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문제 정의
- 전통주 연구에서는 재래누룩의 복잡한 미생물 군집이 발효 과정에 따른 당분(전분), 에탄올, 발효부산물의 농도변화 등 발효특성에 미치는 영향과 더불어 술의 맛, 향과 같은 관능적 특성에 미치는 영향을 밝히는 것이 중요하다. 저자들은 과거 본 실험에서 사용된 상업용 시판 누룩을 이용하여 단양주를 제조하여 그 발효특성을 보고 한 바 있어 그 당시 단양주 제조에 사용하였던 누룩을 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 미생물군집을 확인하고 이들 누룩의 다양한 미생물이 주류발효에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 94ºC에서 5분 동안 초기 변성 후, 94ºC에서 30초간 변성단계(denaturation), 55-60ºC에서 45초 동안 프라이머가 DNA에 결합하는 단계(annealing), 72ºC에서 90초 동안 신장하는 단계(elongation)의 과정을 10회 반복하고, 같은 조건에서 프라이머가 DNA에 결합(annealing)하는 온도를 55ºC로 고정시켜 추가적으로 20회의 과정을 더 반복하였다.
- Forward 프라이머는 V1-9F (5'-Linker-TCAG-AC-GAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3')와 bifidobacterium를 증폭하기 위한 Bif16S-F (5'-Linker-TCAG-AC-GGGTTCGATTCTGGCTCAG-3')를 10% 첨가하여 구성하였으며 reverse 프라이머는 V3-541R (5'-Linker-TCAG바코드-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3')을 사용했다.
- 각 누룩 샘플을 0.5 g 취하여 토양(soil), 바이오필름(biofilm), 식품(food), fecal 용 DNA 추출키트(extraction kit, Cat. No. 6560-200, MP BIO)를 사용하여 제공된 방법에 따라 genomic DNA(gDNA)를 추출하였다. 추출된 gDNA 용액으로부터 DNA 정제키트(purification kit)을 이용하여 gDNA에 있는 부식산(humic acid)을 제거하였다.
- 또한 진균류의 군집분석을 위해 EL-F (5'-ACCCGCTGAAYTTAAGCATAT3') EL-R (5'-CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC-3')의 한쌍의 프라이머를 사용하여 26S rRNA gene의 D1-D2 영역을 증폭하였다(12).
- 양쪽 말단에 존재하는 바코드, 연결자(linker), 프라이머 염기서열에 해당하는 부분들을 제거한 뒤, 그 결과로 얻어진 염기단편 중에서 quality score가 25 이상이며 길이가 250 bp이상 450 bp미만인 염기서열만 선택하였다. 박테리아 군집분석을 위하여 16S rRNA 유전자의 키메릭 염기서열(chimeric sequence)은 chimera.uchime 프로그램을 이용하여 Silva DB (silva.gold.align.fasta)와 비교하여 제거하였다. 최종적으로 얻어진 고품질의 16S rRNA 서열의 계통분류를 위해서 16S rRNA gene similarity를 97% 기준으로 OTU (operational taxonomic unit)로 나누고 대표서열(representative seqs) 를 얻은 뒤, 대표 서열을 RDP Classifier를 이용해서 greengene_13_5 16S rRNA gene database 와 비교하여 taxonomic assign을 수행하였다.
- 진균류 군집분석을 위해서는 26S rRNA gene의 D1-D2 영역의 서열로부터 바코드, 연결자, 프라이머 염기서열을 잘라 냈다. 서열의 길이와 quality score을 기준으로 고품질 서열을 선택한 후, 키메릭 염기서열을 배제하고 남은 서열을 CLcommunity software (Chunlab, Inc., Seoul)을 이용하여 균질 다양성(fungal diversity)분석을 수행하였다. 이때 OTU는 CD-HIT program을 사용하여 99% 유사도 기준으로 정의되었다.
- 세균의 군집분석을 위해서 박테리아의 16S rRNA 유전자의 V1에서 V3 영역을 증폭하는 공통 프라이머를 사용하였다. Forward 프라이머는 V1-9F (5'-Linker-TCAG-AC-GAGTTTGA TCMTGGCTCAG-3')와 bifidobacterium를 증폭하기 위한 Bif16S-F (5'-Linker-TCAG-AC-GGGTTCGATTCTGGCTCAG-3')를 10% 첨가하여 구성하였으며 reverse 프라이머는 V3-541R (5'-Linker-TCAG바코드-AC-WTTACCGCGGCTGCTGG-3')을 사용했다.
- 454 파이로시퀀싱에 따라 생산된 raw data는 reverse 프라이머에 삽입된 바코드서열 정보에 따라 4개의 누룩샘플에 대하여 각각 박테리아와 진균류 군집으로 구분된 모두 8개의 순서 그룹으로 나누었다. 양쪽 말단에 존재하는 바코드, 연결자(linker), 프라이머 염기서열에 해당하는 부분들을 제거한 뒤, 그 결과로 얻어진 염기단편 중에서 quality score가 25 이상이며 길이가 250 bp이상 450 bp미만인 염기서열만 선택하였다. 박테리아 군집분석을 위하여 16S rRNA 유전자의 키메릭 염기서열(chimeric sequence)은 chimera.
- fasta)와 비교하여 제거하였다. 최종적으로 얻어진 고품질의 16S rRNA 서열의 계통분류를 위해서 16S rRNA gene similarity를 97% 기준으로 OTU (operational taxonomic unit)로 나누고 대표서열(representative seqs) 를 얻은 뒤, 대표 서열을 RDP Classifier를 이용해서 greengene_13_5 16S rRNA gene database 와 비교하여 taxonomic assign을 수행하였다. 진균류 군집분석을 위해서는 26S rRNA gene의 D1-D2 영역의 서열로부터 바코드, 연결자, 프라이머 염기서열을 잘라 냈다.
- 6560-200, MP BIO)를 사용하여 제공된 방법에 따라 genomic DNA(gDNA)를 추출하였다. 추출된 gDNA 용액으로부터 DNA 정제키트(purification kit)을 이용하여 gDNA에 있는 부식산(humic acid)을 제거하였다.
대상 데이터
- 전통방식으로 누룩을 제조하는 곳에서 제조된 밀 누룩 4종류(SH, JJ, SS, SJ)를 구매하였다(3, Table 1). 이를 분쇄기(FM-909W, Hanil, Seoul, Korea)로 분쇄 한 후 20메쉬(mesh) 체(test sieve 850 µm, Chunggye Industrial Co.
이론/모형
- 이때 OTU는 CD-HIT program을 사용하여 99% 유사도 기준으로 정의되었다. Rarefaction curve, Chao1과 Shannon index 등은 Mothur 플랫폼을 사용하여 계산하였다.
성능/효과
- 1)Contains 42.5% of unidentified bacteria belonging to the order of Lactobacillales, 2)95.1% of unidentified bacteria belonging to Bacillaceae family.
- cgi) 로 분석한 결과들을 살펴보면, phylum 수준에서는 모든 시료에서 Firmicutes문이 우세한 것으로 분석되었다(Table 5). Genus 수준에서 살펴 본 시료들의 원핵미생물의 분포는 SH의 경우 Lactobacillus (27.9%)속과 Leuconostoc (14.6%)속으로 많이 분포하는 것으로 나타났다. 기타 Pediococcus (10.
- 세균류를 분석한 alpha diversity의 측정값은 Table 4에 나타내었다. OTU를 비교할 경우 SS가 richness가 다른 누룩보다 높게 나타났으며 다양성 측정 계수인 Chao1도 가장 높게 나타났다. Simpson 계수로 판단했을 때 SJ의 값이 가장 낮아 개체수가 적은 OTU가 다수 존재함을 알 수 있었다.
- 3%로 가장 많이 검출되었다. SH과 SS에서는 모두 Saccharomycopsidaceae속이 각각 85.3, 97.5%로 가장 많이 검출 되었으며 SJ에서는 Mucorales속이 56.7%로 가장 많이 검출되었다(Table 3). 과거 본 연구에 사용한 누룩들로 생산된 단양주의 특성을 살펴보았을 때(14), SS와 SH를 이용하여 제조된 단양주의 경우, 발효초기부터 15일 까지 알코올 발효가 SJ나 JJ곡자보다 월등히 높았다.
- 세균군집 측면에서 각각의 누룩은 서로 다른 특징을 보였다. SH는 유산균이 95.7%를 차지하는 우점종이었으며 SS도 유산균이 약 70%로 우점을 차지하고 있으나 Leuconostoc속이 66.6%를 차지하여 SH가 다양한 유산균이 골고루 분포한다고 말할 수 있었다. 이것이 다른 누룩에 비하여 향기를 나타내는 원인이라고 생각되었다.
- 2와 같다. SS는 다른 시료들에 비해 가장 높은OTU수를 보여 주었으며 그 뒤를 SH, JJ, SJ 순으로 나타났다. 세균류를 분석한 alpha diversity의 측정값은 Table 4에 나타내었다.
- 진균류를 분석한 누룩시료의 다양성(richness)와 평균성(evenness)를 나타내는 alpha diversity의 측정값을 Table 2에 나타내었다. Sequence similarity를 기반으로 측정된 종의 수(OTU: operational taxonomic unit; similarity 97%)를 비교할 경우 OTU의 개수는 990.0를 보인 JJ가 가장 높은 값을 보였으며 SH, SS의 경우 각각 275, 255OTU를 보였다. 그룹 내 다양성(alpha diversity)을 측정하는 계수로 사용되는 Chao1 값으로 추정한 시판누룩의 평균 richness는 736이였다.
- 10%를 차지하고 있어 미생물 분포의 상대적으로 가장 단순한 분포를 나타내어 미생물 분포의 다양성 면에서 떨어지는 것을 알 수 있었다. 가장 큰 diversity와 evenness를 보인 SS의 경우는 Leuconostoc (66.6%)과 Lactobacillus (3.0%)속 젖산균이 많이 분포한다는 점에서 SH와 비슷하였으나, Leuconostoc속이 우점종으로 나타났다는 점에서 SH와 차이점을 보였다. 이는 이형젖산발효균인 Leuconostoc속이 차후 탁주와 같은 주류제조 시 우점종으로 득세할 경우 이형젖산발효에서 올 수 있는 아세트산(acetic acid), 젖산(lactic acid), 이산화탄소(CO2) 및 만니톨(mannitol) 등의 발효산물을 통해 보다 다양한 맛을 제공하는데 동형젖산발효균인 Lactobacillus속들 보다 유리할 수 있을 것으로 판단된다.
- 7%로 가장 많이 검출되었다(Table 3). 과거 본 연구에 사용한 누룩들로 생산된 단양주의 특성을 살펴보았을 때(14), SS와 SH를 이용하여 제조된 단양주의 경우, 발효초기부터 15일 까지 알코올 발효가 SJ나 JJ곡자보다 월등히 높았다. 이는 두 종류의 누룩에서 높은 분포를 보인 Saccharomycopsis속진균류와 관련성이 있는 것으로 판단되었다.
- 최근의 분자생물학적 분석방법 이전에 선택배지, 현미경관찰, 화학적분석 방법 등을 통한 전통 연구방식을 통해 보고되었던 누룩 진균류 중 곰팡이는 주로 Lichthemia(이전에는 Absidia 명명되었음), Rhizopus, Circinella, Actinomucor, Aspergillus, Cladosporium 및 Botryotridhum속의 7속 17종의 사상균이 분리, 동정 되었다(13). 누룩 중의 사상균의 분포는 Lichthemia속에 속하는 미생물이 전국 모든 지역에서 가장 높은 빈도로 분리되었고, Aspergillus oryzae, Aspergillus condidus와 Rhizopus cohnii가 비교적 고른 분포를 나타냈다. 이외에도 Penicillium속, Mucor속, 기타 Aspergillus속, Botryotricum속 그리고 Cladosporium속 등이 분리되었다(13).
- 이 값은 Jung 등(10)의 막걸리 시료를 분석하여 얻은 20-100보다 2-10배 정도 더 많은 다양성을 나타냈다. 누룩의 발효기간이 상대적으로 짧은 JJ나 SJ에서 발견된 진균류의 다양성은 발효기간이 긴 SH와 SS보다 높은 값을 보였다. 이는 누룩의 발효초기에 다양성이 높은 진균류가 누룩발효가 진행됨에 따라 발효환경에 적응하는 진균류가 우점종을 차지하면서 다양성은 감소하는 것으로 판단된다.
- Simpson 계수로 판단했을 때 SJ의 값이 가장 낮아 개체수가 적은 OTU가 다수 존재함을 알 수 있었다. 또 Shannon 계수로 보았을 때는 SH, SS의 경우 값들이 높아 상대적으로 누룩 내의 세균류의 우점종들이 고르게 존재함을 알 수 있었다.
- 일반적으로 누룩은 생산지역 뿐 아니라 제조공정, 온도, 습도, 제조에 걸리는 시간의 차이에 따라 우세균과 균총이 결정되는데 본 연구에 사용된 시료의 제조방식(Table 1)에 따라 발효시간이 상대적으로 길었던 SJ와 JJ보다는 SH와 SS의 경우에서 Saccharomycopsis속 효모의 분포가 더 많았다. 또한 SJ의 경우는 본 연구에서 종명이 규명되지 않았지만 Rhizopus, Mucor속 등이 포함되어 있는 접합균류가 73.7%로 가장 높게 분포하였다.
- 본 연구 결과, phylum 수준에서 73.7%의 접합균류(Zygomycota)가 우세한 SJ를 제외하고는 상업적으로 생산된 세 누룩에서 자낭균류(Ascomycota)가 우세한 것으로 확인되었으며 특히나 SH, SS의 경우는 각각 86.0, 98.3%의 자낭균류를 포함하였다(Table 3). 이는 Kim 등(11) 이 전국에서 수집된 11종의 누룩들을 고체배지 상 곰팡이균들의 수를 콜로니형성단위(CFU)로 측정한 결과 높은 진균류밀도를 보인 누룩의 경우, 이들 대부분이 Pichia anomala, P.
- 본 연구에서 분석한 16S rDNA reads 염기서열을 활용하여 Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 로 분석한 결과들을 살펴보면, phylum 수준에서는 모든 시료에서 Firmicutes문이 우세한 것으로 분석되었다(Table 5). Genus 수준에서 살펴 본 시료들의 원핵미생물의 분포는 SH의 경우 Lactobacillus (27.
- Kwon과 Sohn(16)은 SS누룩을 연구한 실험에서 Staphylococcus속이 분리되었다고 보고한 바 있으나 우점종은 아니고 젖산균들이 많이 분포되었다고 보고하였다. 본 연구에서는 SS누룩의 경우 이들 균주는 분리가 되지 않았으나 오히려 JJ시료에서는 Staphylococcus 속이 우점종으로 나타났다. 이는 누룩 수집 시기나 시료에 차이로 인한 균주분포가 우점종이 아닌 일부의 균주들에서 나타나는 차이로 판단하였다.
- 이때 녹말과 같은 탄수화물은 곰팡이에서 분비되는 당화효소에 의해 당류가 생성되고 이를 이용하는 효모에 의하여 혐기적 상태에서 에틸알코올이 생성됨으로 진균류는 전통주의 특성을 부여하는데 중요한 역할을 한다고 할 수 있다. 상업용 4가지 누룩시료의 진균류 총 유효 sequencing read 수는 14,800였으며 후속 quality trimming, denoising, and chimera removal와 같은 작업을 통해 얻어 군집분석에 사용한 서열의 평균 sequence read 수는 3,494였다(Table 2). 누룩 내 진균류의 rarefaction 그래프 분석은 Fig.
- , 그리고 Thermoascus crustaceus가 우세균주로 득세한다고 보고한 바 있다. 이는 본 실험에서 상대적으로 제조온도가 높았던 SJ에서 Rhizopus속, Mucor속을 포함하고 있는 접합균류가 많은 분포를 하였던 것과 일치하는 결과를 나타냈다.
- 0%)속 젖산균이 많이 분포한다는 점에서 SH와 비슷하였으나, Leuconostoc속이 우점종으로 나타났다는 점에서 SH와 차이점을 보였다. 이는 이형젖산발효균인 Leuconostoc속이 차후 탁주와 같은 주류제조 시 우점종으로 득세할 경우 이형젖산발효에서 올 수 있는 아세트산(acetic acid), 젖산(lactic acid), 이산화탄소(CO2) 및 만니톨(mannitol) 등의 발효산물을 통해 보다 다양한 맛을 제공하는데 동형젖산발효균인 Lactobacillus속들 보다 유리할 수 있을 것으로 판단된다. 이전 훈련된 패널을 통해 실시한 관능검사에서 SH를 이용하여 제조된 단양주에서 과일향이 다른 누룩을 이용한 것들보다 유의적으로 높은 값을 나타내었고 또한 SS를 이용한 단양주 역시 JJ와 SJ보다 과일향이 높게 나타난 바 있어(14) 누룩에 다양한 젖산균들이 높게 분포할 경우 차후 알코올 발효에서 긍정적인 영향을 끼칠 수 있을 것으로 판단되었다.
- 최근 분자생물학적 미생물 동정방법에 의한 논문에서는 여전히 Lichthemia속이 가장 많은 빈도로 분리되었으며(2,6,7) 이외에도 Aspergillus, Rhizopus, Mucor속 등이 분리되었다. 이는 전통 누룩 제조방식의 경우 Lichthemia속 곰팡이가 주를 이루고 이외에도 Aspergillus, Rhizopus, Mucor속 등이 혼재한 상태로 이들 곰팡이가 생산해 내는 액화 및 당화효소들과 이들로부터 생성될 수 있는 일부 단백질 분해효소들에 의해 차후 주류제조 시 곡물 중의 전분과 같은 고분자 탄수화물이 분해되어 저분자 당류가 생성됨으로서 그 분해나 생성과정이 다양하고 복잡하게 되어 Aspergillus속 곰팡이를 선별하여 주로 사용하는 입국방식으로 생산되는 주류제조보다는 발효의 다양성을 증대시킬 수 있을 것으로 보인다.
- 이는 이형젖산발효균인 Leuconostoc속이 차후 탁주와 같은 주류제조 시 우점종으로 득세할 경우 이형젖산발효에서 올 수 있는 아세트산(acetic acid), 젖산(lactic acid), 이산화탄소(CO2) 및 만니톨(mannitol) 등의 발효산물을 통해 보다 다양한 맛을 제공하는데 동형젖산발효균인 Lactobacillus속들 보다 유리할 수 있을 것으로 판단된다. 이전 훈련된 패널을 통해 실시한 관능검사에서 SH를 이용하여 제조된 단양주에서 과일향이 다른 누룩을 이용한 것들보다 유의적으로 높은 값을 나타내었고 또한 SS를 이용한 단양주 역시 JJ와 SJ보다 과일향이 높게 나타난 바 있어(14) 누룩에 다양한 젖산균들이 높게 분포할 경우 차후 알코올 발효에서 긍정적인 영향을 끼칠 수 있을 것으로 판단되었다.
- 일반적으로 누룩은 생산지역 뿐 아니라 제조공정, 온도, 습도, 제조에 걸리는 시간의 차이에 따라 우세균과 균총이 결정되는데 본 연구에 사용된 시료의 제조방식(Table 1)에 따라 발효시간이 상대적으로 길었던 SJ와 JJ보다는 SH와 SS의 경우에서 Saccharomycopsis속 효모의 분포가 더 많았다. 또한 SJ의 경우는 본 연구에서 종명이 규명되지 않았지만 Rhizopus, Mucor속 등이 포함되어 있는 접합균류가 73.
- Kwon(15)의 PCR-DGGE연구에 따르면 산성누룩에서 분리된 진균류에는 Aspergillus속, Saccharomycopsis속, Wickerhamomyces속, Torulapora속, Trichosporon속 그리고 Pichia속으로 크게 6개의 group이 존재한다고 보고하였다. 파이로시퀀싱을 이용하여 진균류를 분석한 본 실험에서는 Aspergillus속, Saccharomycopsis속, Wickerhamomyces속 및 Pichia속 외에도 Saccharomyces속, Clostridium속, Monascaceae속 등 보다 다양한 진균류가 검출되었다.
- Kwon과 Sohn(16)의 연구에 따르면 PCR-DGGE로 SS누룩에 존재하는 세균을 동정하였을 때 Lactobacillus속, Weissella속 그리고 Escherichia속, Pantoea속, Staphylococcus속 이렇게 5가지로 그룹이 나누었다. 파이로시퀀싱을 이용한 본 연구에서는 Leuconostoc 속, Lactobacillus속, Pediococcus속과 같은 유산균 이외에도 방선균인 Saccharopolyspora속, Proteobacteria문에 속하는 Ralstonia속 등 다양한 원핵 미생물 균종이 검출되었다.
후속연구
- 이전 연구(14)에서 JJ와 SJ누룩으로 제조된 단양주의 발효양상이 초기와 중기 알코올 발효가 늦었는데 이는 누룩에 상대적으로 적은 분포의 Saccharomycopsis속 진균류와 젖산균이 알코올발효의 진행을 더디게 한 것으로 추측되었다. 또한, JJ로 제조된단양주의 경우 상대적으로 발효기간 중 총 유리아미노산 함량이 다른 누룩을 이용하여 제조한 단양주보다 높게 나타난 점으로 보아 Stapylococcus속과 단백질 분해능과의 관계에 대한 연관성이 나타난 것으로 판단되어 이와 관련된 연구가 더 필요할 것으로 보인다. 누룩에서의 Stapylococcus속과 관련된 역할에 대한 연구는 많이 알려지지 않았으나 아프리카의 콩류발효 식품에서 단백질 분해능이 보고된 바 있다(17).
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