
pentosus D79211[26]와 99%의 상동성을 확인하였다. 발효는 1% glucose를 함유한 액상 발효 방법을 사용하였다. 액상배양은 최소한의 영양원으로 1% glucose를 첨가한 증류수에70% 에탄올 추출물 파우더를 1% 농도가 되도록 첨가한 후, autoclave를 통해 멸균하고 발효 균주 L.
세포 내 ROS 억제를 통해 피부 노화를 억제할수 있다. 본 연구에서 마가목 가지 발효 전후 추출물의 세포 내 ROS억제활성을 진피 섬유아세포인 HDF 세포에 H₂DCF-DA를 이용하여 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군에(100%) 비하여 ROS가 204%로 증가하였다.
Free radical은 피부 노화의 원인으로 간주되고 있다. 본 연구에서는 비교적 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자 주개 능력을 통하여 마가목 가지 비발효 추출물, 발효 추출물의 환원력을 측정하였다. 실험 방법은 메탄올에 용해시킨 0.
분석 기기로 LC기기는 Thermo-Finnigan surveyor instrument(Thermo scientific, USA)(column spec. U-VDSpher Pur C18-E 1.8 um,50 × 2.0 mm Cat.-No. N0520E181UVC), autosampler, PDA-UV detector를 사용하였으며, 질량분석(Mass spectrometric analysis)기기는Thermo Finnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, withESI interface를 사용하였다.
성분 확인은 표준물질과 같이 전개시킨 TLC 크로마토그램을 NP발색시약, vanillin 발색시약과 자외선(UV-365 nm)을 통해 띠의 색상,Rf value를 비교하고 HPLC 크로마토그램에서 표준물질의 peak retention time과 UV-Visible 흡수스펙트럼을 비교하여 분석하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 수용액과 0.
세포 내 ROS 소거활성 평가는 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)를 사용하여 fluorescence를 측정하는 방법을 이용하였다.
본 연구에서는 비교적 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자 주개 능력을 통하여 마가목 가지 비발효 추출물, 발효 추출물의 환원력을 측정하였다. 실험 방법은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가한 후 농도별로 추출물을 각각 1 mL씩 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치한 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50%감소하는 데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity,FSC₅₀, µg/mL)로 표기하였다.
실험 방법은 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.78 mL를 넣고여러 농도의 마가목 가지 비발효 추출물, 발효 추출물과 2.5 mMEDTA 40 µL, 5 mM FeCl3⋅6H2O 10 µL, 35 mM luminol 80 µL를 첨가하여 섞어 주었다.
에틸아세테이트 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milopore 0.45µm)를 이용하여 여과시킨 추출물 용액을 이용하여 TLC 및 HPLC 분석에 이용하였다.
함량 측정을 위하여 표준물질 caffeic acid,(-)epicatechin, isoquercitrin, quercetin을 사용하여 검량선을 작성하였다. 유의성 있는 검량선을 얻기 위해 4가지 농도에서 실험을 실시하였다. Caffeic acid, (-)epicatechin, isoquercitrin은 100% 에탄올에 녹여 1,0.
이러한 항산화 효과를 평가하기 위해 시료를 20-100 µg/mL로 처리하여 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.
잘게 자른 건조된 마가목 가지(뿌리 제외) 100 g 기준으로 70% 에탄올 4 L에 일주일 동안 침적시켜 추출하였다. 그 후 여과, 감압⋅건조하여 파우더를 얻었다.
마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 10,000 µg/mL를 Table 1의 조건으로 HPLC 기기를 이용하여 정량 분석하였다. 함량 측정을 위하여 표준물질 caffeic acid,(-)epicatechin, isoquercitrin, quercetin을 사용하여 검량선을 작성하였다. 유의성 있는 검량선을 얻기 위해 4가지 농도에서 실험을 실시하였다.
pentosus를 이용한 발효물의 항산화 활성 및 MMPs 발현 억제 효과를 비교하였다. 항산화 활성은 DPPH법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성, 루미놀을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서 활성산소 소거 활성, H₂DCF-DA를 이용한 세포 내 ROS 억제 활성을 통해 확인하였다. 마가목 가지 추출물과 발효물의 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과(FSC₅₀), 추출물(41.
20 µM H2DCFH-DA로 30min 동안 37 ℃에서 처리한 후, CL-1000 ultraviolet crosslinker를 이용하여 DPBS 상태에서 80 mJ/cm² UVB를 조사하여 세포 내 ROS를 생성시켰다. 형광의 세기는 fluorescence ELISA reader (excitation, 490nm; emission, 530 nm) 기기를 통하여 형광의 세기를 측정하였다.

대상 데이터

(USA)에서 구입하였고, FeCl₃⋅6H₂O는 Junsei Chemical Co.(Japan) 제품을 사용하였다. 세포배양에 사용한 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin- streptomycin (P/S) 및 trypsin 등은 Capricorn Scientific (Germany) 제품을 사용하였다.
라디칼 소거활성 실험에서 사용된 UV-visible spectrophotometer는Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT, ELISA reader은 Tecan (Austria)사의 제품을 사용하였으며, pH 미터는 Mettler-Toledo (Switzerland)를 사용하였다.Folin-ciocalteu’s phenol reagent, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)radical, luminol, ethylenediaminetetraaceticacid (EDTA), H₂O₂, 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT), (+)-αtocopherol (1,000 IU vitamin E/g) 및 L-ascorbic acid은 Sigma ChemicalCo.
마가목 가지 추출물의 발효 전후 성분 변화 분석에 마가목 가지 발효 전후 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 사용하였다. 에틸아세테이트 분획물을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milopore 0.
그 후 여과, 감압⋅건조하여 파우더를 얻었다. 마가목 발효 추출물은 (주)지에프씨로부터 얻었다. 발효 유산 균주는 여러 미생물 중에서 bromophenol blue(BPB)를 이용한 산 생성 균주 선발[22], esculin agar 방법을 통한 β-glucosidase를 생성하는 균주 선발[23], ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (ρNPG) 방법을 이용한 glucosidase 활성 균주 선발[24] 과정을 거쳐 최종 β-glucosidase 고역가 균주인 L.
본 실험에서 사용한 Fe3+-EDTA/H2O2계는 각종 ROS (O2⋅-, ⋅OH, 그리고 H2O2)를 생성시킨다.
사람유래 섬유아세포인 HDFs (passage 6-8)를 10% fetal bovine serum (FBS)와 1% penicillin/streptomycin (P/S)을 이용하여 37 ℃, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
세포배양에 사용한 Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin- streptomycin (P/S) 및 trypsin 등은 Capricorn Scientific (Germany) 제품을 사용하였다.

데이터처리

¶ p < 0.05 non-fermented extract versus fermented extract by Student’s t-test.
본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 통계자료의 값은 mean ± SD로 표시하였다.
통계적 유의성 검증은 Graphpad Prism 5.0(San Diego, CA)프로그램을 이용하였으며, Student’s t-test 및 one-wayANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

이론/모형

commixta twig treatment on human dermal fibroblast (HDF) cell viability. HDF cells were treated with various concentrations of samples for 24 h and cell viability was determined using the MTT assay. Data are presented as the mean ± SD of three independent experiments.
본 실험에서는 MMP-1 (collagenase 1), MMP-2 (gelatinase) MMP-3 (stromelysin 1)등의 다양한 MMPs의 발현에 대한 마가목 가지 추출물과 발효물의 억제 효과를 확인하고자 하였다. MMPs 단백질 발현은 western blot을 통해 확인하였다. 실험결과 MMP-1의 경우 UVB를 조사하지 않은 군에(100%) 비해 UVB (80 mJ/cm²)를 조사한 군의 MMP-1 단백질 발현이 약 4배(396.
배양 배지 내의 MMPs 발현을 western blot을 통해 분석하였다.HDF 세포를 100 mm dish에 분주하여 70-80% 배양 후, 여러 농도의 마가목 가지 추출물, 발효물을 무혈청 배지에 희석하여 처리하였다.

성능/효과

마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 HPLC 크로마토그램(Figure 7)에서 peak 1 (caffeic acid), peak 2((-)epicatechin), peak 3 (isoquercitrin), peak 4 (quercetin)의 피크 면적을 각각 표준물질의 검량선의 회귀직선 방정식에 대입하여 양을 구한후 마가목 가지 비발효 추출물 및 발효 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 수율을 고려하여 원재료인 건조된 마가목 가지 중량당 각각의 성분들의 함량을 계산하였다(Table 3). Caffeic acid의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 278% 증가하였으며, (-)epicatechin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 25% 감소하였으며, isoquercitrin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 13% 감소하였으며, quercetin의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 46% 증가하였다. 발효 후 발효균주 L.
Positive control인 L-ascorbic acid (1.5 µg/mL)와 비교해볼 때 유의적 차이를 나타내지 않는 것으로 마가목 가지 발효 전후추출물 모두 높은 항산화능을 나타냈다.
TLC에서 3개의 띠의 R_f value 및 발색 색깔은 SCT1 (0.84, NP-파랑), SCT2 (0.68, vanillin-분홍), SCT3 (0.76, NP-주황)으로 각각 caffeic acid, (-)epicatechin, isoquercitrin의 R_f value 및 발색 색깔과 일치하였으며 HPLC에서 각각 표준물질과 peak retention time 및UV-Visible 흡수스펙트럼이 일치하였다. 따라서 종합하여 보았을 때,SCT1은 caffeic acid, SCT2는 (-)epicatechin, SCT3는 isoquercitrin으로 확인되었다.
추출물의 경우 MMP-2와 같이 최고 농도에서만 유의적 감소를 나타냈다면, 발효물의 경우 전농도 유의적 감소를 나타냈을 뿐만 아니라 더 높은 유의성을 나타냈다. 결과적으로 마가목 가지 추출물과 발효물 모두 MMPs의 발현을 농도 의존적으로 저해시키지만 같은 농도로 비교해 보았을 때, 발효물의 MMPs (MMP-1,MMP-2, MMP-3) 발현 억제 효능이 더욱 뛰어남을 입증하였다.
실험 결과, 3 µg/mL 농도를 제외한 나머지 농도에서 마가목 가지 비발효 추출물과 발효 추출물의 활성산소 소거능이 거의 일치한 것으로 나타냈다. 결론적으로 마가목 가지 발효 전후 추출물 모두 높은 활성산소 소거능을 나타냈고, 대조군인 L-ascorbic acid만큼 뛰어난 항산화능을 나타냈다.
결론적으로, L. pentosus를 이용한 마가목 가지 발효물은 마가목 가지 에탄올 추출물보다 세포 내 ROS를 더 효율적으로 억제함으로써 MMPs 발현 억제 효능이 더 우수한 것으로 나타냈으며, 이는 항 노화 기능성 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
Figure 1b에서는 마가목 가지 발효전후 추출물의라디칼 소거능을 20-100 µg/mL 농도에서 비교하였다. 그 결과 모두농도가 증가함에 따라 free radical 소거능이 증가하였다.
3 µg/mL)가 추출물(5 µg/mL) 보다적은 농도로 또한 둘의 유의적 차이가 있음을 확인함으로써 발효물의효능이 뛰어남을 확인할 수 있다. 따라서 마가목 가지 추출물과 발효물의 항산화 활성은 모두 뛰어나지만 세포 내로 처리하였을 때의 항산화 활성이 발효물이 더 우수하다는 것을 확인하였다. 이러한 효능차이는 MMPs 억제 효과에서 더욱 두드러졌다.
76, NP-주황)으로 각각 caffeic acid, (-)epicatechin, isoquercitrin의 R_f value 및 발색 색깔과 일치하였으며 HPLC에서 각각 표준물질과 peak retention time 및UV-Visible 흡수스펙트럼이 일치하였다. 따라서 종합하여 보았을 때,SCT1은 caffeic acid, SCT2는 (-)epicatechin, SCT3는 isoquercitrin으로 확인되었다. 이 외에 HPLC에서 성분변화가 큰 1개의 피크(peak 4)는 UV-Visible 흡수스펙트럼 및 retention time 비교를 통해 quercetin임을 확인하였다.
또한 비발효 추출물군과 발효 추출물군을 비교해 보았을 때 1.3 µg/mL 이상에서 유의적 차이가 있음을 통계적으로 관찰함으로써 세포 내 ROS 억제 효능이 비발효 추출물보다 발효 추출물에서 더욱 뛰어남을 확인하였다.
2%의 감소를 나타냈었다. 마가목 가지 추출물 및 발효물 모두 감소하는 경향을 나타냈으나, 같은 농도별로 MMPs의 발현 양을 비교하였을 때, 추출물에 비해 발효물에서 MMPs억제 효능이 뛰어난 것을 확인하였다. 이는 발효 균주에 의해 생성된 β-glucosidase는 식물 소재 내의 이소플라본 배당체를 비배당체로 전환되어 저분자화 된 것이 항산화 효능 및 MMPs 저해 효과 높이는데 기인한 것으로 보인다.
두 번째 MMP-2의 발현 억제 효능을 Figure 5b 통해 나타내었다. 마가목 가지 추출물 및 발효물은 UVB로 유도된 MMP-2의 발현(435.7%)을 농도 의존적으로 감소시켰다. MMP-2발현은 마가목 추출물의 경우 18.
7%) 증가하였으며 마가목 가지 추출물 및 발효물을 전처리(24 h)한 경우 농도 의존적으로 MMP-1발현을 저해하였다(Figure5a). 마가목 가지 추출물과 발효물을 비교해 보았을 때, 추출물의 경우UVB 조사 군에 비해 MMP-1 발현을 36.4, 45.5, 68.3%로 감소하였으며, 발효물의 경우 67.3, 72.8, 84.3%로 감소하였다. 통계적 유의성으로 비교해보았을 때 발효물이 전농도적으로 더 높은 유의성을 나타냄으로써 추출물보다 발효물의 MMP-1 저해 효능이 현저하게 뛰어난다는 것을 확인할 수 있었다.
마가목 가지 추출물과 발효물의 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과(FSC50), 추출물(41.0µg/mL)이 발효물(58.2 µg/mL)로 나타났다.
따라서 MMP-2 발현 억제 효능 역시 발효물이 더 뛰어남을 알 수 있다. 마지막 MMP-3의 억제 효능 또한 발효물에서 더욱 뛰어남을 확인할 수 있었다. MMP-3 발현은 마가목 가지 추출물의 경우 UVB군(415.
반면 세포 내 ROS 억제 활성에서는 마가목 가지 추출물과 발효물 모두 세포 내 ROS 억제 활성이 뛰어났지만 발효물의경우 현저한 효능을 나타낸 농도(1.3 µg/mL)가 추출물(5 µg/mL) 보다적은 농도로 또한 둘의 유의적 차이가 있음을 확인함으로써 발효물의효능이 뛰어남을 확인할 수 있다.
Caffeic acid의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 278% 증가하였으며, (-)epicatechin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 25% 감소하였으며, isoquercitrin의 함량은 발효전보다 발효 후에 약 13% 감소하였으며, quercetin의 함량은 발효 전보다 발효 후에 약 46% 증가하였다. 발효 후 발효균주 L. pentosus에의해 quercetin 배당체인 isoquercitrin가 quercetin으로 생물 전환됨을 확인하였다.
실험 결과 비발효 추출물의 경우 2.6 µg/mL, 발효 추출물의 경우 3.1 µg/mL로 나타났다.
실험 결과, 3 µg/mL 농도를 제외한 나머지 농도에서 마가목 가지 비발효 추출물과 발효 추출물의 활성산소 소거능이 거의 일치한 것으로 나타냈다.
본 연구에서 마가목 가지 발효 전후 추출물의 세포 내 ROS억제활성을 진피 섬유아세포인 HDF 세포에 H₂DCF-DA를 이용하여 측정하였다. 실험 결과, UVB를 조사한 실험군은 조사하지 않은 군에(100%) 비하여 ROS가 204%로 증가하였다. 마가목 가지 발효 전후추출물을 HDF 세포에 0.
MMPs 단백질 발현은 western blot을 통해 확인하였다. 실험결과 MMP-1의 경우 UVB를 조사하지 않은 군에(100%) 비해 UVB (80 mJ/cm²)를 조사한 군의 MMP-1 단백질 발현이 약 4배(396.7%) 증가하였으며 마가목 가지 추출물 및 발효물을 전처리(24 h)한 경우 농도 의존적으로 MMP-1발현을 저해하였다(Figure5a). 마가목 가지 추출물과 발효물을 비교해 보았을 때, 추출물의 경우UVB 조사 군에 비해 MMP-1 발현을 36.
실험결과, 아무처리하지 않은 군에 비해 비발효추출물은 25 µg/mL, 발효 추출물은 12.5 µg/mL부터 세포독성을 나타내었다(Figure 3).
실험결과, 최고농도(10 µg/mL)에서 MMP-1,2, 3의 발현은 추출물의 경우 각각 68.3, 35.0 및 24.2%, 발효물의 경우 각각 84.3, 70.5 및 69.2%의 감소를 나타냈었다.
2% 감소하였다(Figure 5c). 추출물의 경우 MMP-2와 같이 최고 농도에서만 유의적 감소를 나타냈다면, 발효물의 경우 전농도 유의적 감소를 나타냈을 뿐만 아니라 더 높은 유의성을 나타냈다. 결과적으로 마가목 가지 추출물과 발효물 모두 MMPs의 발현을 농도 의존적으로 저해시키지만 같은 농도로 비교해 보았을 때, 발효물의 MMPs (MMP-1,MMP-2, MMP-3) 발현 억제 효능이 더욱 뛰어남을 입증하였다.
3%로 감소하였다. 통계적 유의성으로 비교해보았을 때 발효물이 전농도적으로 더 높은 유의성을 나타냄으로써 추출물보다 발효물의 MMP-1 저해 효능이 현저하게 뛰어난다는 것을 확인할 수 있었다. 두 번째 MMP-2의 발현 억제 효능을 Figure 5b 통해 나타내었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	마가목은 무엇인가?	마가목(Sorbus commixta Hedl)은 장미과의 낙엽활엽수로 소교목에 속하며 민간적으로 기침, 신경통, 천식, 기관지 치료에 사용하거나 강장제로서 이용되었다[17,18]. 마가목 가지에 함유된 성분으로는 catechin-7-Ο-β-D-xylopyranoside, catechin-7-Ο-β-D-apiofuranoside 등의 플라보노이드가 알려져 있고, 혈관계 염증성 질환 예방 및 항동맥경화 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다[19,20].
	MMPs의 종류와 그들의 특징은 무엇인가?	MMPs에는 구조와 기능적 특성에 따라 collagenase, gelatinase, stromelysin 등으로 나누어진다[6]. MMP-1은 collagenase 1으로 알려져 있으며, type I과 III collagen을 기질로 하며 MMP-3은 stromelysin 1으로 type IV collagen을 기질로 하여 콜라겐을 조각으로 분해한다[7]. MMP-2는 gelatinase로 이 또한 피부 진피를 구성하는 기질들을 분해하여 피부 노화에 주요한 역할을 한다[8]. 그러므로 피부에서 생성되는 과잉의 활성산소의 생성을 억제하여 피부를 구성하는 기질 물질인 콜라젠과 엘라스틴을 분해하는 MMPs의 발현을 억제하는 소재의 개발은기능성 화장품 연구에 있어서 매우 중요한 것으로 평가되고 있다[9].
	UVB는 노출된 피부에 어떤 영향을 주는가?	자외선은 UVA(320-400 nm)와 UVB (280-320 nm)로 크게 구분되며, 그중 UVB는 피부 표피까지 침투하며, 에너지가 크기 때문에 피부노화에 큰 영향을 미친다[3]. UVB에 노출된 피부에서는 싱글렛 옥시전(1O2), 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(O2⋅-), 과산화수소(H2O2), 히드록실 라디칼(⋅OH),알콕실 라디칼(RO⋅) 및 과산화 라디칼(ROO⋅) 등 다양한 종류의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다[4]. 활성산소는 세포 내 손상과 분자 신호 등의 다양한 반응에 관여하는 반응성이 큰 분자로서 단백질 산화, DNA 손상, 지질과산화 반응 개시뿐만 아니라 matrixmetalloproteinases (MMPs)들의 분비를 촉진시켜 콜라겐 또는 젤라틴 등의 세포외 기질 분해를 유도하여 피부노화를 가속화시킬 수 있다[5].

참고문헌 (27)

H. S. Lee and S. H. Kim, Safety evaluation of black garlic extract for development of cosmeceutical ingredients-skin irritation and sensitization studies, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 39, 1213-1219 (2010).

원문보기 상세보기
B. A. Gilchrest, Skin aging and photoaging: an overview, J. Am. Acad. Dermatol., 21, 610-613 (1989).

상세보기
M. A. Zaid, F. Afaq, D. N. Syed, M. Dreher, and H. Mukhtar, Inhibition of UVBmediated oxidative stress and markers of photoaging in immortalized HaCaT keratinocytes by pomegranate polyphenol extract POMx, Photochem. Photobiol., 83, 882-888 (2007).

상세보기
A. Kammeyer and R. M. Luiten, Oxidation events and skin aging, Ageing Res. Rev., 21, 16-29 (2015).

상세보기
M. Kim, Y. G. Park, H. J. Lee, S. J. Lim, and C. W. Nho, Youngiasides A and C isolated from Youngia denticulatum inhibit UVB-induced MMP expression and promote type I procollagen production via repression of MAPK/AP-1/NF- ${\kappa}B$ and activation of AMPK/Nrf2 in Hacat cells and human dermal fibroblasts, J. Agric. Food Chem., 63, 5428-5438 (2015).

상세보기
G. L. Fisher, H. S. Talwar, J. Lin, P. Lin, F. McPhillips, Z. Wang, X. Li, Y. Wan, S. Kang, and J. J. Voorhees, Retinoic acid inhibits induction of c-Jun protein by ultraviolet radiation that occurs subsequent to activation of mitogen-activated protein kinase pathways in human skin in vivo, J. Clin. Invest., 101, 1432-1440 (1998).

상세보기
G. J. Fisher, S. C. Datta, H. S. Talwar, Z. Q. Wang, J. Varani, S. Kang, and J. J. Voorhees, Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism, Nature, 379, 335-339 (1996).

상세보기
L. Rittie and G. J. Fisher, UV-light-induced signal cascades and skin aging, Ageing Res. Rev., 1, 705-720 (2002).

상세보기
S. G. Park, S. N. Kim, J. C. Lee, H. S. Kim, Y. J. Kim, B. G. Lee, and I. S. Jang, Anti-aging effect on skin with Jaeum-Dan (JED), Korean J. Herbology., 19, 67-76 (2004).
A. R. Im, J. H. Song, M. Y. Lee, S. H. Yeon, K. A. Um, and S. Chae, Anti-wrinkle effects of fermented and non-fermented cyclopia intermedia in hairless mice, BMC Complement. Altern. Med., 14, 424-429 (2014).

상세보기
C. C. Tsai, C. F. Chan, W. Y. Huang, J. S. Lin, P. Chan, H. Y. Liu, and Y. S. Lin, Applications of Lactobacillus rhamnosus spent culture supernatant in cosmetic antioxidation, whitening and moisture retention applications, Molecules, 18, 14161-14171 (2013).

상세보기
Y. Okabe, T. Shimazu, and H. Tanimoto, Higher bioavailability of isoflavones after a single ingestion of aglycone-rich fermented soybeans compared with glucoside-rich non-fermented soybeans in Japanese postmenopausal women, J. Sci. Food Agric., 91, 658-663 (2011).

상세보기
C. G. Schmidt, L. M. Goncalves, L. Prietto, H. S. Hackbart, and E. B. Furlong, Antioxidant activity and enzyme inhibition of phenolic acids from fermented rice bran with fungus Rizhopus oryzae, Food Chem., 146, 371-377 (2014).

상세보기
B. G. Park, H. J. Jung, Y. W. Cho, H. W. Lim, and C. J. Lim, Potentiation of antioxidative and anti-inflammatory properties of cultured wild ginseng root extract through probiotic fermentation, J. Pharm. Pharmacol., 65, 457-464 (2013).

상세보기
H. J. Yang, E. H. Kim, J. O. Park, J. E. Kim, and S. N. Park, Antioxidative activity and component analysis of fermented Melissa officinalis extracts, J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 35, 47-55 (2009).
Y. J. Ahn, B. R. Won, M. K. Kang, J. H. Kim, and S. N. Park, Antioxidant activity and component analysis of fermented Lavandula angustifolia extracts, J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 35, 125-134 (2009).
T. Yu, Y. J. Lee, H. J. Jang, A. R. Kim, S. Y. Hong, T. W. Kim, M. Y. K, J. H. Lee, Y. G. Lee, and J. Y. Cho, Antiinflammatory activity of Sorbus commixta water extract and its molecular inhibitory mechanism, J. Ethnopharmacol., 134, 493-500 (2011).

상세보기
S. H. Kim, Y. S. Jang, H. G. Chung, M. S. Choi, and S. C. Kim, Selection of superior trees for larger fruit and high productivity in Sorbus commixta Hedl, Korean J. Plant. Res., 6, 120-128 (2003).
L. R. Bhatt, M. S. Bae, B. M. Kim, G. S. Oh, and K. Y. Chai, A chalcone glycoside from the fruits of Sorbus commixta Hedl, Molecules, 14, 5323-5327 (2009).

상세보기
M. K. Na, R. B. An, S. M. Lee, B. S. Min, Y. H. Kim, K. H. Bae, and S. S. Kang, Antioxidant compounds from the stem bark of Sorbus commixta, Nat. Prod. Sci., 8, 26-29 (2002).
G. N. Lim, M. A Park, and S. N. Park, Antioxidative and antiaging effects of Sorbus commixta twig extracts, J. Korean Oil Chem. Soc., 28, 482-490 (2011).
B. U. Ridwan, C. J. M. Koning, M. G. H. Besselink, H. M. Timmerman, E. C. Brouwer, J. Verhoef, H. G. Gooszen, and L. M. A. Akkermans, Antimicrobial activity of a multispecies probiotic (Ecologic 641) against pathogens isolated from infected pancreatic necrosis, Lett. Appl. Microbiol., 46, 61-67 (2008).

상세보기
L. H. Quan, L. Q. Cheng, H. B. Kim, J. H. Kim, N. R. Son, S. Y. Kim, H. O. Jin, and D. C. Yang, Bioconversion of ginsenoside Rd into compound K by Lactobacillus pentosus DC101 isolated from Kimchi, J. Ginseng Res., 34, 288-295 (2010).

원문보기 상세보기
Y. H. Pyo, T. C. Lee, and Y. C. Lee, Enrichment of bioactive isoflavones in soymilk fermented with $\beta$ -glucosidase-producing lactic acid bacteria, Food Res. Int., 38, 551-559 (2005).

상세보기
J. W. Min, H. J. Kim, K. S. Joo, and H. C. Kang, Isolation of Stenotrophomonas rhizopilae strain GFC09 with ginsenoside converting activity and anti-wrinkle effects of converted ginsenosides, J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, 41, 375-382 (2007).
S. H. Kim, J. W. Min, L. H. Quan, S. Lee, D. U. Yang, and D. C. Yang, Enzymatic trnasformation of ginsenoside Rb1 by Lactobacillus pentosus strain 6105 from Kimchi, J. Ginseng. Res., 36, 291-297 (2012).

원문보기 상세보기
S. H. Xuan, Y. M. Park, J. H. Ha, Y. J. Jeong, and S. N. Park, The effect of dehydroglyasperin C on UVB-mediated MMPs expression in human HaCaT cells, Pharmacol. Rep., Doi: 10.1016/ j.pharep.2017.05.012 (2017).

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format