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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 우리나라에 신규 양식 후보 종으로 소개되기 시작하고 있는 러시아 철갑상어(Acipenser gueldenstaedtii)의 발생과 초기 발달에 관여하는 유전자들의 발현 분석을 위한 연구의 시작점으로서, 배 발생 및 자어 발달 시료들의 RT-qPCR 분석 시 유전자 발현을 적절히 규격화할 수 있는 참조 유전자들을 선정 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 분석 대상 참조 유전자 후보 군을 1차 선정하기 위해서 연구실에서 제작한 러시아철갑상어 next generation sequencing (NGS) 발현 유전체 데이터베이스(치어 전어체 및 미성어 조직 별 transcriptome 분석 데이터베이스)로부터 후보 유전자들의 염기서열 정보를 수집하였다. 1차 수집된 염기서열들을 대상으로 프라이머 디자인의 용이성 등에 관한 재평가를 실시하였으며, 이를 통해 총 8개의 유전자를 선정하였다. 선정된 8개 유전자는 beta-cytoskeletal actin (ACTB), elongation factor-1 alpha (EF1A), glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase (GAPDH), histone 2A (H2A), ribosomal protein L5 (RPL5), ribosomal protein L7 (RPL7), succinate dehydroge-nase (SDHA) 및 ubiquitin conjugating enzyme E2 (UBE2A)였으며, 각 유전자 염기서열을 대상으로 RT-qPCR primer를 디자인하기 위해서 RT-PCR 클로닝 또는 RT-PCR 산물의 직접적인 염기서열 분석을 통해 염기서열을 재 검증 하였다.
- NormFinder의 경우 두 부분집합에서 일관되게 발현 안정성이 우수한 유전자들로 평가되었던 GAPDH와 RPL5를 전체 그룹에서도 가장 안정적인 유전자로 선정하였으며, geNorm 과 마찬가지로 RPL7 및 ACTB를 참조 유전자 후보로서 가장 불합리한 유전자들로 평가하였다(GAPDH>RPL5>SDHA>UBE2A>H2A>EF1A>RPL7>ACTB).
- 역전사 반응 산물의 농도를 nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 측정한 후 동일 농도로 보정하였고, 최종 DNase free water에 4배 희석하였으며, 각 준비된 cDNA 주형으로부터 2 μL를 취하여 qPCR 반응에 이용하였다. PCR 증폭은 light cycler 480 System (Roche Applied Science)과 SYBR green I master (roche applied science)를 이용하여 열 순환 반응이 95℃ 20초, 58℃ 20초 및 72℃ 25초로 총 40회 수행되도록 하였으며 최초 변성 반응으로서 95℃ 3분을 실시하였다. 각 순환 반응이 종료될 때마다 형광 검출을 실시하였고, 최종 순환 과정이 종료된 후 melting curve 분석을 통해 특이적 증폭 반응이 일어났음을 확인하였다.
- Total RNA로부터 cDNA를 합성하기 위해서RNA 주형 2 μg을 대상으로 oligo-d(T) primer (20 mers; Bioneer, Korea)와 random primer (random nonamers; Takara Bio Inc., Japan)를 함께 포함한 역전사(reverse transcription) 반응을 실시하였고, 역전사 반응은 omniscript RT kit (Qiagen) 을 이용하여 제조사의 권고 방법대로 실시하였다.
- 상기 실험 설계에 따라 2회의 서로 다른 산란 그룹으로부터 각 33 발달 단계(배 발생 12 단계 및 자어 발달 11 단계)로부터 각 단계별 3개의 생물학적 반복구(biological replication) 샘플링을 통해서 총 198개의 cDNA 주형(template)을 제조하였고, 각 cDNA 주형 별 3반복의 qPCR 수행(technical replication)을 통해서 총 594 개의 기초 quantification cycle 값(raw Cq data)을 확보하였다. 각 cDNA 당 기술적 반복구(technical replication)들로부터 중간 값(median Cq)을 선발하여 생물학적 반복 구별 대표 값을 갖도록 하였고, 이를 기반으로 유전자 발현 안정성 평가를 실시하였다. 분석 프로그램은 geNorm, NormFinder 및 BestKeeper 프로그램을 이용하여 각 개발자가 권고한 방법대로 분석을 실시하였다.
- 각 순환 반응이 종료될 때마다 형광 검출을 실시하였고, 최종 순환 과정이 종료된 후 melting curve 분석을 통해 특이적 증폭 반응이 일어났음을 확인하였다. 각 cDNA 별로 3회 반복 증폭 시험을 실시하였다.
- 3 m; W×D×H)에 순환여과식으로 난황 흡수가 완료(부화 8일째) 후 알테미아 부화 유생(Artemia nauplii)을 만복 공급하였고 부화 11일째까지(1 day post hatching; 1 DPH부터 11 DPH까지) 사육 관리하면서 1일 간격으로 샘플링을 실시하였다. 각 샘플링 시점에서 10미씩 3반복 샘플링 하였으며 앞서와 마찬가지로 물기를 제거 후 드라이아이스를 이용하여 냉동 처리하였다.
- 선정된 8개 유전자는 beta-cytoskeletal actin (ACTB), elongation factor-1 alpha (EF1A), glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase (GAPDH), histone 2A (H2A), ribosomal protein L5 (RPL5), ribosomal protein L7 (RPL7), succinate dehydroge-nase (SDHA) 및 ubiquitin conjugating enzyme E2 (UBE2A)였으며, 각 유전자 염기서열을 대상으로 RT-qPCR primer를 디자인하기 위해서 RT-PCR 클로닝 또는 RT-PCR 산물의 직접적인 염기서열 분석을 통해 염기서열을 재 검증 하였다. 각 유전자 별로 프라이머 길이(20 mers), G+C content (45-60%), melting temperature (55-65℃) 및 증폭 산물의 길이(150-200 bp)를 기준으로 2-3쌍의 primer 쌍을 합성하여 PCR 효율(PCR effi-ciency; E) 및 단일 밴드의 선명한 증폭 여부를 재평가하여 유전자 별로 최적 프라이머 쌍을 선정하였다. 이때 PCR 효율 값(E)은 철갑상어 치어 전어체 cDNA 주형과 Light Cycler 480 realtime PCR system을 이용하여 평가하였으며, 최소 94% 이상의 PCR 효율로 증폭됨을 확인하였다.
- 이때 PCR 효율 값(E)은 철갑상어 치어 전어체 cDNA 주형과 Light Cycler 480 realtime PCR system을 이용하여 평가하였으며, 최소 94% 이상의 PCR 효율로 증폭됨을 확인하였다. 단일 크기의 밴드 증폭 여부는 PCR 증폭 산물을 1.5% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기 영동 후 브롬화 에티듐(ethidium-bromide; Et-Br) 염색을 통해서 확인하였다. 본 평가과정을 통해서 선정한 후보 유전자들의 종류와 최종 선정한 프라이머 정보들은 Table 1에 나타내었다.
- 발생 배 및 부화자어로부터 TriPure Reagent (Roche Applied Science)로 1차 total RNA를 추출한 후 추출물을 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Hilden, Germany)로 다시 순수 분리하였고, 이 때 DNA 오염을 제거하기 위해서 RNase-Free DNase를 처리과정을 포함토록 하였다. 분리된 total RNA가 파괴 없이 확보되었음을 확인하기 위해서 MOPS-formaldehyde gel 전기영동을 통해 28S rRNA 밴드와 18S rRNA 밴드의 선명도와 진하기를 비교하여 검증하였다.
- 부화 후, 부화 자어들은 부화 온도와 동일 온도(19℃)로 조절되는 항온 수조(1 m×2 m×0.3 m; W×D×H)에 순환여과식으로 난황 흡수가 완료(부화 8일째) 후 알테미아 부화 유생(Artemia nauplii)을 만복 공급하였고 부화 11일째까지(1 day post hatching; 1 DPH부터 11 DPH까지) 사육 관리하면서 1일 간격으로 샘플링을 실시하였다.
- 발생 배 및 부화자어로부터 TriPure Reagent (Roche Applied Science)로 1차 total RNA를 추출한 후 추출물을 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen Hilden, Germany)로 다시 순수 분리하였고, 이 때 DNA 오염을 제거하기 위해서 RNase-Free DNase를 처리과정을 포함토록 하였다. 분리된 total RNA가 파괴 없이 확보되었음을 확인하기 위해서 MOPS-formaldehyde gel 전기영동을 통해 28S rRNA 밴드와 18S rRNA 밴드의 선명도와 진하기를 비교하여 검증하였다. Total RNA 시료의 순도는 Libar S70 분광광도계(Biochrom Ltd.
- 상기 실험 설계에 따라 2회의 서로 다른 산란 그룹으로부터 각 33 발달 단계(배 발생 12 단계 및 자어 발달 11 단계)로부터 각 단계별 3개의 생물학적 반복구(biological replication) 샘플링을 통해서 총 198개의 cDNA 주형(template)을 제조하였고, 각 cDNA 주형 별 3반복의 qPCR 수행(technical replication)을 통해서 총 594 개의 기초 quantification cycle 값(raw Cq data)을 확보하였다. 각 cDNA 당 기술적 반복구(technical replication)들로부터 중간 값(median Cq)을 선발하여 생물학적 반복 구별 대표 값을 갖도록 하였고, 이를 기반으로 유전자 발현 안정성 평가를 실시하였다.
- 5 HPF), 꼬리 신장기 (95 HPF), 그리고 최초 부화(120 HPF)의 발생 단계로부터 약 15-20 개의 배 또는 부화 자어를 3반복으로 샘플링 하였다. 샘플링 과정 중 죽었거나 기형적으로 발생하는 배 또는 개체들이 포함되지 않도록 현미경하에서 시료들을 검경한 후 샘플링을 실시하였다. 샘플링 직후 드라이아이스에 냉동시켰으며, 이후 초저온 냉동고(-80℃)에 사용 직전까지 보관하였다.
- 1차 수집된 염기서열들을 대상으로 프라이머 디자인의 용이성 등에 관한 재평가를 실시하였으며, 이를 통해 총 8개의 유전자를 선정하였다. 선정된 8개 유전자는 beta-cytoskeletal actin (ACTB), elongation factor-1 alpha (EF1A), glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase (GAPDH), histone 2A (H2A), ribosomal protein L5 (RPL5), ribosomal protein L7 (RPL7), succinate dehydroge-nase (SDHA) 및 ubiquitin conjugating enzyme E2 (UBE2A)였으며, 각 유전자 염기서열을 대상으로 RT-qPCR primer를 디자인하기 위해서 RT-PCR 클로닝 또는 RT-PCR 산물의 직접적인 염기서열 분석을 통해 염기서열을 재 검증 하였다. 각 유전자 별로 프라이머 길이(20 mers), G+C content (45-60%), melting temperature (55-65℃) 및 증폭 산물의 길이(150-200 bp)를 기준으로 2-3쌍의 primer 쌍을 합성하여 PCR 효율(PCR effi-ciency; E) 및 단일 밴드의 선명한 증폭 여부를 재평가하여 유전자 별로 최적 프라이머 쌍을 선정하였다.
- 성숙한 암수 친어들을 대상으로 산란유도 호르몬인 luteinizing hormone-releasing hormone analog (LHRH-a; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 암컷 80 μg/kg, 수컷 20 μg/kg 어체중 농도로 근육 주사하였고, 암컷의 배란이 이루어질 때까지 수온 15-16℃에서 관찰하였으며(약 24시간-30시간 소요), 수컷은 주사 24시간째 및 30시간째 정액을 확보한 희석 보관 액(Park and Chapman, 2005)에 1:1 희석 후 냉장상태를 유지하였다.
- , 1993)에 따라 실시하였고, 본 논문에서 대상으로 한 12 배 발생 단계는 다음과 같다. 수정 직후(0 h post fertilization; 0 HPF), 제1난할(2.2 HPF), 제5-6난할(7.5 HPF), 포배기 초기(9.2 HPF), 낭배기 시작(20 HPF), 70% 피포 형성기(28.5 HPF), 신경배 형성 시작(33.5 HPF), 전신 형성기(40 HPF), 눈및 체절형성기(56 HPF), 심장 박동기(73.5 HPF), 꼬리 신장기 (95 HPF), 그리고 최초 부화(120 HPF)의 발생 단계로부터 약 15-20 개의 배 또는 부화 자어를 3반복으로 샘플링 하였다. 샘플링 과정 중 죽었거나 기형적으로 발생하는 배 또는 개체들이 포함되지 않도록 현미경하에서 시료들을 검경한 후 샘플링을 실시하였다.
- 수정란의 점액질을 제거하기 위해 Fuller’s earth 분말 처리를 수행한 후 부화 배양기에 수용한 후 19±0.3℃로 항온 배양하면서 난 발생을 유도하였다.
- 수정부터 부화 11일째 자어까지의 전 구간을 대상으로 참조 유전자의 유효한 선정이 가능한지를 조사하기 위해서 앞서 발생 배 및 자어 발달 부분집합 그룹들을 통합하여 유전자 발현 안정성 평가를 실시하였다. geNorm 분석 결과, 두 부분집합에서의 결과와 동일하게 SDHA/UBE2A를 가장 안정적인 유전자로, 반면 ACTB와 RPL7을 가장 불안정한 유전자로 선정하였다(SDHA/UBE2A>EF1A>H2A>RPL5>GAPDH>RPL7>ACTB).
- Louis, MO, USA)를 암컷 80 μg/kg, 수컷 20 μg/kg 어체중 농도로 근육 주사하였고, 암컷의 배란이 이루어질 때까지 수온 15-16℃에서 관찰하였으며(약 24시간-30시간 소요), 수컷은 주사 24시간째 및 30시간째 정액을 확보한 희석 보관 액(Park and Chapman, 2005)에 1:1 희석 후 냉장상태를 유지하였다. 암컷 배란을 최초 확인 시점부터 1시간 이후 복부 압박 법을 통해 배란된 알을 얻었으며, 습식법을 이용 1:1 mating 방식으로 인공 수정을 실시하였다.
- 역전사 반응 산물의 농도를 nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 측정한 후 동일 농도로 보정하였고, 최종 DNase free water에 4배 희석하였으며, 각 준비된 cDNA 주형으로부터 2 μL를 취하여 qPCR 반응에 이용하였다.
- , 2004). 유전자 발현 안정성 평가는 배 발생 그룹(embryonic subset), 자어 발달 그룹(larval subset)을 구분하여 평가한 후 이들 두 그룹을 모두 통합한 자료와 비교하였다.
- 분석 프로그램은 geNorm, NormFinder 및 BestKeeper 프로그램을 이용하여 각 개발자가 권고한 방법대로 분석을 실시하였다. 즉, geNorm 분석을 통해 stability value (M; cutoff=1.5)를 각 유전자 별로 측정한 후 pairwise 변이 분석(V; cutoff=0.15)을 통해 유전자간 상호 안정성 순서를 평가하였고, 가장 낮은 M 값을 가진 유전자를 가장 유전자 발현 안정성이 높은 유전자로 선정하였다(Hellemans et al., 2007). NormFinder의 경우 PCR efficiency를 이용하여 Cq 값은 상대 양(relative quantity)로 전환 후 안정성 분석에 이용하였고 (Andersen et al.
대상 데이터
- 분석 대상 참조 유전자 후보 군을 1차 선정하기 위해서 연구실에서 제작한 러시아철갑상어 next generation sequencing (NGS) 발현 유전체 데이터베이스(치어 전어체 및 미성어 조직 별 transcriptome 분석 데이터베이스)로부터 후보 유전자들의 염기서열 정보를 수집하였다. 1차 수집된 염기서열들을 대상으로 프라이머 디자인의 용이성 등에 관한 재평가를 실시하였으며, 이를 통해 총 8개의 유전자를 선정하였다.
- 실험에 사용한 러시아 철갑상어 친어는 2002년에 인공부화 후 경남 함양 디노빌영어조합법인 양식장에서 사육중인 개체들이었다. 성숙한 암수 친어들을 대상으로 산란유도 호르몬인 luteinizing hormone-releasing hormone analog (LHRH-a; Sigma-Aldrich, St.
- 3℃로 항온 배양하면서 난 발생을 유도하였다. 유전자 발현 시험에 사용하기 위해 배의 발생 과정 중 철갑상어 발생에서 대표적인 12 발달단계로부터 발생 시료를 확보하였다. 러시아 철갑상어의 발생 배의 형태학적 발달에 의한 발생 단계 구분은 선행 연구(Dettlaff et al.
데이터처리
- 각 cDNA 당 기술적 반복구(technical replication)들로부터 중간 값(median Cq)을 선발하여 생물학적 반복 구별 대표 값을 갖도록 하였고, 이를 기반으로 유전자 발현 안정성 평가를 실시하였다. 분석 프로그램은 geNorm, NormFinder 및 BestKeeper 프로그램을 이용하여 각 개발자가 권고한 방법대로 분석을 실시하였다. 즉, geNorm 분석을 통해 stability value (M; cutoff=1.
이론/모형
- Expression stability rankings of eight housekeeping genes in the combined dataset including both embryonic and larval subsets. Stability ranking of each gene in geNorm, NormFinder and BestKeeper programs were used to calculate geomean of ranking values. ACTB, beta-cytoskeletal actin; EF1A, elongation factor-1 alpha; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; H2A, histone 2A; RPL5, ribosomal protein L5; RPL7, ribosomal protein L7SDHA, succinate dehydrogenase; SDHA, succinate dehydrogenase; UBE2A, Ubiquitin conjugating enzyme E2.
- 유전자 발현 시험에 사용하기 위해 배의 발생 과정 중 철갑상어 발생에서 대표적인 12 발달단계로부터 발생 시료를 확보하였다. 러시아 철갑상어의 발생 배의 형태학적 발달에 의한 발생 단계 구분은 선행 연구(Dettlaff et al., 1993)에 따라 실시하였고, 본 논문에서 대상으로 한 12 배 발생 단계는 다음과 같다. 수정 직후(0 h post fertilization; 0 HPF), 제1난할(2.
성능/효과
- BestKeeper에 의한 발현 안정성 순위는 RPL7>GAPDH>UBE2A>ACTB>H2A>SDHA>EF1A>RPL5로 나타났다.
- GRV를 기준 시 조사한 8개 유전자의 순위는 UBE2>H2A >SDHA>GAPDH>RPL5>EF1A>ACTB>RPL7 순으로 나타났다(Fig. 2).
- geNorm 분석 결과, 두 부분집합에서의 결과와 동일하게 SDHA/UBE2A를 가장 안정적인 유전자로, 반면 ACTB와 RPL7을 가장 불안정한 유전자로 선정하였다(SDHA/UBE2A>EF1A>H2A>RPL5>GAPDH>RPL7>ACTB).
- 부화 후부터 11일째까지의 부분집합 그룹을 대상으로 한 안정성 분석에서도 마찬가지로 서로 다른 분석 프로그램들은 각기 다른 유전자들을 최고 안정적인 유전자들로 나타내었는데, geNorm 및 NormFinder 프로그램의 경우, 앞서 배 발생 부분집합 그룹에서와 동일하거나 거의 유사한 유전자 순위를 나타낸 반면, BestKeeper의 경우 배 발생과는 유의적인 차이를 나타내었다. geNorm 분석의 경우 배 발생에서와 마찬가지로 SDHA 및 UBE2A가 가장 낮은 M 값(가장 높은 안정성)을 갖는 것으로 나타났고 반면 RPL7 및 ACTB가 가장 불안정한 발현을 보이는 유전자들로 평가되었다. geNorm에서의 발현 안정성의 순위는 SDHA/UBE2A>EF1A>H2A>RPL5>GAPDH>RPL7 >ACTB로 나타났다.
- PCR 증폭은 light cycler 480 System (Roche Applied Science)과 SYBR green I master (roche applied science)를 이용하여 열 순환 반응이 95℃ 20초, 58℃ 20초 및 72℃ 25초로 총 40회 수행되도록 하였으며 최초 변성 반응으로서 95℃ 3분을 실시하였다. 각 순환 반응이 종료될 때마다 형광 검출을 실시하였고, 최종 순환 과정이 종료된 후 melting curve 분석을 통해 특이적 증폭 반응이 일어났음을 확인하였다. 각 cDNA 별로 3회 반복 증폭 시험을 실시하였다.
- 상기 두 부분집합(subsets) 그룹들의 Cq 값을 모두 대상으로 통합하여 그 양상을 분석한 결과, 조사한 8개 유전자들 중 ACTB와 RPL7이 러시아 철갑상어 배 발생 및 자어 발달 단계 에서 가장 높은 발현을, EF1A가 가장 낮은 발현을 나타내었다. 두 기간을 모두 대상으로 할 경우 발생하는 발현 편차 폭의 경우, GAPDH가 가장 큰 폭의 Cq 값의 표준 편차를 나타내었고 이어서 RPL7, EF1A, ACTB, RPL5 순으로 높은 편차를 나타내었으며, H2A가 가장 낮은 표준 편차를 보였다(Fig. 1).
- 상기 두 유전자뿐만 아니라 EF1A, RPL5, GAPDH 역시 상대적으로 낮은 안정성 순위에 해당되었는데, 이들 유전자들 역시 발생 초기에 비해 발생 후반부에서 유전자 발현이 증가하는 경향을 나타냄으로써 ACTB와 RPL7과함께 단백질 합성 및 에너지 생성에 관여하는 유전자들이 배아체 발달에 밀접하게 관여함을 잘 보여주고 있다. 따라서 본 연구 결과, 러시아 철갑상어 배 발생 구간(수정부터 부화까지)을 대상으로 한 RT-qPCR 분석 시 단백질 합성, 세포 분화, 당 분해 (glycolysis)에 밀접히 관련되지 않은 유전자들을 참조 유전자로 선정하여 이용하는 것이 바람직하고 그 예로서 본 논문에서는 UBE2A 또는 H2A를 제시하고 있다.
- 따라서 본 연구 결과, 러시아 철갑상어의 배 발생 및 자어 발달에 해당하는 시료를 RT-qPCR로 분석할 때 종래 고전적으로 사용되고 있는 ACTB, GAPDH 및 RPL 유전자들은 적절치 않으며, UBE2A 및 SDHA를 참조 유전자로 이용하는 것이 정확한 발현 정량화 및 규격화에 더 적절한 것으로 판단된다. 단 배 발생 단계와 자어 단계를 구분하거나 별도로 분석을 할 경우에는 H2A (배 발생) 및 GAPDH (자어 발달)도 사용 가능할 수 있을 것이다.
- 반면 앞서의 부분집합 별 평가에서와 마찬가지로 통합 집합에서도 하위 순위에 해당하는 유전자들은 단백질 합성, 세포 골격 및 당 분해에 의한 에너지 대사와 보다 밀접하게 관계된 유전자들로서(RPL5/7, EF1A, GAPDH, ACTB), GAPDH의 경우 자어 발달에서는 높은 안정성을 나타내었지만, 배 발생 구간과 부화 후 자어 발달 구간 사이에 큰 폭의 발현 수준 차이가 있기 때문에 높은 순위를 받지 못한 것으로 판단된다. 따라서 본 연구 결과를 종합할 때, 러시아 철갑상어의 배 발생 및 자어 발달 구간을 대상으로 한 RT-qPCR 분석의 경우 종래 참조 유전자들로 여타 어류들에서 널리 사용된 바 있는 ACTB, GAPDH 및 RPL 유전자들이 적합하지 않음을 시사하고 있다. 이들 유전자들의 경우 발생·발달의 전 구간을 대상으로 한 정량 발현 분석에 참조 유전자로 사용하는 것은 부적절하며, 사용해야 한다면 안정적 발현을 보이는 특정 발생·발달 구간에 국한된 시료들 간의 비교에만 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 이와 같은 Cq 값의 감소(평균 Cq 값 기준 시) 경향은 GAPDH, RPL7 그리고 ACTB에서 상대적으로 나머지 다른 유전자들에 비해서 보다 두드러진 경향을 나타내었고, H2A의 경우 배 발생 그룹과 자어 발달 그룹 간 Cq 평균값에 대한 차이가 거의 관찰되지 않았다. 따라서 자어 발달 그룹에서는 ACTB (중앙 값=16.03) 및 RPL7 (중앙 값=16.40)이 가장 높은 발현을 나타내었고, 뒤이어 GAPDH (중앙 값=18.51)가 높은 발현을 나타내었으며 반면 EF1A (중앙 값=35.56)가 가장 낮은 발현을 보였다. 유전자 별 Cq 값의 편차에 있어서 앞서 배 발생 그룹에서의 결과와 차이를 나타내는 유전자들이 관찰되었는데, ACTB, EF1A, GAPDH 및 RPL7의 경우 배 발생 그룹에서보다 발현의 편차가 유의적으로 감소하였으며, 반대로 H2A의 경우 자어 그룹에서 발현 수준의 편차 폭이 소폭 증가하였다(Fig.
- 4%로 나타나 발현정량 분석을 위한 적절한 PCR 효율 조건이 충족되었음을 알 수 있었고(Schmittgen and Livak, 2008; Doak and Zair, 2012), 역시 melting curve 분석 및 단일 밴드 형성을 확인함으로써 유전자 특이적인 증폭 반응이 이루어졌음을 확인할 수 있었다(data not shown). 러시아 철갑상어배 발생 그룹(embryonic subset)을 대상으로 8개 후보 유전자의 Cq 값 양상을 조사한 결과, ACTB가 20.01의 평균(mean) Cq 값을 나타내어(중앙 값=20.34), 함께 조사한 다른 7개 유전자들 보다 가장 높은 발현을 나타내었고 반면 EF1A가 39.7의평균 Cq 값(중앙 값=39.35)을 보여 가장 낮은 발현 수준을 나타내었다. 그 외 유전자들의 경우 H2A 및 RPL7이 나머지 4개 유전자(GAPDH, RPL5, SDHA 및 UBE2A)보다 상대적으로 높은 발현 양상을 나타내었다.
- 한편 자어 부분집합 그룹에서 NormFinder 분석에 의한 발현 안정성 순위는 RPL5>GAPDH>H2A>SDHA>UBE2>EF1A>RPL7>ACTB로 나타나 배 발생 부분집합 그룹과 비교 시, 1순위와 2순위, 그리고 4순위와 5순위 간 순위 바뀜이 있었으나 높은 안정성을 보이는 유전자들과 낮은 안정성을 보이는 유전자들의 순위 경향에는 차이가 없이 유사하였다. 반면 BestKeeper의 경우 자어 발달 부분집합에서 가장 안정적인 유전자들로 RPL7과 GAPDH를 선정하였는데, 이들 두 유전자는 배 발생 부분집합에서 각각 7순위와 4순위에 해당하는 유전자들로서 두 부분집합들 간 유전자 발현 패턴에 차이가 있음을 보여주었다. 배 발생 부분집합에서 가장 높은 순위를 부여 받았던 H2A의 유전자의 경우 자어 발달 부분집합에서는 5순위로 평가되었다.
- , 2013b). 반면 RPL5, RPL7 및 H2A는 유사한 GRV 값(3.42-3.91)을 나타내어 유사한 수준의 발현 안정성을 나타내었는데, RPL5와 RPL7의 경우 분석한 프로그램에 따라 안정성 순위가 크게 차이 나는 경향을 보여, GRV에 의한 안정성 순위 자체에 큰 의미를 부여하기가 힘들었다. 한편 H2A가 배 발생 부분집합에서만큼 높은 순위를 받지 못한 이유는 자어 발달 부분집합에서 평균 Cq 값은 배 발생 단계와 큰 차이 없음에도 불구하고 자어 발달 구간에서는 발달 단계별 발현 편차가 상대적으로 증가하였기 때문으로 판단되며, 그 원인에 대해서는 추가적인 검증과 분석이 필요한 상태이다.
- 단백질 분해 및 염색사 구조를 각각 주 기능으로 담당하는 UBE2A와 H2A는 수정부터 첫 부화까지 비교적 일정한 발현 수준을 유지였지만 이와는 달리 ACTB와 RPL7은 부화 후반부에 발현 양이 크게 증가하는 경향을 나타냄으로써 발현 안정성 측면에서 높은 점수를 받지 못하였다. 발생 단계별로 Cq 값을 발현 양 값으로 환산할 경우 ACTB와 RPL7 두 유전자 모두 발생 초기에는 일정한 발현 수준을 유지하였지만 신경배 형성 시작(onset of neurulation) 시점부터 급속도로 유전자 발현이 증가하기 시작하여(직전 발생 단계 대비 8배 증가), 부화 시점에서는 초기 난할 구간에서 관찰되는 발현 양의 70-90배에 달하는 발현 증가를 보였다. 두 유전자의 발현이 급속도로 증가하는 시점은 배아체(embryonic body)의 형성 시작과 함께 본격적인 체적의 증가와 전신(pronephros), 두부(head), 체절(somite) 및 심장(S-heart) 등 다양한 기관의 발달과 분화가 일어나는 구간으로서(Dettlaff et al.
- 발생 배 부분집합에서의 안정성 평가 결과를 종합할 때 UBE2A와 H2A가 상대적으로 높은 순위로 선정된 반면 ACTB와 RPL7이 가장 낮은 발현 안정성을 보이는 유전자들로 선정 되었는데, 이 역시 발생 단계에서의 유전자 별 차등적인 역할과 연관이 있으며 앞서의 Cq profile 결과와 서로 일치하는 경향을 보여주었다. 단백질 분해 및 염색사 구조를 각각 주 기능으로 담당하는 UBE2A와 H2A는 수정부터 첫 부화까지 비교적 일정한 발현 수준을 유지였지만 이와는 달리 ACTB와 RPL7은 부화 후반부에 발현 양이 크게 증가하는 경향을 나타냄으로써 발현 안정성 측면에서 높은 점수를 받지 못하였다.
- 그 외 유전자들의 경우 H2A 및 RPL7이 나머지 4개 유전자(GAPDH, RPL5, SDHA 및 UBE2A)보다 상대적으로 높은 발현 양상을 나타내었다. 발생 배 시료 그룹 내에서 Cq 값의 편차를 분석한 결과, H2A가 가장 작은 폭의 편차를 나타내어 상대적으로 가장 균일한 Cq 값들의 분포를 나타내었고, 이어서 UBE2 및 SDHA가 그 뒤를 이어 적은 편차를 보였다. 반면 EF1A가 가장 큰 폭의 그룹 내 Cq 값의 편차를 보였다(Fig.
- 배 발생 부분집합에서 3개의 분석 프로그램으로 유전자 발현 안정성을 평가한 결과, 3 종류 프로그램들은 각기 다른 유전자들을 가장 안정적인 참조 유전자로 선정함에 따라 분석 프로그램의 알고리즘에 따른 선정 차이를 나타내었다. geNorm의 경우 SDHA와 UBE2A를 가장 안정적인 쌍으로 선정한 반면, ACTB와 RPL7을 가장 불안정한 후보 유전자들로 선정하였다.
- 본 평가에서 사용한 8종의 유전자들은 세포 골격(ACTB), 번역(EF1A), 당 분해에 의한 에너지 생성(GAPDH), 염색사 (chromatin) 구조(H2A), 리보좀 합성(RPL5 및 RPL7), 구연산 회로(SDHA), 그리고 단백질 분해 대사(UBE2A)에 각기 주요 기능을 담당하는 유전자들로서 러시아 철갑상어의 발생 및 자어 발달에서 유전자 별로 다양한 발현 수준에 해당하는 다양한 Cq 값 구간을 보였으며, 이는 이들 해당 유전자들의 세포 내 기본 기능의 차이와 연관이 있는 것으로 판단된다. 유전자 별 Cq 구간 조사에서 전체적으로 배 발생 과정에 비해 부화 후 자어 발달에서 여러 유전자들의 발현 수준이 증가하는 것(Cq의 감소)이 관찰되었다.
- 부화 후 자어 발달 그룹(larval subset)에서 유전자들 간 Cq 양상은 배 발생 그룹에서의 관찰 결과와 유사하였으나, 전반적으로 유전자들의 발현 수준이 증가하는(Cq 값이 감소) 경향을 나타내었다. 이와 같은 Cq 값의 감소(평균 Cq 값 기준 시) 경향은 GAPDH, RPL7 그리고 ACTB에서 상대적으로 나머지 다른 유전자들에 비해서 보다 두드러진 경향을 나타내었고, H2A의 경우 배 발생 그룹과 자어 발달 그룹 간 Cq 평균값에 대한 차이가 거의 관찰되지 않았다.
- 부화 후부터 11일째까지의 부분집합 그룹을 대상으로 한 안정성 분석에서도 마찬가지로 서로 다른 분석 프로그램들은 각기 다른 유전자들을 최고 안정적인 유전자들로 나타내었는데, geNorm 및 NormFinder 프로그램의 경우, 앞서 배 발생 부분집합 그룹에서와 동일하거나 거의 유사한 유전자 순위를 나타낸 반면, BestKeeper의 경우 배 발생과는 유의적인 차이를 나타내었다. geNorm 분석의 경우 배 발생에서와 마찬가지로 SDHA 및 UBE2A가 가장 낮은 M 값(가장 높은 안정성)을 갖는 것으로 나타났고 반면 RPL7 및 ACTB가 가장 불안정한 발현을 보이는 유전자들로 평가되었다.
- 상기 두 부분집합(subsets) 그룹들의 Cq 값을 모두 대상으로 통합하여 그 양상을 분석한 결과, 조사한 8개 유전자들 중 ACTB와 RPL7이 러시아 철갑상어 배 발생 및 자어 발달 단계 에서 가장 높은 발현을, EF1A가 가장 낮은 발현을 나타내었다. 두 기간을 모두 대상으로 할 경우 발생하는 발현 편차 폭의 경우, GAPDH가 가장 큰 폭의 Cq 값의 표준 편차를 나타내었고 이어서 RPL7, EF1A, ACTB, RPL5 순으로 높은 편차를 나타내었으며, H2A가 가장 낮은 표준 편차를 보였다(Fig.
- , 2013a), 이 구간에서는 세포의 형태 분화, 세포 골격 형성 및 다양한 종류의 단백질 합성을 필요로 하게 되고, ACTB와 RPL7의 요구가 증가되었음을 시사하고 있다. 상기 두 유전자뿐만 아니라 EF1A, RPL5, GAPDH 역시 상대적으로 낮은 안정성 순위에 해당되었는데, 이들 유전자들 역시 발생 초기에 비해 발생 후반부에서 유전자 발현이 증가하는 경향을 나타냄으로써 ACTB와 RPL7과함께 단백질 합성 및 에너지 생성에 관여하는 유전자들이 배아체 발달에 밀접하게 관여함을 잘 보여주고 있다. 따라서 본 연구 결과, 러시아 철갑상어 배 발생 구간(수정부터 부화까지)을 대상으로 한 RT-qPCR 분석 시 단백질 합성, 세포 분화, 당 분해 (glycolysis)에 밀접히 관련되지 않은 유전자들을 참조 유전자로 선정하여 이용하는 것이 바람직하고 그 예로서 본 논문에서는 UBE2A 또는 H2A를 제시하고 있다.
- 상기 배 발생 부분집합과 자어 발달 부분집합의 Cq 자료를 모두 통합하여 유전자 발현 안정성 평가를 실시한 결과, 배 발생 및 자어 발달 부분집합 모두에서 가장 발현 안정성이 높은 유전자로 선정되었던 UBE2A가 역시 통합 집합에서도 가장 우수한 참조 유전자 후보로 평가되었다(geNorm에서 1순위, NormFinder에서 4 순위 그리고 BestKeeper에서 2 순위). 본연구를 통해 참조 유전자 후보로 추천 가능한 UBE2A의 경우 전통적으로 널리 사용된 바 있는 유전자는 아니지만 Arctic charr Salvelinus alpinus의 발생·발달 시료(Ahi et al.
- 56)가 가장 낮은 발현을 보였다. 유전자 별 Cq 값의 편차에 있어서 앞서 배 발생 그룹에서의 결과와 차이를 나타내는 유전자들이 관찰되었는데, ACTB, EF1A, GAPDH 및 RPL7의 경우 배 발생 그룹에서보다 발현의 편차가 유의적으로 감소하였으며, 반대로 H2A의 경우 자어 그룹에서 발현 수준의 편차 폭이 소폭 증가하였다(Fig. 1).
- 본 평가에서 사용한 8종의 유전자들은 세포 골격(ACTB), 번역(EF1A), 당 분해에 의한 에너지 생성(GAPDH), 염색사 (chromatin) 구조(H2A), 리보좀 합성(RPL5 및 RPL7), 구연산 회로(SDHA), 그리고 단백질 분해 대사(UBE2A)에 각기 주요 기능을 담당하는 유전자들로서 러시아 철갑상어의 발생 및 자어 발달에서 유전자 별로 다양한 발현 수준에 해당하는 다양한 Cq 값 구간을 보였으며, 이는 이들 해당 유전자들의 세포 내 기본 기능의 차이와 연관이 있는 것으로 판단된다. 유전자 별 Cq 구간 조사에서 전체적으로 배 발생 과정에 비해 부화 후 자어 발달에서 여러 유전자들의 발현 수준이 증가하는 것(Cq의 감소)이 관찰되었다. 특히 GAPDH, RPL7 및 EF1A와 같이 에너지 생성 및 단백질 합성에 관여 하는 유전자들의 경우 그 발현 양 증가가 더 두드러졌으며, 이는 철갑상어 자어가 부화 직후 갖는 왕성한 활동성과 자어의 빠른 성장과 연관이 있다고 판단된다(Dettlaff et al.
- 한편 배 발생 부분집합에서와 마찬가지로 ACTB가 가장 낮은 발현 안정성을 보였으며 뒤이어 EF1A가 ACTB 다음으로 낮은 안정성 순위를 보였다. 이들 두 유전자의 경우 자어의 발달 과정 중 발현 변화의 폭이 상대적으로 다른 유전자들에 비해 큰 편이었는데 이들 두 유전자들은 공통적으로 4 DPH에서 5 DPH로 진행될 때 급격한 유전자 발현 양 감소를 보이며 발현 양의 최저치가 8-9 DPH에서 나타나고 이후 다시 발현 수준이 점진적으로 증가하는 경향을 보였다. 자어의 형태 발달만을 고려할 때, 본 연구에서 사용한 자어 사육 온도에서 4-5 DPH는 러시아 철갑상어 자어의 활발한 초기 형태 분화가 거의 완성되는 시점이며, 8-9 DPH는 난황 흡수와 함께 pigment plug 배출이 일어나는(즉, 외부 먹이 섭취 체제로 전환) 시점이다(Dettlaff et al.
- 각 유전자 별로 프라이머 길이(20 mers), G+C content (45-60%), melting temperature (55-65℃) 및 증폭 산물의 길이(150-200 bp)를 기준으로 2-3쌍의 primer 쌍을 합성하여 PCR 효율(PCR effi-ciency; E) 및 단일 밴드의 선명한 증폭 여부를 재평가하여 유전자 별로 최적 프라이머 쌍을 선정하였다. 이때 PCR 효율 값(E)은 철갑상어 치어 전어체 cDNA 주형과 Light Cycler 480 realtime PCR system을 이용하여 평가하였으며, 최소 94% 이상의 PCR 효율로 증폭됨을 확인하였다. 단일 크기의 밴드 증폭 여부는 PCR 증폭 산물을 1.
- 한편 BestKeeper를 이용한 분석에서는 H2A와 UBE2가 발현 안정성에서 가장 우수한 점수를 받았고, 반면 RPL7과 EF1A가 가장 낮은 점수를 받은 것을 나타났다. 이에 이들 3 종류 프로그램에서 얻어진 유전자 별 순위를 기하평균으로 환산할 경우, UBE2A(geomean of ranking value; GRV 2.00)와 H2A (GRV=2.29)가 러시아 철갑상어 발생 배 시료에서 가장 높은 순위의 참조 가능 유전자들로 나타났으며, 반대로 ACTB (GRV=6.84)와 RPL7 (GRV=7.00)이 특히 낮은 순위의 유전자들로 선정되었다. GRV를 기준 시 조사한 8개 유전자의 순위는 UBE2>H2A >SDHA>GAPDH>RPL5>EF1A>ACTB>RPL7 순으로 나타났다(Fig.
- 부화 후 자어 발달 그룹(larval subset)에서 유전자들 간 Cq 양상은 배 발생 그룹에서의 관찰 결과와 유사하였으나, 전반적으로 유전자들의 발현 수준이 증가하는(Cq 값이 감소) 경향을 나타내었다. 이와 같은 Cq 값의 감소(평균 Cq 값 기준 시) 경향은 GAPDH, RPL7 그리고 ACTB에서 상대적으로 나머지 다른 유전자들에 비해서 보다 두드러진 경향을 나타내었고, H2A의 경우 배 발생 그룹과 자어 발달 그룹 간 Cq 평균값에 대한 차이가 거의 관찰되지 않았다. 따라서 자어 발달 그룹에서는 ACTB (중앙 값=16.
- 자어 발달 부분집합에서의 GRV를 기준으로 순위에 대한 기하평균값을 계산하면 UBE2A (GRV=2.47)>GAPDH>S DHA>RPL5>RPL7>H2A>EF1A>ACTB (GRV=6.35) 순으로 발현 안정성 순위를 나타내었다(Fig. 3).
- 자어 발달 부분집합을 대상으로 한 안정성 평가를 GRV로 종합한 결과, 앞서 배 발생 구간에서와 마찬가지로 UBE2A가 가장 발현 안정성이 높은 유전자로 평가되어 자어 발달 단계에서도 참조 유전자로서 활용 가능성이 인정되었다. 자어 발달구간에서는 UBE2A에 이어 GAPDH와 SDHA가 두 번째로 높은 발현 안정성 순위(GRV=2.
- 전체 시료들을 대상으로 한 GRV 평가에 서는 UBE2A (GRV=2.00)>SDHA (2.08)>H2A (2.71)>RPL5(3.42)>GAPDH (3.63)>EF1A (4.76)>ACTB (6.84)>RPL7 (7.00) 순으로 발현 안정성이 높게 측정되어 UBE2A와 SDHA가 유사한 정도의 순위 기하평균 값을 나타내었으며, ACTB와 RPL7이 유의적으로 낮은 발현 안정성 순위를 보였다(Fig. 4).
- 최종 선정한 후보 유전자들의 증폭 조건에서 PCR 효율은 94.1-102.4%로 나타나 발현정량 분석을 위한 적절한 PCR 효율 조건이 충족되었음을 알 수 있었고(Schmittgen and Livak, 2008; Doak and Zair, 2012), 역시 melting curve 분석 및 단일 밴드 형성을 확인함으로써 유전자 특이적인 증폭 반응이 이루어졌음을 확인할 수 있었다(data not shown). 러시아 철갑상어배 발생 그룹(embryonic subset)을 대상으로 8개 후보 유전자의 Cq 값 양상을 조사한 결과, ACTB가 20.
- UBE2A와 아울러 두부분집합들에서 모두 상위의 순위를 나타내었던 SDHA 역시 통합 그룹에서도 geNorm 1순위, NormFinder 3순위, 그리고 BestKeeper 3순위를 나타내어 UBE2A에 이어 추천 가능한 참조 유전자 후보로 평가되었다. 통합 그룹의 GRV 평가에서 3순위에 해당하는 유전자는 H2A였으며, H2A는 특히 BestKeeper 에서 가장 높은 평가를 받았다. SDHA 및 H2A는 그 동안 어류에서는 자주 논의된 적이 없는 참조 유전자 후보들로서 본 연구를 통해 새로이 소개된 유전자들로서, 앞으로 어류 발생 관련 참조 유전자 발굴 시 그 선정 후보 대상으로 포함될 수 있을 것으로 판단된다.
- NormFinder의 경우 GAPDH와 RPL5를 안정도 순위 1 및 2순위로 선정하였고 geNorm과 마찬가지로 ACTB와 RPL7을가장 낮은 순위인 8 및 7 순위로 각각 나타내었다. 한편 BestKeeper를 이용한 분석에서는 H2A와 UBE2가 발현 안정성에서 가장 우수한 점수를 받았고, 반면 RPL7과 EF1A가 가장 낮은 점수를 받은 것을 나타났다. 이에 이들 3 종류 프로그램에서 얻어진 유전자 별 순위를 기하평균으로 환산할 경우, UBE2A(geomean of ranking value; GRV 2.
- 한편 H2A가 배 발생 부분집합에서만큼 높은 순위를 받지 못한 이유는 자어 발달 부분집합에서 평균 Cq 값은 배 발생 단계와 큰 차이 없음에도 불구하고 자어 발달 구간에서는 발달 단계별 발현 편차가 상대적으로 증가하였기 때문으로 판단되며, 그 원인에 대해서는 추가적인 검증과 분석이 필요한 상태이다. 한편 배 발생 부분집합에서와 마찬가지로 ACTB가 가장 낮은 발현 안정성을 보였으며 뒤이어 EF1A가 ACTB 다음으로 낮은 안정성 순위를 보였다. 이들 두 유전자의 경우 자어의 발달 과정 중 발현 변화의 폭이 상대적으로 다른 유전자들에 비해 큰 편이었는데 이들 두 유전자들은 공통적으로 4 DPH에서 5 DPH로 진행될 때 급격한 유전자 발현 양 감소를 보이며 발현 양의 최저치가 8-9 DPH에서 나타나고 이후 다시 발현 수준이 점진적으로 증가하는 경향을 보였다.
- 한편 자어 부분집합 그룹에서 NormFinder 분석에 의한 발현 안정성 순위는 RPL5>GAPDH>H2A>SDHA>UBE2>EF1A>RPL7>ACTB로 나타나 배 발생 부분집합 그룹과 비교 시, 1순위와 2순위, 그리고 4순위와 5순위 간 순위 바뀜이 있었으나 높은 안정성을 보이는 유전자들과 낮은 안정성을 보이는 유전자들의 순위 경향에는 차이가 없이 유사하였다.
후속연구
- 그러나 H2A 경우, oligo-dT 프라이머와 random 프라이머 모두에 의한 역전사 산물이 함께 형성되는 다른 7개 유전자들과 달리 random priming에 의한 cDNA 주형을 주로 제공하므로, 역전사 방법의 차이에 따른 잠재적인 Cq 값의 변동 폭에 관한 추가 분석이 필요할 수 있다(Lopez and Samuelsson, 2008).
- 통합 그룹의 GRV 평가에서 3순위에 해당하는 유전자는 H2A였으며, H2A는 특히 BestKeeper 에서 가장 높은 평가를 받았다. SDHA 및 H2A는 그 동안 어류에서는 자주 논의된 적이 없는 참조 유전자 후보들로서 본 연구를 통해 새로이 소개된 유전자들로서, 앞으로 어류 발생 관련 참조 유전자 발굴 시 그 선정 후보 대상으로 포함될 수 있을 것으로 판단된다. 어류에서는 아직 활발히 사용된 바 없지만 이들 두 유전자들은 포유류, 곤충, 식물 또는 배양세포 등에서 발현 안정성이 높은 유전자로 평가된 바 있다(Souza et al.
- , 1993). 따라서 이들 유전자 발현의 변동과 해당 발달 시기의 발달 특징에 대한 정확한 상관관계 및 원인에 대한 추후 연구가 필요할 것이다.
- 단 배 발생 단계와 자어 단계를 구분하거나 별도로 분석을 할 경우에는 H2A (배 발생) 및 GAPDH (자어 발달)도 사용 가능할 수 있을 것이다. 본 연구에서 얻어진 자료는 향후 러시아 철갑상어의 배 발생 및 자어 발달에 관여하는 연구 대상 유전자들의 발생·발달 과정 중 발현 증감을 효과적으로 객관화하는데 유용한 정보로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이들 유전자들의 경우 발생·발달의 전 구간을 대상으로 한 정량 발현 분석에 참조 유전자로 사용하는 것은 부적절하며, 사용해야 한다면 안정적 발현을 보이는 특정 발생·발달 구간에 국한된 시료들 간의 비교에만 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
- 91)을 나타내어 유사한 수준의 발현 안정성을 나타내었는데, RPL5와 RPL7의 경우 분석한 프로그램에 따라 안정성 순위가 크게 차이 나는 경향을 보여, GRV에 의한 안정성 순위 자체에 큰 의미를 부여하기가 힘들었다. 한편 H2A가 배 발생 부분집합에서만큼 높은 순위를 받지 못한 이유는 자어 발달 부분집합에서 평균 Cq 값은 배 발생 단계와 큰 차이 없음에도 불구하고 자어 발달 구간에서는 발달 단계별 발현 편차가 상대적으로 증가하였기 때문으로 판단되며, 그 원인에 대해서는 추가적인 검증과 분석이 필요한 상태이다. 한편 배 발생 부분집합에서와 마찬가지로 ACTB가 가장 낮은 발현 안정성을 보였으며 뒤이어 EF1A가 ACTB 다음으로 낮은 안정성 순위를 보였다.
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