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문제 정의
- 그러나 벼에서는 group A bZIP 전사인자의 기능이 잘 알려져 있지 않다. 따라서 우리는 벼에서 group A bZIP 전사인자인 OsABF3(Oryza sativa ABA responsive element binding factor 3)를 연구하였다. 이를 위해 벼의 다양한 조직과 다양한 스트레스(가뭄, 염분, 저온, ABA, 산화 스트레스)에 따른 OsABF3 발현 패턴을 분석하였다.
- 따라서 벼에서 비 생물학적 스트레스에 반응하는 bZIP에 대한 연구는 외떡잎식물의 분자 생물학적 연구뿐만 아니라 생명공학에 의한 비 생물학적 스트레스에 내성식물을 개선하는 것에도 중요하다. 본 연구는 식물의 환경 스트레스에 대해 내성이 증가되는 알려진 ABRE-binding bZIP 전사인자 중에서 아직 기능이 밝혀지지 않은 OsABF3 유전자를 분리하고 발현 양상을 파악하여 궁극적으로 식물의 비생물학적 스트레스에 의해 유도되는 bZIP 전사인자인 OsABF3의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- cultivar Dongjin) 표면을 70% ethanol로 소독하고 멸균수에 4℃, 암상태에서 하루 동안 침종 시킨 후 식물 배양기에서 2주간 수경재배하였다(28℃, 80% humidity, 14/10시간 day/night photoperiod). 2주간 키운 벼를 각각의 가뭄(10% polyethylene glycol (PEG)), 염분(250 mM NaCl), 산화스트레스(10 ㎛ Methyl Viologen (MV)), 저온(4℃), ABA (100 ㎛) 스트레스를 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 처리하였다.
- cDNA를 주형으로 OsABF3 p2FGW7 (N- terminal) primer, OsABF3 p2GWF7 (C- terminal) primer, TaKaRa Ex Taq(Takara)을 이용하여 PCR 한 OsABF3 full-length cDNA를 pENTR/D-TOPO vector (Invitrogen)에 삽입한 뒤 LR clonase (Invitrogen)을 이용하여 destination 벡터인 p2FGW7 (N-terminal), p2GWF7 (C- terminal)에 클로닝 하였다. CaMV35S promoter가 포함된 벡터에 각각 클로닝 된 GFP-OsABF3, OsABF3-GFP fusion clone을 PEG-calcium mediated method를 이용하여 옥수수 mesophyll 원형질체에 형질전환한 후 12-24시간 동안 incubation하여 발현을 관찰하였다. 이 때 chlorophyll auto-fluorescence를 chloroplast marker로 OsABF1-RFP를 nuclear marker로 사용하였고, fusion protein의 발현은 confocal microscope (LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
- CaMV35S 프로모터에 의해 제어되는 GFP-OsABF3와 OsABF3-GFP fusion 단백질을 옥수수 mesophyll 원형질체에 삽입시킨 뒤 형광 현미경으로 발현을 관찰하여 OsABF3의 세포내 위치를 확인하였다. OsABF1-RFP를 핵 표지자로 사용하였으며, GFP-OsABF3와 OsABF3-GFP fusion protein 모두 옥수수(mazie) 원형질체의 핵에서 발현됨을 알 수 있었다(Fig.
- OsABF3와 ABA responsive elements (ABREs)가 상호작용하는지 알아보기 위해 yeast one hybrid 실험을 하였다. Yeast strain은 lacZ reporter system을 가진 pYC-Int 벡터의 Sma I cloning site에 Em1a element (GGACACGTGGCG) primer를 삽입하여 제작한 pYC-Int/ABRE, pYC-Int YIP yeast cell을 이용하였다.
- PCR 증폭 산물인 각각의 DNA 조각을 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtTON)을 이용하여 elution 한 뒤 NdeI, EcoRI restriction enzyme (NEB)를 이용하여 PCR product 양 끝과 pGADT7, pGBKT7 벡터를 절단한 뒤 각각의 벡터에 클로닝 하였다.
- cDNA를 주형으로 OsABF3 p2FGW7 (N- terminal) primer, OsABF3 p2GWF7 (C- terminal) primer, TaKaRa Ex Taq(Takara)을 이용하여 PCR 한 OsABF3 full-length cDNA를 pENTR/D-TOPO vector (Invitrogen)에 삽입한 뒤 LR clonase (Invitrogen)을 이용하여 destination 벡터인 p2FGW7 (N-terminal), p2GWF7 (C- terminal)에 클로닝 하였다. CaMV35S promoter가 포함된 벡터에 각각 클로닝 된 GFP-OsABF3, OsABF3-GFP fusion clone을 PEG-calcium mediated method를 이용하여 옥수수 mesophyll 원형질체에 형질전환한 후 12-24시간 동안 incubation하여 발현을 관찰하였다.
- Yeast strain은 lacZ reporter system을 가진 pYC-Int 벡터의 Sma I cloning site에 Em1a element (GGACACGTGGCG) primer를 삽입하여 제작한 pYC-Int/ABRE, pYC-Int YIP yeast cell을 이용하였다. pGADT7 벡터에 각각 클로닝 된 OsABF3 full-length cDNA, OsABF3△N, OsABF3△C (Fig. 3A)를 small-scale LiAc 방법을 이용하여 pYC-Int, pYC-Int/ABRE에 형질전환하여 SD Ura-, Trp- 배지에서 배양하였다. 그 후 SD Ura-, Trp-배지에 계대하였고, O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 기질로 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다.
- OsABF3의 transactivation 능력을 측정하기 위해 yeast one-hybrid 실험을 이용하였다. pGBKT7 벡터에 각각 클로닝된 OsABF3 full-length cDNA, OsABF3△N, OsABF3△C 플라스미드(Fig. 3B)를 small-scale LiAc 방법을 이용하여 AH109 strain에 형질전환하여 SD Trp-배지에 배양하였다. 그 후 AH109 strain의 reporter 유전자 중 하나인 Histidine이 빠진 SD Trp-, His- (+3AT) 배지에 농도별로 배양하여 colony 생성여부를 관찰하였고, SD Trp-, His- (+3AT) 배지에 계대한 후 ONPG 를 기질로 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다.
- 각각의 샘플 식물에 스트레스를 처리한 후 시간대 별로 채취한 벼 조직 0.06 g을 액체 질소에 얼린 후 조직분쇄기인 MM301 Glinder와 bead를 2 ㎖ e-tube 넣고 20회, 초/1분간 rpm 속도로 흔들어 조직을 파쇄한 뒤 e-tube 반대 방향으로 뒤집어 한 번 더 조직을 파쇄하였다. 파쇄 한 조직을 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)로 분리한 뒤 RNA 4 ㎍을 DiaStar 2X RT Pre-Mix(SolGent co.
- 그 후 AH109 strain의 reporter 유전자 중 하나인 Histidine이 빠진 SD Trp-, His- (+3AT) 배지에 농도별로 배양하여 colony 생성여부를 관찰하였고, SD Trp-, His- (+3AT) 배지에 계대한 후 ONPG 를 기질로 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다.
- 그 후 SD Ura-, Trp-배지에 계대하였고, O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)를 기질로 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다.
- , 2000). 애기장대에서 아미노산 서열의 유사성에 따라 75개의 bZIP 전사인자를 10개의 subfamilies로 분류하였다. 이 중 A group은 13개의 ABF를 포함하며, 주로 성장하는 조직에서 ABA 혹은 스트레스 신호전달에 관련된 역할을 한다(Jakoby et al.
- 야생형 벼(Oryza sativa L. cv. Dongjin)에서 OsABF3 full length cDNA, OsABF3△N, OsABF3△C를 클로닝하기 위해 각각의 primer를 제작한 후(Table 1), Ex Taq (Takara)을 이용하여 PCR하여 각각 증폭시킨 뒤 전기영동으로 확인하였다. PCR 증폭 산물인 각각의 DNA 조각을 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction Kit (iNtTON)을 이용하여 elution 한 뒤 NdeI, EcoRI restriction enzyme (NEB)를 이용하여 PCR product 양 끝과 pGADT7, pGBKT7 벡터를 절단한 뒤 각각의 벡터에 클로닝 하였다.
- CaMV35S promoter가 포함된 벡터에 각각 클로닝 된 GFP-OsABF3, OsABF3-GFP fusion clone을 PEG-calcium mediated method를 이용하여 옥수수 mesophyll 원형질체에 형질전환한 후 12-24시간 동안 incubation하여 발현을 관찰하였다. 이 때 chlorophyll auto-fluorescence를 chloroplast marker로 OsABF1-RFP를 nuclear marker로 사용하였고, fusion protein의 발현은 confocal microscope (LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Germany)를 이용하여 관찰하였다.
- 따라서 우리는 벼에서 group A bZIP 전사인자인 OsABF3(Oryza sativa ABA responsive element binding factor 3)를 연구하였다. 이를 위해 벼의 다양한 조직과 다양한 스트레스(가뭄, 염분, 저온, ABA, 산화 스트레스)에 따른 OsABF3 발현 패턴을 분석하였다. 또한 maize의 원형질체에서 GFP fusion 벡터를 사용한 세포 내 위치 분석을 통해 OsABF3가 핵단백질이라는 것을 확인하였다.
- 줄기와 잎 그리고 비 생물학적 스트레스 조건에서 OsABF3의 발현 패턴을 분석하기 위해 정상 조건과 비 생물학적 스트레스 (가뭄, 염분, 저온, ABA, 산화) 조건에서 키운 잎을 각각 시간대 별로 RT-PCR을 수행 하였다. 결과적으로 가뭄(Fig.
- 클로닝 된 플라스미드들과 양성 대조군들을 yeast strain YIP에 삽입하여 SD Ura-, Leu- 배지에 배양하였고, ONPG기질을 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다(Fig. 3).
- 클로닝 된 플라스미드와 양성대조군인 BD: OsABF1, BD: OsABF2와 음성대조군인 pGBKT7 벡터를 yeast strain AH109에 형질 전환하여 SD Trp-, His- 배지에서 농도별로 키워 콜로니 생성여부를 관찰하였고(Fig. 4A), ONPG 기질을 이용하여 β-galactosidase activity를 측정하였다(Fig. 4B).
- 파쇄 한 조직을 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)로 분리한 뒤 RNA 4 ㎍을 DiaStar 2X RT Pre-Mix(SolGent co., Ltd.)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, OsABF3 RT-PCR Primer (Table 1)와 FR-Taq polymerase (Biomedic)로 PCR (95℃ 5분 – 1 cycle/ 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분 – 30 cycle/ 72℃ 10분 – 1 cycle) 한 뒤 2% agarose gel로 전기영동으로 확인하였다(Fig. 1).
대상 데이터
- 야생형 벼(Oryza sativa L. cultivar Dongjin) 표면을 70% ethanol로 소독하고 멸균수에 4℃, 암상태에서 하루 동안 침종 시킨 후 식물 배양기에서 2주간 수경재배하였다(28℃, 80% humidity, 14/10시간 day/night photoperiod). 2주간 키운 벼를 각각의 가뭄(10% polyethylene glycol (PEG)), 염분(250 mM NaCl), 산화스트레스(10 ㎛ Methyl Viologen (MV)), 저온(4℃), ABA (100 ㎛) 스트레스를 0, 3, 6, 12, 24, 48시간 동안 처리하였다.
이론/모형
- OsABF3의 transactivation 능력을 측정하기 위해 yeast one-hybrid 실험을 이용하였다. pGBKT7 벡터에 각각 클로닝된 OsABF3 full-length cDNA, OsABF3△N, OsABF3△C 플라스미드(Fig.
성능/효과
- 그 결과 OsABF3△C에 비해 OsABF3△N이 높게 측정되었다. Cis-acting element가 포함된 ABREs와 OsABF3가 결합하는데 OsABF3 C-terminal 부분이 필수적이라는 것을 확인하였다.
- CaMV35S 프로모터에 의해 제어되는 GFP-OsABF3와 OsABF3-GFP fusion 단백질을 옥수수 mesophyll 원형질체에 삽입시킨 뒤 형광 현미경으로 발현을 관찰하여 OsABF3의 세포내 위치를 확인하였다. OsABF1-RFP를 핵 표지자로 사용하였으며, GFP-OsABF3와 OsABF3-GFP fusion protein 모두 옥수수(mazie) 원형질체의 핵에서 발현됨을 알 수 있었다(Fig. 2). 따라서 OsABF3는 핵 단백질임이 증명되었다.
- 또한 maize의 원형질체에서 GFP fusion 벡터를 사용한 세포 내 위치 분석을 통해 OsABF3가 핵단백질이라는 것을 확인하였다. Yeast one-hybrid 실험을 통해 OsABF3의 C-terminal 부분이 ABREs에 결합한다는 것과 N-terminal 부분이 하위 유전자의 transactivation 하는데 필요하다는 것을 알 수 있었다. 그리고 T-DNA가 삽입된 OsABF3의 homozygous 돌연변이체가 야생형과 과발현체에 비해 발아와 발아 후 단계에서 고농도의 ABA에 대한 민감도가 더 감소한 것을 알 수 있었다.
- 줄기와 잎 그리고 비 생물학적 스트레스 조건에서 OsABF3의 발현 패턴을 분석하기 위해 정상 조건과 비 생물학적 스트레스 (가뭄, 염분, 저온, ABA, 산화) 조건에서 키운 잎을 각각 시간대 별로 RT-PCR을 수행 하였다. 결과적으로 가뭄(Fig. 1B), 산화 (Fig. 1D), 저온(Fig. 1E) 스트레스를 처리 후 3시간 때부터 OsABF3의 전사량이 증가하였으며, 저온 스트레스는 증가된 상태가 계속적으로 유지되는 반면 가뭄과 산화 스트레스는 각각 6시간, 12시간 때부터 급격하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 염분(Fig.
- 그리고 T-DNA가 삽입된 OsABF3의 homozygous 돌연변이체가 야생형과 과발현체에 비해 발아와 발아 후 단계에서 고농도의 ABA에 대한 민감도가 더 감소한 것을 알 수 있었다. 결과적으로 종합해 볼 때 OsABF3는 ABA의 의존적인 경로를 통해 비 생물학적 스트레스에 반응하는 유전자의 발현을 조절하는 기능을 하는 전사 조절자이다. 또한 OsABF3의 transactivation을 측정하는 실험에 있어서 억제 domain이 존재한다는 결과를 얻었다.
- 4B). 그 결과 BD: OsABF3△C에서는 전사촉진 능력이 관찰되었지만, BD:OsABF3와 BD:OsABF3△N에서는 관찰되지 않았다. 이것은 OsABF3의 N-terminal 부분도 transactivation 하는데 꼭 필요한 부분이라는 것을 알 수 있었으며, OsABF3 N-terminal 부분은 하위 유전자의 전사를 조절하는 transcriptional activator라는 것을 알수 있었다.
- 3). 그 결과 OsABF3△C에 비해 OsABF3△N이 높게 측정되었다. Cis-acting element가 포함된 ABREs와 OsABF3가 결합하는데 OsABF3 C-terminal 부분이 필수적이라는 것을 확인하였다.
- Yeast one-hybrid 실험을 통해 OsABF3의 C-terminal 부분이 ABREs에 결합한다는 것과 N-terminal 부분이 하위 유전자의 transactivation 하는데 필요하다는 것을 알 수 있었다. 그리고 T-DNA가 삽입된 OsABF3의 homozygous 돌연변이체가 야생형과 과발현체에 비해 발아와 발아 후 단계에서 고농도의 ABA에 대한 민감도가 더 감소한 것을 알 수 있었다. 결과적으로 종합해 볼 때 OsABF3는 ABA의 의존적인 경로를 통해 비 생물학적 스트레스에 반응하는 유전자의 발현을 조절하는 기능을 하는 전사 조절자이다.
- 이것은 OsABF3의 N-terminal 부분도 transactivation 하는데 꼭 필요한 부분이라는 것을 알 수 있었으며, OsABF3 N-terminal 부분은 하위 유전자의 전사를 조절하는 transcriptional activator라는 것을 알수 있었다. 더 나아가 OsABF3 전체 cDNA에서 transactivation 이 억제된 것으로 보아 OsABF3의 C-terminal 부분에 trans-activation을 저해하는 부분이 존재할 것이라는 추측하였다.
- 결과적으로 종합해 볼 때 OsABF3는 ABA의 의존적인 경로를 통해 비 생물학적 스트레스에 반응하는 유전자의 발현을 조절하는 기능을 하는 전사 조절자이다. 또한 OsABF3의 transactivation을 측정하는 실험에 있어서 억제 domain이 존재한다는 결과를 얻었다.
- 이를 위해 벼의 다양한 조직과 다양한 스트레스(가뭄, 염분, 저온, ABA, 산화 스트레스)에 따른 OsABF3 발현 패턴을 분석하였다. 또한 maize의 원형질체에서 GFP fusion 벡터를 사용한 세포 내 위치 분석을 통해 OsABF3가 핵단백질이라는 것을 확인하였다. Yeast one-hybrid 실험을 통해 OsABF3의 C-terminal 부분이 ABREs에 결합한다는 것과 N-terminal 부분이 하위 유전자의 transactivation 하는데 필요하다는 것을 알 수 있었다.
- 1E) 스트레스를 처리 후 3시간 때부터 OsABF3의 전사량이 증가하였으며, 저온 스트레스는 증가된 상태가 계속적으로 유지되는 반면 가뭄과 산화 스트레스는 각각 6시간, 12시간 때부터 급격하게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 염분(Fig. 1C), ABA (Fig. 1F)를 처리 했을 때에는 6시간 때부터 전사량이 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, 염분 스트레스에서는 계속적으로 증가된 상태가 유지되었지만 ABA 스트레스를 처리 했을 때에는 24시간 때부터 전사량이 약하게 감소되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 보아 OsABF3의 전사는 다양한 비 생물학적 스트레스에 의해 증가됨을 알 수 있었다.
- 그 결과 BD: OsABF3△C에서는 전사촉진 능력이 관찰되었지만, BD:OsABF3와 BD:OsABF3△N에서는 관찰되지 않았다. 이것은 OsABF3의 N-terminal 부분도 transactivation 하는데 꼭 필요한 부분이라는 것을 알 수 있었으며, OsABF3 N-terminal 부분은 하위 유전자의 전사를 조절하는 transcriptional activator라는 것을 알수 있었다. 더 나아가 OsABF3 전체 cDNA에서 transactivation 이 억제된 것으로 보아 OsABF3의 C-terminal 부분에 trans-activation을 저해하는 부분이 존재할 것이라는 추측하였다.
- 1F)를 처리 했을 때에는 6시간 때부터 전사량이 증가된 것을 관찰할 수 있었으며, 염분 스트레스에서는 계속적으로 증가된 상태가 유지되었지만 ABA 스트레스를 처리 했을 때에는 24시간 때부터 전사량이 약하게 감소되는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 보아 OsABF3의 전사는 다양한 비 생물학적 스트레스에 의해 증가됨을 알 수 있었다.
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