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문제 정의
- 따라서 본 연구는 녹용의 부산물인 녹각을 이용하여 원래 가지고 있던 효력에 더불어 발효를 통해 기능성 물질인 GABA가 강화된 고부가가치 기능성 발효 소재 개발을 위해서 젖산발효의 최적화를 수행하였다.
제안 방법
- GABA 생산을 위한 젖산 발효 배지는 녹각 추출물 100 mL에 포도당(glucose) 0-3 g, MSG 2.5-4.5 g, YE 0-0.5 g을 첨가한 후 121°C에서 15분간 멸균하여 제조하였다.
- MSG 및 GABA의 정성 분석을 위해 실리카 겔(silica gel) TLC plate는 10×20 cm의 크기로 잘라서 사용하였고, TLC 전개는 사각 chamber (30×25×10 cm)에서 수행하였다(25).
- MSG 및 GABA의 정성 분석을 위해 실리카 겔(silica gel) TLC plate는 10×20 cm의 크기로 잘라서 사용하였고, TLC 전개는 사각 chamber (30×25×10 cm)에서 수행하였다(25). MSG 잔존량과 GABA 함량 비교를 위한 standard로 MSG 0.5-1%와 GABA 0.51%를 사용하였다. 전개 용매는 acetic acid glacial:n-butylalcohol: 증류수(distilled water)를 1:3:1 (v/v)의 비율로 혼합하여 실온에서 3시간 이상 포화시켰다.
- 건조된 TLC plate에 발색시약인 0.2% ninhydrin 용액을 뿌리고, 100°C 감압 건조기에서 5-10분 동안 발색 시킨 후 발효물의 glutamic acid와 GABA spot을 확인하였다.
- 그 다음 단일 콜로니를 취하여 2회 계대배양한 후, 121°C에서 15분간 살균한 MRS broth에 L. plantarum EJ2014를 한 백금이 접종하여, 30°C에서 24시간 배양하여 스타터로 사용하였다.
- 녹각 5% (w/v)를 autoclave (121°C, 30 min), 가정용 한약 추출기(100°C, 40 h), 업체용 약탕기 (90°C, 48 h) 세 가지 추출방법에 따른 고형분 및 단백질 함량을 분석해 본 결과는 Table 1과 같다.
- 녹각을 세척한 후 증류수를 첨가하여 녹각 5% (w/w)를 제조하여 autoclave (121°C, 30 min), 한약 추출기(100°C, 40 h), 약탕기(90°C, 48 h)의 추출장치를 이용하여 추출을 진행하였다.
- 녹각의 추출조건에 따른 젖산발효의 GABA 생산 최적화를 위한 선행연구로서 autoclave, 한약 추출기, 약탕기를 이용해 추출한 녹각 추출물에 GABA 생산의 전구물질인 MSG 1.5%와 탄소원 및 질소 원으로 포도당 1.5% 및 YE 0.5%를 첨가하고 L. plantarumEJ2014 균주의 starter를 5% 접종하여 7일 동안 정치배양 조건에서 젖산발효를 진행하였다. 한약 추출기에서 얻어진 녹각 추출액이 다른 추출방법에 비해서 GABA 생산이 효과적임을 나타내었다.
- 본 연구에서는 녹각 추출물을 이용하여 GABA 생산 최적화를 위해 추출액의 농도, 질소 원인 YE, 탄소원 포도당, GABA 생성 전구물질 MSG 농도에 따른 최적 조건으로 YE 0.5%, 포도당 1.5%, MSG 3.5%를 첨가하여 30° C에서 7일간 젖산발효를 하였다.
- 상층액을 0.45 µm syringe filter로 여과하여 분석시료로 사용하였으며 HPLC 분석에 사용된 조건과 용매는 각각 column (Agilent SB-C18 infinity (2.1 mm ×150 mm), 1.8 μm),A (140 mM NaHAc, 0.1% triethanolamine, 6% CH3CN, pH 6.1) 100%로 용출 후 25분 동안 B (60% CH3CN) 100%가 되도록 혼합하면서 분당 1 mL로 흘려주었다.
- 생균수는 발효물 1 mL에 멸균 수 9 mL을 첨가하여 10배 희석법을 이용하여 104, 105, 106배로 희석된 것을 MRS agar plate에 20 µL 도말한 후, 30° C 항온 배양기에서 48시간 배양한 후 생균수를 CFU (colony forming unit)/mL으로 나타내었다(24).
- 표준물질로 bovine serum albumin(BSA) 단백질을 이용하여 최종 농도가 0, 20, 40, 60, 80, 100 µ g/mL 용액이 되도록 조제하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였고, 작성된 표준곡선을 바탕으로 시료의 단백질 농도를 측정하였다.
- 한약 추출기를 이용하여 얻은 녹각 추출액의 젖산발효를 통한 GABA 생산 시에 YE 농도에 따른 효과를 분석하였다(Fig. 2). 질소원과 탄소원으로 MSG 1.
- 한약 추출기를 이용하여 얻은 녹각 추출액의 젖산발효를 통한 GABA 생산 최적화를 위해서 포도당 1.5%, YE 0.5%를 포함한 녹각 추출액에 MSG 2.5-4.5% 농도별로 첨가하여 젖산발효를 수행하였다. 녹각 발효물의 pH 및 산도를 측정한 결과는 Fig.
대상 데이터
- L. plantarum EJ2014 starter는 MRS 액체배지에서 30°C에서 1일 동안 배양시킨 후 1% (v/v)를 접종하여 30°C 항온 배양기에서 7일간 발효하여 분석에 사용하였다.
- L. plantarum EJ2014를 DifcoTM Lactobacilli MRS broth agar (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 배지에 도말한 후, 30°C 항온 배양기 IS-971R (Jeio Tech. Kimpo, Korea)에서 24시간 배양하였다.
- (Kyoto, Japan)에서 구입하여 사용하였다. MRS broth는 DifcoTM Lactobacilli MRS (Becton, Dicknson and Company, Sparks, MD, USA) 제품을 구입하여 사용하였고 분석에 사용된 시약은 특급 이상을 구입하여 사용하였다.
- 계명대학교 식품가공학과 식품소재 개발연구실에서 미강으로부터 분리한 GABA 생산 균주인 Lactobacillus plantarum EJ2014(KCCM 11545P)를 이용하여 젖산발효를 수행하였다(23). L.
- 본 실험에 사용한 녹각(Cervi cornu)은 보광 약업사(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였고 GABA는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 yeast extract (YE)는 (주) 조흥(Ansan, Korea)과 GABA 생산의 기질로 사용한 mono sodium L-glutamic acid (MSG)는 Yakuri pure chemicals Co., LTD. (Kyoto, Japan)에서 구입하여 사용하였다. MRS broth는 DifcoTM Lactobacilli MRS (Becton, Dicknson and Company, Sparks, MD, USA) 제품을 구입하여 사용하였고 분석에 사용된 시약은 특급 이상을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- Different letters indicate significant differences at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
- 실험 결과는 평균값과 표준편차(mean ± SD)로 나타내었으며, 통계처리는 SPSS (statistical package for social science, 23, SPSSInc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 one-way ANOVA 분석을 실시한 후 Duncan’s multiple range test로 유의성을 p＜0.05 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- Autoclave, 한약 추출기, 약탕기 세 가지 추출물에서 총 아미노산 함량은 각각 5487.85, 13659.6, 8751.08 µg/g로 한약 추출기에서 총 아미노산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
- Autoclave, 한약 추출기, 약탕기 추출액의 glycine 함량은 각각 1424.46, 3405.99, 2348.48 µg/g이였으며 아미노산 함량 중 가장 큰 비율을 차지하였고 한약 추출기 추출물에서 glycine 함량이 가장 높았고, 약탕기, autoclave 순으로 높게 차지하였다.
- Fig. 6에서 보는 바와 같이 녹각 추출물의 MSG 함량에 따른 젖산발효를 수행하였을 때 젖산균 수는 발효 1일 각각 3.0×109,3.0×109, 2.0×109 CFU/mL로 균수가 급격히 증가하였고, 발효 7일째 2.0×108 CFU/mL로 발효 시간이 지남에 따라 약간 감소하는 것으로 나타났으나 높은 생균수를 유지하였다.
- Glycine 다음으로 함량이 각각 797.52,1943.94, 1310.18 µg/g로 한약 추출기에서 가장 높은 아미노산은 proline이며, 그 다음으로 함량이 높은 아미노산은 glutamine이였고, 그 함량은 각각 665.70, 1641.92, 1015.81 µg/g이였으며 한약 추출기에서 가장 높은 것을 알 수 있었다.
- 5% 조건에서 발효 5일째 MSG가 모두 GABA로 전환되었다. MSG 3.5% 조건에서 발효 5일째 MSG가 GABA로 모두 전환되는 것으로 나타났으며, MSG4.5% 조건에서 대부분의 MSG는 발효 3일에 전환되면서 일부 MSG가 잔존하는 것으로 나타났다. 이는 젖산발효 과정에서 첨가된 높은 농도의 MSG는 효과적으로 GABA로 전환되었으며, MSG 3.
- 38%로 감소하는 것으로 나타났다. MSG 3.5, 4.5% 조건에서 발효 1일째 각각 0.77,0.79%로 급격히 증가한 후 감소하면서 발효 7일째에 각각 0.10,0.12%로 낮은 산도 값을 나타내었다. MSG 농도가 낮을수록 젖산의 생성을 위한 발효시간이 지속되면서 높은 산도를 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며, MSG 농도가 높은 경우에 젖산발효물의 산도를 낮게 유지된 후 감소하는 경향을 보였다.
- 12%로 낮은 산도 값을 나타내었다. MSG 농도가 낮을수록 젖산의 생성을 위한 발효시간이 지속되면서 높은 산도를 나타낸 후 감소하는 경향을 나타내었으며, MSG 농도가 높은 경우에 젖산발효물의 산도를 낮게 유지된 후 감소하는 경향을 보였다.
- 또한 세포 내 효소 GAD에 의해서 glutamate가 GABA로 전환될 때 proton이 필요하며, 이 proton 소비에 의해서 pH를 증가시킨다는 연구결과와 일치하였다(30,31). MSG 첨가 농도에 따라 측정된 산도 값은 각각 0.11,0.14, 0.14%로 유사한 값을 보였으며, MSG 2.5% 조건에서 발효 3일째 1.20%로 급격이 증가한 후 감소하는 경향을 보이면서 발효 7일에 0.38%로 감소하는 것으로 나타났다. MSG 3.
- 4% 생성하는 것으로 나타났다. 결론적으로 녹각 추출액의 젖산균을 이용한 정치배양을 통해 고농도의 GABA 생산이 가능하였으며, 발효물은 GABA, 프로바이오틱(probiotic) 등을 함유하여 식품 및 기능성 소재로 이용 가능성이 높다고 사료되었다.
- 녹각 추출물의 젖산발효에 따른 GABA 생산을 비교하기 위해 TLC를 이용하여 확인한 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같이 YE0% 조건에서 젖산 발효가 진행됨에 따라 기질인 MSG가 GABA로 전환되지 않고 대부분이 잔존하였고, YE 0.25% 첨가 조건에서 발효 3일째 GABA 생성을 보였다. YE 0.
- 녹각 추출물의 젖산발효에 따른 젖산균의 GABA 생산을 비교하기 위해 Fig. 7에 나타낸 것처럼 MSG 2.5, 3.5, 4.5% 조건 모두 발효 3일째 GABA 함량이 크게 증가하면서 효과적으로 생성되는 것을 확인할 수 있었고 MSG 2.5% 조건에서 발효 5일째 MSG가 모두 GABA로 전환되었다. MSG 3.
- 5% 첨가했을 때 젖산발효 3일째에 GABA가 생성되는 것을 보고하였다. 따라서 녹각 추출물 젖산발효에서 첨가된 YE 농도는 MSG가 GABA로 전환되는 과정에서 중요한 인자로 작용하는 것으로 사료되었으며, YE 0.5% 첨가 조건이 GABA 전환의 최적 조건으로 판단되었다.
- 5% 첨가 조건에서 발효 3일 만에 대부분이 GABA로 전환됨으로써 고농도 GABA를 함유한 녹각 젖산 발효물을 제조할 수 있었다. 따라서 녹각 추출액에 포도당 1.5%, YE 0.5%, MSG3.5%가 첨가된 녹각 추출액이 GABA 생산의 최적 조건으로 판단되었다. 최종 녹각 추출액의 젖산발효물의 HPLC를 이용하여 분석한 GABA 함량은 1.
- 1). 따라서 앞선 실험 결과 고형분 함량과 단백질 함량과 마찬가지로 총 아미노산 함량이 가장 높은 한약 추출기에서 유용 성분이 가장 많이 추출되어 발효에 영향을 준 것으로 사료된다.
- 08 µg/g로 한약 추출기에서 총 아미노산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 앞선 실험 결과 고형분 함량과 단백질 함량과 마찬가지로 총 아미노산 함량이 가장 높은 한약 추출기에서 유용 성분이 가장 많이 추출된 것으로 판단되었다.
- 9 µg/mL로 나타났다. 따라서 업체용 약탕기를 이용한 추출 조건에서 고형분 함량과 단백질함량이 가장 높게 나타난 한약 추출기의 추출방법이 녹각으로부터 유용성분이 가장 많이 용출 된 것으로 판단되었다.
- Lee 등, Kim(30,31)에 따르면 이는 미생물에 의한 GABA가 생성될 때 glutamate decarboxylase (GAD)에 의한 glutamate가decarboxylation 되면서 GABA로 전환될 때 proton이 소비됨으로써 GABA의 생성과 더불어 pH를 높이는 것으로 보고하였다. 따라서 젖산균 발효에 의해 젖산이 생성됨에도 불구하고 발효물의 pH가 유지되거나 증가하는 결과로 보아 발효 중에 기질인 MSG가 GABA로 전환되는 것으로 판단되었다.
- 모든 조건에서 각각 발효 7일에 생균수는 감소하였지만 2.0×108 CFU/mL 이상으로 높은 생균수 값을 유지하였다.
- 25% 조건에서 젖산발효를 통해서 MSG가 일부 GABA로 전환되었으며, 이때 발효물의 산도는 급격하게 감소하면서 YE 0% 조건과 큰 차이를 나타내었다. 반면에 YE 0.5% 첨가 조건에서 발효 7일째 MSG가 모두 GABA로 전환되는 결과를 얻었다.
- 30으로 pH는 큰 차이 없었다. 발효 1일째 각각 pH 4.32, pH 4.49, pH 4.54로 젖산발효가 진행됨에 따라 급격히 감소하였고 MSG 함량이 적을수록 pH가 약간 더 낮았다. 발효 3일째 각각 pH 4.
- 54로 젖산발효가 진행됨에 따라 급격히 감소하였고 MSG 함량이 적을수록 pH가 약간 더 낮았다. 발효 3일째 각각 pH 4.88, pH 6.59, pH 6.32로 증가하였으며, 발효 7일째 각각 pH 4.99, pH 6.56, pH 7.17로 발효시간이 지남에 따라 증가하였고 MSG 농도가 높을수록 발효물의 pH가 더 크게 증가하는 것으로 나타났다. 이는 MSG 농도가 높아짐에 따라 발효물의 pH가 올라간다는 Song(29)의 연구결과와 일치하는 것으로 나타났으며, MRS 액체배지에 MSG가 존재하는 경우에 젖산발효 기간이 증가하면서 발효물의 pH가 증가하는 결과를 보고하였다(33).
- 발효 7일 pH 6.56, 산도 0.77%로 나타났으며 2.0×108 CFU/mL로 높은 균수를 유지하였고 GABA를 1.4% 생성하는 것으로 나타났다.
- 2B). 이는 YE 0.25% 조건에서 젖산발효가 활발하게 진행되면서 발효 초기에 산 생성이 높았으며, 동시에 전구물질인 MSG로부터 GABA가 생성되는 것을 의미하는 것으로 GABA 생성 젖산균에 의한 젖산발효과정에서 GABA 생성을 간접적으로 확인할 수 있었다.
- 젖산균 생균수를 측정한 결과는 Fig. 3에서 보는 바와 같이 녹각 추출물의 YE 함량에 따른 젖산발효를 수행하였을 때, 발효 1일째 각각 4.0×109 CFU/mL, 2.0×109 CFU/mL로 급격히 증가하였으며 0.5% 첨가 조건에서 가장 높은 생균수를 나타내었다.
- 한약 추출기에서 얻어진 녹각 추출액이 다른 추출방법에 비해서 GABA 생산이 효과적임을 나타내었다. 초기 pH 6.2에서 녹각 발효물은 pH 4.3으로 감소하였으며, 산도는 초기 0.18%에서 발효 1일에 1.0%로 증가한 후 발효가 진행되면서 완만하게 감소하는 경향을 보였다(Table 3). 특히 젖산발효 5일 만에 대부분의 MSG가 소진되면서 GABA로 전환되는 결과를 나타내었다(Fig.
- 5%가 첨가된 녹각 추출액이 GABA 생산의 최적 조건으로 판단되었다. 최종 녹각 추출액의 젖산발효물의 HPLC를 이용하여 분석한 GABA 함량은 1.43%로 나타났다(Table 4).
- 녹각 5% (w/v)를 autoclave (121°C, 30 min), 가정용 한약 추출기(100°C, 40 h), 업체용 약탕기 (90°C, 48 h) 세 가지 추출방법에 따른 고형분 및 단백질 함량을 분석해 본 결과는 Table 1과 같다. 추출물의 고형분 함량은 각각 0.78%, 1.75%, 1.10%로 나타났으며 한약 추출기를 이용해 추출 조건에서 가장 높았고 약탕기, autoclave 순으로 높았다. 단백질 함량 또한 한약 추출기에서 980.
- plantarumEJ2014 균주의 starter를 5% 접종하여 7일 동안 정치배양 조건에서 젖산발효를 진행하였다. 한약 추출기에서 얻어진 녹각 추출액이 다른 추출방법에 비해서 GABA 생산이 효과적임을 나타내었다. 초기 pH 6.
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