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문제 정의
- sanguinea와 이를 감염시키는 포식성 기생생물 Amoebophrya sp.의 숙주-기생생물 시스템을 이용하여 수온에 따른 포식성 기생생물의 감염성공률과 생존율의 변화에 대해 알아보았고, 각 수온에 따라 포식성 기생생물의 감염율과 숙주 세포내 발달 및 총 세대시간의 변화를 측정하였으며, 이러한 결과를 바탕으로 실제 해양생태계에서 숙주개체군 제거율에 미치는 영향에 대해 규명하고자 하였다.
제안 방법
- 각 온도 조건하에서 포식 기생생물의 생존율을 알기 위해, 감염된 숙주세포에서 빠져나온 지 6시간 이내의 기생생물의 쌍편모자를 멸균된 여과지(10 µm pore size, polycarbonate filter)를 이용하여 중력식 여과법(gravity filtration)으로 걸러서 숙주 세포를 제거한 다음, 각 실험온도에서 시간에 따라 쌍편모자의 세포밀도의 변화를 측정하였다.
- 포식성 기생생물 Amoebophrya sp.는 2-3일 간격으로 주 3회마다 지수성장기의 숙주를 공급하는 계대배양으로 유지하였다. 배양의 온도와 염분은 각각 20℃와 29에서 수행하였고, 광도는 80 µmol m-2s-1(형광램프)의 14L:10D의 광주기 조건에서 배양하여 실험에 이용하였다.
- 숙주의 초기 세포밀도는 약 1000 cells/mL이 되도록 접종하였고, 포식 기생생물은 숙주에서 빠져 나온 지 6시간 이내의 쌍편모자(dinospore)를 수확하여, 숙주와 포식성 기생생물의 개체수 비율이 1:5가 되도록 접종하여 실험을 진행하였다. 매 6-8 시간 간격으로 피펫을 이용하여 일정량의 시료를 분취하여 최종농도 1%가 되도록 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정하였다. 고정한 시료는 Sedgwick Rafter 계수기를 이용하여 Coats and Bockstahler (1994)의 방법에 따라 청색필터(Filter set 09, BP 450-490 excitation, beam splitter FT 510, emission LP515)가 장착된 형광현미경(Axio Imager A2, Carl Zeiss, Germany)하에서 감염된 숙주 세포수를 계수하여 감염율을 측정하였고, 이 때 포식성 기생생물의 세포밀도는 혈구계수기(hemocytometer)을 이용하여 계수하였다.
- 수온에 따른 포식 기생생물의 생존율과 감염성공률의 변화를 측정하기 위해, 위에서 기술한 바와 같이 각 실험온도(15℃, 20℃, 25℃)에서 서서히 적응시킨 숙주-기생생물 배양체를 이용하였다. 각 온도 조건하에서 포식 기생생물의 생존율을 알기 위해, 감염된 숙주세포에서 빠져나온 지 6시간 이내의 기생생물의 쌍편모자를 멸균된 여과지(10 µm pore size, polycarbonate filter)를 이용하여 중력식 여과법(gravity filtration)으로 걸러서 숙주 세포를 제거한 다음, 각 실험온도에서 시간에 따라 쌍편모자의 세포밀도의 변화를 측정하였다.
- 숙주는 지수성장기의 A. sanguinea 배양체를 각 3개 반복구의 500 mL 플라스크에 300 mL씩 나누어 담은 후 각 플라스크를 초기 배양온도인 20℃에서 각 실험 온도(15℃, 20℃, 25℃)에 적응시키기 위해 매일 1℃씩 서서히 증감하여 각 실험온도에 도달하도록 하였다. 최종적으로 각 온도에서 적응시킨 배양체를 100 mL씩 분주하여 3개의 반복구를 설정하여 실험에 이용하였다.
- 포식성 기생생물 배양체도 숙주와 같은 방법으로 각 온도 조건에서 숙주 배양체와 함께 서서히 적응시켜 실험에 이용하였다. 숙주의 초기 세포밀도는 약 1000 cells/mL이 되도록 접종하였고, 포식 기생생물은 숙주에서 빠져 나온 지 6시간 이내의 쌍편모자(dinospore)를 수확하여, 숙주와 포식성 기생생물의 개체수 비율이 1:5가 되도록 접종하여 실험을 진행하였다. 매 6-8 시간 간격으로 피펫을 이용하여 일정량의 시료를 분취하여 최종농도 1%가 되도록 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정하였다.
- sanguinea 배양체를 각 3개 반복구의 500 mL 플라스크에 300 mL씩 나누어 담은 후 각 플라스크를 초기 배양온도인 20℃에서 각 실험 온도(15℃, 20℃, 25℃)에 적응시키기 위해 매일 1℃씩 서서히 증감하여 각 실험온도에 도달하도록 하였다. 최종적으로 각 온도에서 적응시킨 배양체를 100 mL씩 분주하여 3개의 반복구를 설정하여 실험에 이용하였다. 포식성 기생생물 배양체도 숙주와 같은 방법으로 각 온도 조건에서 숙주 배양체와 함께 서서히 적응시켜 실험에 이용하였다.
- 포식성 기생생물 Amoebophrya의 쌍편모자(dinospore)를 숙주인 적조생물 A. sanguinea 배양체에 접종한 이후, 시간이 경과함에 따라 적조생물 세포내로 침투하여 감염시킨 후 숙주 물질을 이용하여 성장하면서 성숙이 완료되면 기생생물이 숙주를 죽이고 수중으로 빠져 나오면서 연충형(vermiform) 단계를 거쳐 다음 세대의 수백 개의 쌍편모자를 생성하였다(Fig. 1). 각 온도 조건에서 포식성 기생생물의 초기 감염율을 측정한 결과, 25℃와 20℃에서는 각각 53 ± 2.
- 최종적으로 각 온도에서 적응시킨 배양체를 100 mL씩 분주하여 3개의 반복구를 설정하여 실험에 이용하였다. 포식성 기생생물 배양체도 숙주와 같은 방법으로 각 온도 조건에서 숙주 배양체와 함께 서서히 적응시켜 실험에 이용하였다. 숙주의 초기 세포밀도는 약 1000 cells/mL이 되도록 접종하였고, 포식 기생생물은 숙주에서 빠져 나온 지 6시간 이내의 쌍편모자(dinospore)를 수확하여, 숙주와 포식성 기생생물의 개체수 비율이 1:5가 되도록 접종하여 실험을 진행하였다.
대상 데이터
- 이 숙주-기생 생물 배양체는 염분 15에서 분리 배양되었으나, 본 실험에 이용하기 위해 염분을 서서히 증가하여 최종 29에 적응시켜 이용하였다. 숙주인 A. sanguina는 염분이 29인 멸균 여과해수에 규산염을 제외한 f/2-Si 배지(Guillard and Ryther, 1962)를 이용하여 배양하였다. 포식성 기생생물 Amoebophrya sp.
- 본 연구에 이용된 유해 적조 유발성 와편모류 Akashiwo sanguinea와 이를 감염시키는 포식성 기생생물 Amoebophrya sp.의 숙주-기생생물 시스템은 미국 스미스소니언 환경연구소에서 분양받아 이용하였다(Coats and Park, 2002). 이 숙주-기생 생물 배양체는 염분 15에서 분리 배양되었으나, 본 실험에 이용하기 위해 염분을 서서히 증가하여 최종 29에 적응시켜 이용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 측정한 자료는 평균(± 표준오차)로 제시하였으며, 평균 간의 유의성을 검증하기 위해 IBM SPSS statistics 23.0 program을 이용하여 T-검정 및 일원분산분석(one-way ANOVA test)을 수행하여 분석하였다.
이론/모형
- 이는 일정시간 간격에 따라 피펫을 이용하여 3 ml의 시료를 취한 후, 최종농도 1%가 되도록 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정한 다음, 형광현미경하에서 혈구계수기(hemocytometer)를 이용하여 계수하였다. 각 온도별 쌍편모자의 시간에 따른 사멸속도(k)는 쌍편모자 세포밀도 변화 자료를 다음과 같은 단일이변량지수감소곡선(single two-parameter exponential decay curve)식에 대입하여 비선형 최소자승법으로 각 변수들을 구하였다.
- 매 6-8 시간 간격으로 피펫을 이용하여 일정량의 시료를 분취하여 최종농도 1%가 되도록 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정하였다. 고정한 시료는 Sedgwick Rafter 계수기를 이용하여 Coats and Bockstahler (1994)의 방법에 따라 청색필터(Filter set 09, BP 450-490 excitation, beam splitter FT 510, emission LP515)가 장착된 형광현미경(Axio Imager A2, Carl Zeiss, Germany)하에서 감염된 숙주 세포수를 계수하여 감염율을 측정하였고, 이 때 포식성 기생생물의 세포밀도는 혈구계수기(hemocytometer)을 이용하여 계수하였다. 포식 기생생물의 숙주 세포내 발달시간은 Coats and Bockstahler (1994)의 방법에 의해 계산하였고, 포식 기생생물의 총 세대시간(Generation Time; GT)은 Coats and Park (2002)에 따라 기생생물 쌍편모자를 숙주에 접종하여 숙주를 감염시킨 다음, 숙주를 죽이고 다시 새로운 세대의 쌍편모자가 출현하기 시작하여 최대 세포밀도를 나타내는 시점까지의 세포밀도를 각 시간에 따라 면적을 적분한 다음, 적분한 면적의 1/2에 해당하는 시간을 계산하여 산출하였다.
- 고정한 시료는 Sedgwick Rafter 계수기를 이용하여 Coats and Bockstahler (1994)의 방법에 따라 청색필터(Filter set 09, BP 450-490 excitation, beam splitter FT 510, emission LP515)가 장착된 형광현미경(Axio Imager A2, Carl Zeiss, Germany)하에서 감염된 숙주 세포수를 계수하여 감염율을 측정하였고, 이 때 포식성 기생생물의 세포밀도는 혈구계수기(hemocytometer)을 이용하여 계수하였다. 포식 기생생물의 숙주 세포내 발달시간은 Coats and Bockstahler (1994)의 방법에 의해 계산하였고, 포식 기생생물의 총 세대시간(Generation Time; GT)은 Coats and Park (2002)에 따라 기생생물 쌍편모자를 숙주에 접종하여 숙주를 감염시킨 다음, 숙주를 죽이고 다시 새로운 세대의 쌍편모자가 출현하기 시작하여 최대 세포밀도를 나타내는 시점까지의 세포밀도를 각 시간에 따라 면적을 적분한 다음, 적분한 면적의 1/2에 해당하는 시간을 계산하여 산출하였다.
성능/효과
- 3(a)). 15℃에서는 다른 높은 온도 조건보다 초기에 급격한 개체수의 감소를 나타내었지만, 시간이 지날수록 생존기간은 오히려 가장 긴 것으로 나타났다(Fig. 3(a)).
- 반면, 15℃에서는 쌍편모자의 숙주생물에 대한 감염율이 시간에 따라 점차 감소하였지만, 생존기간은 가장 길게 나타나 8일 동안 감염능력을 유지하는 것으로 나타났다. 20℃에서는 쌍편모자의 생존기간이 길고 감염율이 느리게 감소하여 쌍편모자 개체당 감염성공률이 비교적 오랫동안 지속되면서 11일 동안 감염능력을 가지는 것으로 나타났다(Table 3, Fig. 3).
- 각 온도 조건별 포식 기생생물의 숙주 세포내 발달 시간을 산출해 본 결과, 15℃, 20℃, 25℃에서 각각 102 ± 5.4 h, 56 ± 4.0 h, 36 ± 0.2 h의 범위로서 온도가 낮을수록 세포내 발달 시간이 매우 길어지는 것으로 나타났다(Table 1, One way ANOVA; post-hoc Tukey test; p < 0.0001).
- 각 온도 조건에서 시간에 따른 숙주 A. sanguinea에 대한 쌍편모자의 감염성공율을 측정해 본 결과, 25℃와 20℃에서는 쌍편모자의 초기 감염성공율(To)이 각각 7.9 ± 0.06%와 7.4 ± 0.48%의 범위를 나타내었고, 15℃에서는 3.6 ± 0.07%의 범위로 가장 낮은 수치를 나타내었다(Table 3, Fig. 3
- 0001). 각 온도 조건에서 적조생물 A. sanguinea는 포식 기생생물의 감염과 발달이 진행되면서 25℃에서는 136시간, 20℃에서는 234시간, 15℃에서는 291시간이 경과 후에 모두 사멸하였다(Fig. 2). 반면에, 기생생물을 첨가하지 않은 대조구에서는 A.
- 각 온도 조건에서 포식성 기생생물의 초기 감염율을 측정한 결과, 25℃와 20℃에서는 각각 53 ± 2.2% (n=3, T40)와 38 ± 0.4% (n=3, T60)를 나타낸 반면, 15℃에서는 28 ± 0.8% (n=3, T87)를 보여 비교적 낮은 감염율을 나타내었다(Table 1).
- 각 온도조건에서 감염율(parasite prevalence)은 25℃에서 71.5 ± 0.30%의 범위로 가장 높게 나타났고, 20℃와 15℃에서는 각각 54.3 ± 1.68%와 29.6 ± 1.42%의 범위를 나타내어 온도가 낮아질수록 감염율이 크게 감소하는 것으로 나타났다(Table 3, Fig. 3
- 각 온도조건에서 시간에 따른 쌍편모자 개체수의 변화율을 단일이변량지수감소곡선식(single two-parameter exponential decay curve)에 대입하여 비선형 최소자승법으로 각 변수들을 구한 결과, 25℃에서 배양한 쌍편모류의 개체수는 시간에 따라 가장 높은 감소율(k = -0.30, r2 = 0.89, p = 0.0015)을 나타내었고, 20℃(k = -0.20, r2 = 0.93, p < 0.0001)와 15℃(k = -0.28, r2 = 0.96, p < 0.0001)에서는 상대적으로 시간에 따라 낮은 개체수의 감소율을 나타내었다(Table 2, Fig. 3
- 이는 본 연구 결과에서 알 수 있듯이 20℃ 이하로 수온이 낮아질수록 와편모류 개체군에 대한 감염율이 급격히 저하될 뿐 아니라, 감염 후 포식 기생생물이 숙주 세포내 성장 및 발달시간이 매우 길어지므로 감염능력을 가진 다음 세대의 포식성 기생생물 쌍편모자가 생성되는 데 걸리는 총 세대시간이 급격히 길어지게 된다. 결과적으로, 수온이 낮을수록 포식 기생생물에 의한 숙주개체군의 제거율을 감소시켜 저수온기에 A. sanguinea에 의한 고밀도의 적조가 형성되어 장기간 유지되었을 것으로 유추할 수 있다. 따라서 저수온기에는 숙주개체군에 대한 포식성 기생생물의 감염과 같은 하향조절에 의한 영향이 크게 낮아질 수 있으며, 이는 결과적으로 추계 및 동계 적조의 고밀도화와 장기화를 유발하는 요인이 될 수 있음을 시사한다.
- 3(c)). 그러나 시간이 경과할수록 25℃에서는 쌍편모자의 생존기간이 가장 낮았고, 감염률도 급격하게 낮아져 쌍편모자 개체당 감염성공률이 가장 빠르게 감소하여 6일 경과 시에 모두 감염능력을 잃은 것으로 나타났다(Table 3, Fig. 3). 반면, 15℃에서는 쌍편모자의 숙주생물에 대한 감염율이 시간에 따라 점차 감소하였지만, 생존기간은 가장 길게 나타나 8일 동안 감염능력을 유지하는 것으로 나타났다.
- sanguinea에 의한 고밀도의 적조가 형성되어 장기간 유지되었을 것으로 유추할 수 있다. 따라서 저수온기에는 숙주개체군에 대한 포식성 기생생물의 감염과 같은 하향조절에 의한 영향이 크게 낮아질 수 있으며, 이는 결과적으로 추계 및 동계 적조의 고밀도화와 장기화를 유발하는 요인이 될 수 있음을 시사한다.
- 3). 반면, 15℃에서는 쌍편모자의 숙주생물에 대한 감염율이 시간에 따라 점차 감소하였지만, 생존기간은 가장 길게 나타나 8일 동안 감염능력을 유지하는 것으로 나타났다. 20℃에서는 쌍편모자의 생존기간이 길고 감염율이 느리게 감소하여 쌍편모자 개체당 감염성공률이 비교적 오랫동안 지속되면서 11일 동안 감염능력을 가지는 것으로 나타났다(Table 3, Fig.
- 그러나 지금까지 이러한 적조생물을 감염시키는 포식성 기생생물의 감염력에 대해 수온과 같은 물리적 환경요인이 미치는 영향에 대해 연구한 자료는 전무하다. 본 연구에서는 포식성 기생생물의 감염율과 세대시간에 대해 물리적 환경 요인인 수온에 따른 영향을 조사한 결과, 수온에 따라서 포식성 기생생물의 감염력이 유의한 차이를 나타낼 뿐 아니라, 포식성 기생생물의 숙주 세포내에서의 발달시간과 세대시간에서도 유의한 차이를 보이는 것으로 나타났다. 즉, 낮은 수온에서는 숙주 세포내 발달이 느려지게 되어 총 세대시간이 매우 길어지는 결과를 나타내었다.
- 이 두 가지 유전자형의 A. sanguinea 종주를 단일세포로 분리하여 실내 배양 실험을 수행한 결과, 유전자형 A타입은 저수온에서 상대적으로 높은 생장률을 나타낸 반면, 유전자 B타입은 고수온에서 더 높은 생장률을 보여 현장 모니터링 결과를 뒷받침하는 결과를 보였다.
- 다른 한편, 이는 숙주개체군의 밀도가 낮은 동계에 낮은 감염율과 숙주세포 내에서 포식성 기생생물의 발달시간이 느려짐으로써, 숙주개체군 제거 속도가 느려지고, 해양생태계 내에서 이용가능한 숙주개체군을 모두 사멸시키는 것을 막아 월동을 위한 하나의 생존전략이 될 수 있다. 즉, 본 연구 결과에서 나타난 것처럼 수온이 낮을수록 포식성 기생생물의 감염율은 상대적으로 낮아지지만, 포식성 기생생물의 개체수와 감염성공율이 상대적으로 천천히 감소하게 되어 감염력이 보다 오랫동안 유지되기 때문에 숙주 밀도가 낮은 동계시기동안 생존하는 데 유리할 것으로 판단된다.
- 한 예로 숙주세포의 영양학적 질과 밀접한 관련을 가질 수 있는 서식환경의 영양염 조건에 의해 영향을 받을 수 있다. 즉, 부영양 환경보다 빈영양 환경에서 성장한 숙주를 감염시키는 포식성 기생생물은 세대시간에서는 유의한 차이를 나타내지 않았지만, 숙주개체군에 대한 감염율은 빈영양환경보다 부영양 환경에서 더 높은 감염율을 나타내었다.(Yih and Coats, 2000).
- , 2017). 즉, 유전자형 A타입은 일년 내내 출현하다가, 수온이 낮은 동계와 춘계에 상대적으로 높은 출현밀도를 나타낸 반면에, 유전자형 B타입은 고수온기인 하계에만 높은 밀도로 출현하는 것으로 조사되었다. 이 두 가지 유전자형의 A.
- 포식 기생생물 Amoebophrya 쌍편모자의 세포 밀도는 숙주 A. sanguinea를 감염시킨 다음 성숙이 완료되어 숙주세포를 죽이고 다시 수중으로 방출되면서 시간에 따라 점차 급격하게 증가하는 경향을 보이며, 25℃와 20℃의 온도 조건에서는 접종한 지 64시간과 96시간 경과한 후에 각각 120 ± 0.3 × 103 cell/ml (mean ± SE, n=3)와 125 ± 0.7 × 103 cell/ml (mean ± SE, n=3)의 세포밀도를 나타내었고 다시 새로운 숙주세포를 감염시키면서 개체수가 감소하다가 다음 세대의 쌍편모자가 출현하는 경향을 나타내었다(Fig.
- 포식 기생생물 Amoebophrya의 쌍편모자는 숙주가 없는 조건에서, 시간이 지남에 따라 개체수가 점차 감소하는 양상을 나타내었으며, 25℃ 온도에서 쌍편모자의 생존기간(survival time)은 7일로 나타났으며, 20℃에서는 12일, 15℃에서는 13일 경과 후에 모두 사멸하는 것으로 나타났다(Fig. 3(a)).
- 포식성 기생생물의 총 세대시간을 추정한 결과, 25℃에서는 약 58 ± 0.1 h과 20℃에서는 83 ± 0.1 h, 15℃에서는 115 ± 0.1 h의 범위를 나타내어 각 온도 조건에서 총 세대시간은 유의한 차이를 보였으며, 온도가 낮아질수록 포식성 기생생물의 세대시간이 급격하게 증가하는 것으로 나타났다(Table 1, one-way ANOVA; Tukey test; p < 0.0001).
후속연구
- sanguinea를 감염시키는 포식성 기생생물이 다른 유전자형의 A타입을 감염시키지 못하거나 혹은 상대적으로 낮은 감염율을 나타낼 가능성이 있다. 이러한 가능성은 추후에 국내에서 저수온기와 고수온기에 출현한 A. sanguinea의 유전자형과 출현현황을 조사하고, 각 시기별 출현한 숙주의 유전자형에 대한 포식성 기생생물의 감염력이 유의한 차이를 나타내는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
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