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문제 정의
- 반면에 nicotiflorin의 아글리콘인 kaempferol에 대한 항산화 활성에 대한 보고는 있으나, 그 배당체인 nicotiflorin과 비교하여 라디칼 소거활성, ROS 소거활성 및 1O2로 유도된 세포 손상에서의 세포 보호 효과에 대한 비교연구는 보고된 바 없다. 따라서 이번 연구에서는 그라비올라 잎 부위에 포함된 nicotiflorin과 아글리콘 분획하여 얻은 kaempferol을 대상으로 항산화 활성과 세포 보호 효과를 측정하고 그 메커니즘을 연구하여 이를 보고하고자 한다.
- 농도 의존적인 kaempferol의 세포 보호 효과를 Figure2에 나타내었다. Nicotiflorin과 비교하여 그 아글리콘인 kaempferol의 월등한 세포 보호 효과에 대한 메커니즘을 규명하고자 하였다. 이와 함께 kaempferol과 그 배당체인 nicotiflorin의 세포 보호능 차이에 대한 원인을 분석하고자 하였다.
- Nicotiflorin과 비교하여 그 아글리콘인 kaempferol의 월등한 세포 보호 효과에 대한 메커니즘을 규명하고자 하였다. 이와 함께 kaempferol과 그 배당체인 nicotiflorin의 세포 보호능 차이에 대한 원인을 분석하고자 하였다.
- 자유라디칼 소거능이 kaempferol의 우수한 세포 보호 효과를 나타내는데 기여했는지를 알아보고자 하였다. Nicotiflorin 및 kaempferol의 라디칼 소거 활성(FSC50)은 각각 910.
- 본 연구에서는 그라비올라의 주성분으로 밝혀진 nicotiflorin을 분리하고 이를 아글리콘 분획하여 kaempferol을 얻음으로써 이들의 세포보호 효과를 확인하고, 그 보호 메커니즘을 규명하였다. 비교물질로는 L-ascorbic acid, (+)-α-tocopherol을 사용하였다.
- 이러한 활성산소는 세포막에서 막지질 자동산화 반응 과정으로 세포막을 손상시켜서 세포를 파괴시킨다. 본 연구에서는 광증감제로 알려진 rose-bengal 및 적혈구 세포를 이용하여 1O2로 유도된 산화적 세포 손상(광용혈)에 대한 항산화제의 보호 효과를 평가하였다. 활성산소에 의해 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)으로 대조군 및 항산화제들의 세포 보호 효과를 비교 평가하였다.
제안 방법
- 비극성 성분을 제거하기 위해 50% 에탄올 추출물을 n-헥산으로 처리한 후 에틸 아세테이트로 분획하였다. 에틸 아세테이트 분획을 100% 에탄올에 용해시키고, ethyl acetate : acetic acid : formic acid : distilled water (8 : 1 : 1 : 1)로 구성된 전개 용매를 사용하여 유리 TLC 판에 전개시켰다. 그라비올라 잎 에틸 아세테이트 분획에서 주성분으로 밝혀진 nicotiflorin의 밴드(Rf 0.
- 암소에서 30 min 간 pre-incubation시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (13 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 15 min 동안 광 조사하였다.
- 동일한 방법으로 적혈구 현탁액을 제조하였고, 투과율을 효과적으로 관찰하기 위해 시료의 농도는 보호 효과를 관찰한 농도 중 가장 높은 농도인 25 µM로 설정하였다.
- 메탄올을 용매로 사용하여 rose-bengal 24 µM, DPBF 15, 30, 60, 90 µM을 준비하였다.
- 적혈구의 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다.
- 광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 시간 간격으로 700 nm에서의 투광도(transmittance, %)를 통해 평가하였다. 적혈구 현탁액 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
- Singlet oxygen 소광 속도 상수 실험법은 이전 연구에 명시된 방법을 참조 및 응용하여 진행하였다[22]. 광증감제로 rose-bengal을 사용하였으며, 광증감 반응으로 발생된 1O2 양의 측정은 DPBF를 이용해 측정하였다.
- Singlet oxygen 소광 속도 상수 실험법은 이전 연구에 명시된 방법을 참조 및 응용하여 진행하였다[22]. 광증감제로 rose-bengal을 사용하였으며, 광증감 반응으로 발생된 1O2 양의 측정은 DPBF를 이용해 측정하였다. DPBF는 1O2에 대하여 물리적 소광 작용을 하지 않고 화학적 소광만을 한다고 알려져 있다.
- 메탄올을 용매로 사용하여 rose-bengal 24 µM, DPBF 15, 30, 60, 90 µM을 준비하였다. 시험관에 rose-bengal 1 mL, DPBF 1 mL를 넣고, 메탄올로 제조한 다양한 농도의 시료 1 mL를 첨가한 후 1 min간 조사하였다. 조사 전과 후에 DPBF의 λmax인 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 조사 전과 후에 DPBF의 λmax인 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 과정을 이용하여 DPBF의 4개의 농도에 대해 각각의 흡광도 감소를 측정하였다. 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq 값을 구할 수 있었다[22].
- 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq 값을 구할 수 있었다[22]. 공시험(Blank)으로 DPBF를 제외한 rose-bengal 1 mL, 메탄올 1 mL, 시료 1 mL를 시험관에 넣고 410 nm에서 흡광도를 측정하여 rose-bengal과 시료의 영향을 보정하였다. 모든 과정은 암실에서 진행하였다.
- 2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 시료 1 mL를 혼합하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 공시험(blank), 시료를 넣지 않은 것을 대조군(control), 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 계산하였다. 자유라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였으며, 자유라디칼(DPPH) 소거 활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
- ROS 소거 활성은 luminol이 활성산소종에 의해 산화되어 나타나는 빛을 화학발광기로 검출하여 측정하였다. 화학발광 측정용 튜브에 증류수 1.
- 그 후 Fenton 반응을 통한 활성산소종 생성을 위해 150 mM H2O2 40 µL를 넣고 화학발광을 25 min 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3ㆍ6H2O 대신 증류수를 첨가하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다.
- 물질들이 적혈구 막 내부에 위치하는 것이 항산화 활성을 나타내는 데 영향을 미치는지 알아보기 위해 적혈구 세포 침투율 실험을 진행하였다. 광용혈법을 이용한 세포 보호 효과 실험과 가장 유사한 조건에서 실험을 진행하기 위해 동일한 조건으로 실험을 진행하였다.
- 물질들이 적혈구 막 내부에 위치하는 것이 항산화 활성을 나타내는 데 영향을 미치는지 알아보기 위해 적혈구 세포 침투율 실험을 진행하였다. 광용혈법을 이용한 세포 보호 효과 실험과 가장 유사한 조건에서 실험을 진행하기 위해 동일한 조건으로 실험을 진행하였다. 동일한 방법으로 적혈구 현탁액을 제조하였고, 투과율을 효과적으로 관찰하기 위해 시료의 농도는 보호 효과를 관찰한 농도 중 가장 높은 농도인 25 µM로 설정하였다.
- 로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과는 kaempferol > (+)-α-tocopherol > nicotiflorin >>> L-ascorbic acid 순이었다. 세포 보호 효과 메커니즘을 알아보기 위해 nicotiflorin, kaempferol 및 양성 대조군들의 1O2 소광능, 자유라디칼 소거 활성, ROS 소거 활성을 평가하였다.
- 이렇게 얻어진 상층액을 미리 UV-scan을 통해 확인한 각 시료의 λmax 파장에서 spectrophotometer를 이용해 정량하였다.
- 본 연구에서는 활성산소로 유도된 광용혈 시스템에서, nicotiflorin 및 kaempferol을 각각 1, 5, 10 및 25 µM의 농도로 처리하고 그 보호 효과를 확인하였다(Table 1).
- 활성산소에 의해 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)으로 대조군 및 항산화제들의 세포 보호 효과를 비교 평가하였다.
- 이렇게 얻어진 상층액을 미리 UV-scan을 통해 확인한 각 시료의 λmax 파장에서 spectrophotometer를 이용해 정량하였다. 시료를 제외하고 용매를 첨가하여 동일한 과정으로 blank를 측정하였고, 이를 이용해 각 실험군을 보정하여 적혈구의 영향을 보정하였다.
대상 데이터
- FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을 사용하였다.
- 적혈구 광용혈 실험에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을, UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH 미터는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였으며, 물질분석을 위해 HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 Shim-pack VP-ODS C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 제품을 사용하였다.
- 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (Korea)를 통해 구입하였다.
- 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF), H2O2, luminol, heparin, rosebengal, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co.
- (Japan) 제품을 사용하였다. 완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 H2SO4, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용한 그라비올라 잎은 2017년 5월 경동시장에서 구입하였다.
- 완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 H2SO4, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 실험에 사용한 그라비올라 잎은 2017년 5월 경동시장에서 구입하였다. Silica gel 60 F254 thin layer chromatography (TLC)는 Merck (USA)사에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 그라비올라 잎은 2017년 5월 경동시장에서 구입하였다. Silica gel 60 F254 thin layer chromatography (TLC)는 Merck (USA)사에서 구입하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol, L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (Korea)를 통해 구입하였다.
- 1O2 소광 속도 상수 측정에서 양성 대조군으로는 우수한 1O2 소광제로 알려진 β-carotene을 사용하였고 본 실험에서 측정한 β-carotene의 소광 속도상수 값인 Kq는 2.1 × 1010 M-1S-1으로 문헌에서 제시된 속도상수(2.6 × 1010 M-1S-1)와 유사한 결과를 나타내었다[22].
- 비교물질로는 L-ascorbic acid, (+)-α-tocopherol을 사용하였다.
데이터처리
- 0 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
이론/모형
- Nicotiflorin으로부터 kaempferol을 얻기 위해 산 가수분해 방법을 이용하였다. Nicotiflorin에 5% H2SO4 용액을 첨가한 후 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류ㆍ냉각시켰다.
- 이와 같은 과정을 이용하여 DPBF의 4개의 농도에 대해 각각의 흡광도 감소를 측정하였다. 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq 값을 구할 수 있었다[22]. 공시험(Blank)으로 DPBF를 제외한 rose-bengal 1 mL, 메탄올 1 mL, 시료 1 mL를 시험관에 넣고 410 nm에서 흡광도를 측정하여 rose-bengal과 시료의 영향을 보정하였다.
- 자유라디칼 소거 활성을 알아보기 위해 DPPH법을 이용하였다. 메탄올에 용해시킨 0.
성능/효과
- 모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 25.0 min으로 오차범위 ± 1.0 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
- 따라서 자유라디칼 소거 활성이 세포 보호 효과에 기여한 것으로 판단된다. 반면 nicotiflorin은 매우 낮은 라디칼 소거 활성을 보였는데, 이처럼 같은 분자 구조를 가진 물질이라도 배당체의 유무가 항산화 활성에 매우 큰 영향을 준다는 것을 알 수 있었다. 따라서 배당체와 아글리콘 사이의 세포 보호능 차이를 반영한 결과라고 여겨진다.
- 2 µM로 나타났다. Kaempferol의 총 항산화능이 가장 크게 나타났으며, 이는 kaempferol의 뛰어난 세포 보호능이 자유라디칼 소거 활성뿐만 아니라 여러 가지 ROS에 대한 총 항산화능에 의한 결과라고 예상된다. Nicotiflorin의 경우에는 kaempferol 보다 총 항산화능이 떨어졌지만, (+)-α-tocopherol보다 우수하였는데 이는 세포 보호 효과와 일치하지 않았다.
- 뿐만 아니라 1O2에 의해 인지질 탄소 사슬에 형성되는 라디칼은 세포막 내부에 존재하면서 연쇄 반응을 일으키기 때문에 항산화 물질이 세포막 내부에 존재하지 않는다면 효과적으로 세포 용혈을 막을 수 없다. 따라서 항산화물질이 세포와 독립적으로 존재하는 것보다 세포막 사이에 존재할 때 더 효과적인 세포 보호 효과를 나타낼 수 있다. 세포 침투율에 대한 실험 결과는 “침투한 양(µM)/초기에 넣어준 양(25 µM) × 100(%)”로 나타내었다(Figure 4).
- (+)-α-Tocopherol은 kaempferol보다 많은 양이 세포막에 침투하였고 1O2 소광 효과는 거의 유사했지만 세포 보호 효과가 훨씬 작았다.
- Type I 반응으로부터 생성되는 라디칼 종들에 대한 소거 활성과 Type II 반응으로부터 부가적으로 생성되는 각종 ROS에 대한 소거 활성은 kaempferol이 (+)-α-tocopherol보다 월등한 항산화 능력을 보였다.
- (+)-α-Tocopherol은 kaempferol보다 많은 양이 세포막에 침투하였고 1O2 소광 효과는 거의 유사했지만 세포 보호 효과가 훨씬 작았다. 따라서 kaempferol의 우수한 자유라디칼 또는 ROS 소거 활성도 세포 보호 효과에 영향을 주었음을 알 수 있었다. 반면 L-ascorbic acid는 자유라디칼 및 ROS 소거 활성이 nicotiflorin 및 (+)- α-tocopherol보다 뛰어났으나 세포 보호 효과를 보이지 않았다.
- 이는 L-ascorbic acid가 수용성 항산화제로 세포막 내부에 침투하지 못했기 때문으로 사료된다. 따라서 세포를 보호하기 위해서는 적혈구 세포내에 침투하는 능력이 필수적임을 확인하였다. 결론적으로, 광증감 반응으로부터 세포를 보호하는 메커니즘에는 세포 내로 침투하는 능력, 자유라디칼 소거 활성 및 ROS 소거 활성이 중요한 요인으로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 따라서 세포를 보호하기 위해서는 적혈구 세포내에 침투하는 능력이 필수적임을 확인하였다. 결론적으로, 광증감 반응으로부터 세포를 보호하는 메커니즘에는 세포 내로 침투하는 능력, 자유라디칼 소거 활성 및 ROS 소거 활성이 중요한 요인으로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.
- Type I 반응으로부터 생성되는 라디칼 종들에 대한 소거 활성과 Type II 반응으로부터 부가적으로 생성되는 각종 ROS에 대한 소거 활성은 kaempferol이 (+)-α-tocopherol보다 월등한 항산화 능력을 보였다. 이를 종합해 볼 때 세포 보호 효과는 1O2 소광 능력, 세포 침투율, 라디칼 및 ROS 소거 활성이 모두 반영된 것으로 판단되었다.
- 그 결과, 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol의 침투율은 25.4%, 수용성 항산화제인 L-ascorbic acid는 0.3%이었다.
- Nicotiflorin의 τ50은 1, 5, 10, 25 µM에서 각각 26.6, 27.1, 27.3, 32.7 min, kaempferol은 각각 40.0, 58.9, 91.9, 206.3 min으로 농도 의존적인 세포 보호 효과를 나타내었고, kaempferol은 그 배당체인 nicotiflorin에 비하여 농도별로 1.5, 2.2, 3.4, 6.3배 더 큰 보호 효과를 보였다.
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