[논문]항산화 식물의 페놀성화합물에 의한 PC12 세포보호 효과연구

유소현; 김건희

doi:10.7318/kjfc/2018.33.1.86

문제 정의

따라서 본 연구에서는 삼지구엽초 내의 다양한 플라보노이드 배당체들 중에서 항산화 효과에 가장 크게 기여하는 물질을 확인하기 위하여 DPPH 실험법을 통해 삼지구엽초의 주요 기능성 물질로 보고된 이카린, 이카리사이드 I, 이카리 사이드 II, 이카리틴, 에피메딘 A-C의의 라디칼 소거 활성을 스크리닝 하였다.
따라서 본 연구에서는 삼지구엽초 추출물의 항산화 활성을 측정하였으며, 그 항산화 활성이 삼지구엽초의 어떤 기능성 플라보노이드로부터 기인한 것인지를 확인하기 위하여 200 µg/mL의 농도에서 이카린, 이카리사이드(icariside I), 이카리사이드 II(icariside II), 이카리틴(icaritin), 에피메딘 A (epimedin A), 에피메딘 B (epimedin B) 및 에피메딘 C (epimedin C)의 DPPH 라디칼 소거 활성을 비교한 후, 가장 좋은 활성을 나타낸 이카린과 이카리사이드의 항산화 활성을 측정하였으며, 삼지구엽초 추출물과 두 플라보노이드의 PC12 세포 보호효과를 확인하였다.
본 실험에서 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I의 항산화 활성 및 세포 보호 효과를 확인하였다. DPPH, ABTS 및 FRAP 실험 결과, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I에서 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 보였으며, H₂O₂에 대한 PC12 세포 보호 실험에서도 모두 세포 보호 효과를 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 삼지구엽초(Epimedium Koreanum Nakai), 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체인 이카린과 이카리사이드 I의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH, ABTS 및 FRAP 실험을 실시하였으며, H₂O₂로 유도한 PC12 세포를 이용하여 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다. 추출 용매로는 70% 에탄올을 사용하였으며 DPPH 실험을 통해 7개의 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체의 라디칼 소거능을 스크리닝 하였으며, 그 중 이카린과 이카리사이드 I에서 가장 두드러진 활성을 보이는 것을 확인했다.

제안 방법

ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 라디칼 소거활성은 Re et al.(1999)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. ABTS 7.
각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자공여효과 (electron donating ability)를 통해 환원력을 측정하는 실험법으로 본 연구에서는 Ramos et al.(2003)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. 0.
(2003)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다. 0.3 mM DPPH 시료를 각 농도별 삼지구엽초 추출물, 이카린 그리고 이카리사이드 I 과 반응한 후 30분 뒤에 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복하여 시행했으며 평균값을 제시하여 아래의 식으로 라디칼 소거 활성을 확인하였다.
7개의 플라보노이드 성분들 중 이카린과 이카리사이드는 200 µg/mL에서 각각 57.8%와 59.2%로 가장 우수한 라디칼 소거능을 보였으며 [Figure 1], 위 실험 결과를 바탕으로 삼지구엽초 추출물과 이카린 및 이카리사이 드의 항산화 활성을 측정하였다.
FRAP (ferric reducing ability power) 실험은 Benzie & Strain(1996)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다.
따라서 본 실험에서는 삼지구엽초 추출물의 농도를 50-200 µg/mL까지 설정하였으며, 해당 농도에 함유되어 있는 이카린 및 이카리사이드 I은 5- 20 µg/mL의 농도에서 세포 생존율을 확인하였다[Figure 7].
따라서 본 연구에서는 삼지구엽초 250-1000 µg/mL에 함유되어 있는 이카린 및 이카리사이드 I의 항산화 활성 평가 실험 농도를 12.5-100 µg/mL 로 설정하였다.
이에 이카린과 이카리사이드의 C환에 붙은 작용기의 차이가 항산화활성에 기여한 것으로 판단된다. 본 연구에서 사용한 세 가지 항산화 실험 결과, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가했으며, 우수한 항산화 활성이 확인되어 세포내 항산화 효과를 측정하기 위해 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포 보호효과를 측정하였다.
삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I의 라디칼 소거 결과를 바탕으로 세포 내에서의 항산화 활성을 확인하기 위해 PC12 세포에 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후 세포 보호 효과를 확인하였다.
4%의 생존율을 보였다. 위 실험결과를 바탕으로 산화적 스트레스의 일종인 H₂O₂에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다.

대상 데이터

2014). 따라서 본 실험에서는 시료 추출 용매로 70% 에탄올을 사용하였다.
본 실험에 사용된 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 는 강원도 홍천에서 채집된 후 건조된 것을 2015년 3월 서울 경동시장에서 구입하였으며, 잎 부분을 분쇄기(FM-681, Hanil Co., Changwon, Korea)를 이용하여 분쇄하였다.
본 실험에서 사용한 PC12 세포는 쥐의 pheochromocytoma 에서 유도되었으며, 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. PC12 세포는 25 mM sodium bicarbonate, 5% fetal bovine serum, 10% horse serum, 50 units/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin을 포함하는 RPMI 1640배지에 접종하여 37ºC, 5% CO₂ 조건에서 24-48시간 배양하였다.

데이터처리

또한 SPSS (Statistical Package for Social Science, ver. 18, IBM, Chicago IL. USA)를 이용하여 p<0.05 수준에서 student t-test로 대조군과의 유의성을 확인하였으며, ANOVA test를 통해 각 군간의 유의성을 확인한 후 Duncan’s multiple range test로 각 군의 평균 차이를 분석하였다.
희석한 용액에 농도별 시료를 가하여 10분간 반응시킨 후 735 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3반복 실행하여 평균값을 제시하였고 아래의 식으로 ABTS 라디칼 소거 활성을 계산하였다.
모든 실험은 3회 반복 실시하여 평균값과 표준편차를 제시하였다. 또한 SPSS (Statistical Package for Social Science, ver.
농도별 시료에 FRAP reagent을 가하여 실온에서 20분간 암소에서 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 3반복 실행하여 평균값을 제시하였다.

이론/모형

항산화 활성 평가를 위한 농도는 Chen et al.(2007)의 삼지구엽초의 이카린 정량 분석 결과를 참고하였다. 정량 분석 결과 삼지구엽초 1000 µg/mL 당 약 61.
H2O2 (hydrogen peroxide)로 유도한 PC12 세포의 산화적 스트레스 억제 효과는 MTT assay로 측정하였다.
각 시료의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거 활성은 안정한 라디칼인 DPPH에 대한 전자공여효과 (electron donating ability)를 통해 환원력을 측정하는 실험법으로 본 연구에서는 Ramos et al.(2003)의 방법을 본 시료에 맞게 변형하여 측정하였다.

성능/효과

DPPH 및 ABTS 실험에서와 같이 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 결과를 보였다.
삼지구엽초 추출물 처리시, 200 µg/mL에서 121.6%로 아무것도 처리하지 않은 대조군 대비 가장 높은 세포 생존율을 보였다.
ABTS 라디칼 소거 활성은 모든 시료에서 농도 의존적으로 우수한 활성을 보였으며, 삼지구엽초 추출물은 1000 µg/mL에서 88.8%, 이카린과 이카리사이드 I은 100 µg/mL의 농도에서 각각 90.5, 91.0%의 라디칼 소거능을 보였다.
본 실험에서 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I의 항산화 활성 및 세포 보호 효과를 확인하였다. DPPH, ABTS 및 FRAP 실험 결과, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I에서 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하는 경향을 보였으며, H₂O₂에 대한 PC12 세포 보호 실험에서도 모두 세포 보호 효과를 확인할 수 있었다.
H2O2로 유도한 PC12 세포 보호 실험결과 삼지구엽초 추출물은 100 µg/mL, 이카리사이드 I 및 이카린은 20 µg/mL 농도까지 세포 보호 효과를 보였다.
PC12 세포에 H2O2를 처리한 결과, 대조군 대비 47.4%까지 세포가 사멸하였으며 이카린 처리군은 20 µg/mL에서 52.7%, 이카리사이드 I 처리군은 20 µg/mL에 서 50.6%의 세포 보호 효과를 보였다.
추출 용매로는 70% 에탄올을 사용하였으며 DPPH 실험을 통해 7개의 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체의 라디칼 소거능을 스크리닝 하였으며, 그 중 이카린과 이카리사이드 I에서 가장 두드러진 활성을 보이는 것을 확인했다. 그 후, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I을 이용하여 DPPH, ABTS 그리고 FRAP 실험을 진행하였으며, 세 실험에서 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 결과를 보였다. H₂O₂로 유도한 PC12 세포 보호 실험결과 삼지구엽초 추출물은 100 µg/mL, 이카리사이드 I 및 이카린은 20 µg/mL 농도까지 세포 보호 효과를 보였다.
DPPH 및 ABTS 실험에서와 같이 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 결과를 보였다. 모든 항산화 실험법에서 이카린과 이카리사이드 I을 각 농도별로 비교했을 때 이카리사이드 I이 통계적으로 더 높은 항산화 활성을 보였다. 이러한 결과는 이카린과 이카리사이드의 구조적인 차이에 의한 것으로 사료 되는데, 이카린은 C환에 람노스와 A환에 글루코스를 갖고 있는 구조를 이루고 있으며 [Figure 5], 이카린의 분해산물인 이카리사이드 은 이카린의 B환에서 람노스가 떨어진 구조를 이루고 있다(Qian et al.
삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I은 모두 농도 의존적으로 라디칼 소거 활성이 증가하였으며, 삼지구엽초 추출물은 1000 µg/ mL의 농도에서 41.7%의 라디칼 소거능을, 이카린은 및 이 카리사이드은 100 µg/mL의 농도에서 각각 40.6, 43.7%로 나타났다.
정량 분석 결과 삼지구엽초 1000 µg/mL 당 약 61.4-92.6 µg/mL의 이카린을 함유하고 있는 것으로 나타났다.
로 유도한 PC12 세포를 이용하여 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다. 추출 용매로는 70% 에탄올을 사용하였으며 DPPH 실험을 통해 7개의 삼지구엽초의 플라보노이드 배당체의 라디칼 소거능을 스크리닝 하였으며, 그 중 이카린과 이카리사이드 I에서 가장 두드러진 활성을 보이는 것을 확인했다. 그 후, 삼지구엽초 추출물, 이카린 및 이카리사이드 I을 이용하여 DPPH, ABTS 그리고 FRAP 실험을 진행하였으며, 세 실험에서 모두 농도 의존적으로 활성이 증가하는 결과를 보였다.
H₂O₂로 유도한 PC12 세포 보호 실험결과 삼지구엽초 추출물은 100 µg/mL, 이카리사이드 I 및 이카린은 20 µg/mL 농도까지 세포 보호 효과를 보였다. 현재 삼지구엽초의 지표물질로 이카린이 많이 알려져 있는데, 본 연구를 통해 이카린의 분해산물인 이카리 사이드 I의 기능적 효과를 확인할 수 있었다.

후속연구

아직까지 삼지구엽초의 기능성 지표물질인 이카린과 그 분해산물인 이카리사이드 I의 구조적인 특징 및 활성에 대한 연구가 부족한 실정이다. 따라서 그 차이에 따른 항산화 활성 연구가 요구되며, 앞으로 삼지구엽초 및 이카린과 이카리 사이드 I의 분자생물학적인 연구를 통하여 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포 보호 기전에 대한 규명이 이어져야 할 것으로 생각된다.

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	음양곽의 일종인 삼지구엽초의 효능은?	2013). 최근 연구에서 삼지구엽초는 불임, 발기부전, 신경쇠약, 항염증, 고혈압, 항산화 및 종양 억제 활성이 보고되었으며(Huang et al. 2016), 항바이러스 기능, 면역 증진 효과(Cho et al. 2015), 피부암 저해(Ken et al. 2016), 골밀도 증가를 통한 골다공증 예방 (Zhang et al. 2013)과 성호르몬인 estradiol 수치를 증가시킨다고 보고된 바 있다(Cho et al. 2015; Liu et al.
	음양곽이란?	음양곽(Epimedii Herba)은 삼지구엽초 또는 기타 동속 식물(매자나무과; Berberidaceae)의 지상부를 건조한 것을 말 하며(Cho et al. 2015) 종류로는 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 외에 유모음양곽(Epimedium pubescens Maximowicz), 음양곽(Epimedium brevicornum Maximowicz), 무산음양곽(Epimedium wushanense T.
	음양곽의 종류는?	음양곽(Epimedii Herba)은 삼지구엽초 또는 기타 동속 식물(매자나무과; Berberidaceae)의 지상부를 건조한 것을 말 하며(Cho et al. 2015) 종류로는 삼지구엽초(Epimedium koreanum Nakai) 외에 유모음양곽(Epimedium pubescens Maximowicz), 음양곽(Epimedium brevicornum Maximowicz), 무산음양곽(Epimedium wushanense T.S. Ying), 전엽음양곽 (Epimedium sagittatum Maximowicz)이 있다(Oh et al. 2013; Wu et al.

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