그라비올라(Annona muricata) 잎 추출물 및 분획물의 항산화 활성과 성분 분석 Antioxidative Effects and Component Analysis of Graviola (Annona muricata) Leaf Extract/Fractions원문보기
본 연구에서는 그라비올라(Annona muricata) 잎으로부터 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획을 제조하였고 이들 추출물/분획에 대하여 항산화 활성을 평가하였다. 1,1-Phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 시험법을 이용한 자유라디칼 소거 활성, 루미놀 발광법을 이용한 총 항산화능 및 $^1O_2$소광 효과를 평가하였다. 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 각각 45.6, 29.8 및 $18.0{\mu}g/mL$이었고, 총 항산화능($OSC_{50}$)은 4.4, 1.1 및 $2.8{\mu}g/mL$이었다. 에틸아세테이트 분획의 총 항산화능은 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid ($1.5{\mu}g/mL$)보다 높은 항산화능을 나타내었다. $^1O_2$ 소광 상수 실험 결과, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획은 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid와 유사한 활성을 보여주었다. $^1O_2$으로 유도된 적혈구 세포 손상에 있어서, 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물은 농도 의존적($5-50{\mu}g/mL$)으로 세포보호 활성을 나타내었다. 실험에 사용된 그라비올라 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에 대하여 TLC 및 HPLC를 이용한 성분 분석을 수행하였다. 에틸아세테이트 분획에서는 rutin (quercetin-3-O-rutinoside), kaempferol-3-O-neohesperidoside, nicotiflorin (kaempferol-3-O-rutinoside), p-coumaric acid을 확인하였다. 아글리콘 분획에서는 kaempferol이 존재함을 확인하였다. 이상의 결과들은 그라비올라 잎 추출물이 항산화 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
본 연구에서는 그라비올라(Annona muricata) 잎으로부터 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획을 제조하였고 이들 추출물/분획에 대하여 항산화 활성을 평가하였다. 1,1-Phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 시험법을 이용한 자유라디칼 소거 활성, 루미놀 발광법을 이용한 총 항산화능 및 $^1O_2$ 소광 효과를 평가하였다. 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 각각 45.6, 29.8 및 $18.0{\mu}g/mL$이었고, 총 항산화능($OSC_{50}$)은 4.4, 1.1 및 $2.8{\mu}g/mL$이었다. 에틸아세테이트 분획의 총 항산화능은 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid ($1.5{\mu}g/mL$)보다 높은 항산화능을 나타내었다. $^1O_2$ 소광 상수 실험 결과, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획은 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid와 유사한 활성을 보여주었다. $^1O_2$으로 유도된 적혈구 세포 손상에 있어서, 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물은 농도 의존적($5-50{\mu}g/mL$)으로 세포보호 활성을 나타내었다. 실험에 사용된 그라비올라 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에 대하여 TLC 및 HPLC를 이용한 성분 분석을 수행하였다. 에틸아세테이트 분획에서는 rutin (quercetin-3-O-rutinoside), kaempferol-3-O-neohesperidoside, nicotiflorin (kaempferol-3-O-rutinoside), p-coumaric acid을 확인하였다. 아글리콘 분획에서는 kaempferol이 존재함을 확인하였다. 이상의 결과들은 그라비올라 잎 추출물이 항산화 화장품 원료로서 응용 가능성이 있음을 시사한다.
In this study, the antioxidative effects and component analysis of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction obtained from Annona muricata leaf were investigated. Free radical scavenging activities were performed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay, total antioxidan...
In this study, the antioxidative effects and component analysis of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction obtained from Annona muricata leaf were investigated. Free radical scavenging activities were performed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay, total antioxidant capacities were estimated using luminol-dependent chemiluminescence assay and $^1O_2$ quenching effects were estimated. Free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 45.6, 29.8 and $18.0{\mu}g/mL$, and total antioxidant capacities ($OSC_{50}$) were 4.4, 1.1 and $2.8{\mu}g/mL$, respectively. As a result of $^1O_2$ quenching experiment, ethyl acetate and aglycone fraction showed similar activities to L-ascorbic acid used as a comparative control. The cellular protective effects of 50% ethanol extract on the $^1O_2-induced$ cellular damage of human erythrocytes were exhibited at concentration-dependent ($5-50{\mu}g/mL$). TLC and HPLC were used to analyse components in the ethyl acetate fraction and aglycone fraction of Annona muricata leaf. In ethyl acetate fraction, rutin (quercetin-3-O-rutinoside), kaempferol-3-O-neohesperidoside, nicotiflorin (kaempferol-3-O-rutinoside), p-coumaric acid were identified. In aglycone fraction, kaempferol was identified. These results suggest that the extracts of Annona muricata leaf have the applicability as antioxidant cosmeceutical ingredients.
In this study, the antioxidative effects and component analysis of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction obtained from Annona muricata leaf were investigated. Free radical scavenging activities were performed by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay, total antioxidant capacities were estimated using luminol-dependent chemiluminescence assay and $^1O_2$ quenching effects were estimated. Free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) of 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 45.6, 29.8 and $18.0{\mu}g/mL$, and total antioxidant capacities ($OSC_{50}$) were 4.4, 1.1 and $2.8{\mu}g/mL$, respectively. As a result of $^1O_2$ quenching experiment, ethyl acetate and aglycone fraction showed similar activities to L-ascorbic acid used as a comparative control. The cellular protective effects of 50% ethanol extract on the $^1O_2-induced$ cellular damage of human erythrocytes were exhibited at concentration-dependent ($5-50{\mu}g/mL$). TLC and HPLC were used to analyse components in the ethyl acetate fraction and aglycone fraction of Annona muricata leaf. In ethyl acetate fraction, rutin (quercetin-3-O-rutinoside), kaempferol-3-O-neohesperidoside, nicotiflorin (kaempferol-3-O-rutinoside), p-coumaric acid were identified. In aglycone fraction, kaempferol was identified. These results suggest that the extracts of Annona muricata leaf have the applicability as antioxidant cosmeceutical ingredients.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
그라비올라 추출물 및 그 분획이 광증감 반응의 주생성물인 singlet oxygen을 효과적으로 소광시키는지 알아보고자 하였다. 광증감제인 rose-bengal에 빛이 조사되면 singlet oxygen (1O2)이 생성되는데, 1O2은 매우 높은 반응성을 갖는 활성산소종 중 하나로서 세포를 포함하는 체내 여러 물질에 손상을 입힌다.
또한 에틸아세테이트 분획 일부를 산 가수분해 반응을 이용하여 당을 제거시키고자 하였다. 에틸아세테이트 분획 0.
본 연구에서는 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물과 분획들의 항산화 및 세포보호 효과를 평가하고 성분분석을 진행하였다.
본 연구에서는 그라비올라 잎의 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획을 제조하고,다양한 항산화 활성 평가(자유라디칼 소거 활성, Fe3+-EDTA/H2O2계에서 생성된 다양한 활성산소에 대한 총 항산화능, 1O2 소거 활성, 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 보호활성)를 진행하고 활성 성분에 대한 분석을 진행함으로써 그라비올라 잎 추출물의 기능성 항산화 화장품 소재로서의 응용 가능성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
50% 에탄올 추출물은 5-50 µg/mL에서 대조군(100%) 대비 각각 108, 138, 150, 151%로 농도 의존적인 세포보호 효과를 나타내었다.
TLC에서 성분 분석을 위해 표준물질의 Rf 값, 자외선 그리고 2-aminoethyl diphenylbroinate (NP) 발색법을 이용하였고 이미 보고된 분광학적 자료를 참고하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 및 0.5% acetic acid의 50% acetonitrile 용매를 이용하여 기울기 용리법으로 분리하였고, 이때, HPLC 분리조건은 Table 1에 나타내었다.
분리된 띠를 긁어 HPLC로 분석한 결과, Figure 5(A)의 TLC (normal phase)에서 AME-1은 Figure 6(A)의 HPLC (reverse phase) peak 2, AME-2는 peak 3, AME-3은 peak 4, AME-8은 peak 1과 일치함을 확인하였다. HPLC 상에서 주성분으로 확인된 네 개의 띠(AME-1, 2, 3, 8)를 중점적으로 분석하였다. 먼저 UV 스펙트럼 및 LC/ESI-MS를 통하여 분석한 결과로 peak 1은 p-coumaric acid, peak 2는 rutin, peak 3은 kaempferol-3-O-neohesperidoside, peak 4는 nicotiflorin로 추정되었다(Table 4).
Singlet oxygen 소광 속도 상수 실험법은 이전 연구에 명시된 방법을 참조 및 응용하여 진행하였다[25]. 광증감제로 rose-bengal을 사용하였으며, 광증감 반응으로 발생된 1O2 양의 측정은 DPBF를 이용해 측정하였다.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, 적혈구 광용혈 실험에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA)사 제품을, pH 미터는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였으며, HPLC는 Shimadzu (Japan)사의 Shim-pack VP-ODS C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 µm) 제품을 사용하였으며, LC/ESI-MS (Applied Biosystems, USA)는 서울대학교 NICEM (농생명과학공동기기원)에 분석 의뢰를 하였다.
또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, steady-state approximation, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq값을 구할 수 있었다[25]. 공시험(blank)으로 DPBF를제외한 rose-bengal 1 mL, 메탄올 1 mL, 시료 1 mL를 시험관에 넣고 410 nm에서 흡광도를 측정하여 rose-bengal과 시료의 영향을 보정하였다. 모든 과정은 암실에서 진행하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 조사하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 시간 간격으로 700 nm에서의 투광도(transmittance, %)를 통해 평가하였다. 적혈구 현탁액 투광도의 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
Singlet oxygen 소광 속도 상수 실험법은 이전 연구에 명시된 방법을 참조 및 응용하여 진행하였다[25]. 광증감제로 rose-bengal을 사용하였으며, 광증감 반응으로 발생된 1O2 양의 측정은 DPBF를 이용해 측정하였다. DPBF는 1O2에 대하여 물리적 소광 작용을 하지 않고 화학적 소광만을 한다고 알려져 있다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL를 혼합하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 UV/Vis spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 공시험(blank), 시료를 넣지 않은 것을 대조군(control), 시료를 넣은 것을 실험군(experiment)으로 하여 계산하였다. 자유라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였으며, 자유라디칼(DPPH) 소거 활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획에 대하여 5, 10, 25 및 50 µg/mL의농도에서 적혈구 세포가 50% 파괴되는데 걸리는 시간(τ50)을 측정함으로써 세포보호 효과를 비교하였다(Table 3).
그라비올라 잎 추출물의 성분 분석은 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획을 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milipore 0.45 µm)를 이용하여 여과시킨 분획 용액을 TLC 및 HPLC 분석에 이용하였다.
그라비올라 잎 추출물의 성분 분석을 위해 TLC로부터 각각의 띠를 긁어 70% 에탄올로 추출한 후 농축하여 얻었다. 얻어진 파우더를 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milipore 0.
그라비올라 잎의 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획의 성분을 분석하기 위해 TLC 및 HPLC를 이용하고 LC/ESI-MS 및 UV 스펙트럼으로 확인하였다. 순상 TLC로 성분을 분리할 수 있는 이동상 조건(ethyl acetate : chloroform : formic acid : distilled water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v)) 하에서 그라비올라 잎 에틸아세테이트 분획은 8개의 띠(AME-1-AME-8)로 분리되었고, 이를 긁어 추출⋅농축한 각각의 성분들을 HPLC로 비교하였다.
대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3⋅6H2O 대신 증류수를 첨가하였다.
이들은 m/z 및 λmax 값이 같은 것을 참고문헌을 통해 확인하였다. 따라서 HPLC로 표준물질과 retention time을 비교하여 확인하였다(Table 4). 또한 TLC로 표준물질과 비교하여 Rf 값이 0.
이후 에틸아세테이트와 1 : 1 비율로 3번 분획하였다. 망초산(Na2SO4)을 이용하여 물을 제거하고 감압 농축하여 에틸아세테이트 분획(수율 0.7%)을 얻었다.
이는 지질과산화, 단백질 산화 등 자동산화반응에 의해 세포 손상을 야기한다. 본 연구에서는 광증감제로 알려진 rose-bengal 및 피부막 지질 이중층 구조와 유사한 적혈구 세포를 이용하여 1O2으로 유도된 산화적 세포 손상 시스템을 구축하였다. 활성산소로 인해 적혈구 세포가 50% 감소하는데 걸리는 시간(τ50)으로 세포보호 효과를 평가하였다.
분석 기기로 LC기기는 Thermo-Finnigan surveyor instrument (Thermo scientific, USA)(column spec. U-VDSpher Pur C18-E 1.8 µm , 50 × 2.0 mm Cat.-No. N0520E181UVC), autosampler, PDA-UV detector를 사용하였으며, 질량분석(Mass spectrometric analysis)기기는 Thermo Finnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface (Thermo scientific, USA)를 사용하였다.
순상 TLC로 성분을 분리할 수 있는 이동상 조건(ethyl acetate : chloroform : formic acid : distilled water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v)) 하에서 그라비올라 잎 에틸아세테이트 분획은 8개의 띠(AME-1-AME-8)로 분리되었고, 이를 긁어 추출⋅농축한 각각의 성분들을 HPLC로 비교하였다.
메탄올을 용매로 사용하여 rose-bengal 24 µM, DPBF15, 30, 60, 90 µM을 준비하였다. 시험관에 rose-bengal 1 mL, DPBF 1 mL를 넣고, 메탄올로 제조한 다양한 농도의 시료 1 mL를 첨가한 후 1 min간 조사하였다. 조사전과 후에 DPBF의 λmax인 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
암소에서 30 min 간 pre-incubation시킨 후, 광증감제인 rose-bengal (13 µM) 0.5 mL를 가하고 파라필름으로 입구를 봉한 후 15 min 동안 광 조사하였다.
얻어진 파우더를 100% 에탄올에 녹인 후, syringe filter (Milipore 0.45 µm)를 이용하여 여과하고 그 여액을 HPLC 및 LC/ESI-MS 분석에 이용하였다.
활성산소에 의해 루미놀은 들뜬 상태인 아미노프탈산으로 되고 이어 바닥상태로 떨어지면서 420-450 nm에서 발광하는 특성을 가진다. 이 계에 항산화제를 첨가하여 화학발광이 감소하는 정도에 따라 활성산소 소거 활성을 측정할 수 있으며, 이를 이용하여 총 항산화능 OSC50을 평가하였다.
조사전과 후에 DPBF의 λmax인 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 같은 과정을 이용하여 DPBF의 4개의 농도에 대해 각각의 흡광도 감소를 측정하였다. 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, steady-state approximation, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq값을 구할 수 있었다[25].
적혈구의 광용혈에 미치는 효과는 암반응 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
한편, 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물과 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol의 세포보호 활성을 비교하였다(Figure 4).
2 g에 증류수 9 mL, 아세톤 10 mL 및 H2SO4 1 mL를 순서대로 넣고, 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류⋅냉각시켰다. 환류 시킨 용액을 5% KOH-MeOH 용액으로 중화 시킨 후, 다시 에틸아세테이트를 이용하여 분획하고 이를 감압 증류하여 아글리콘(수율 0.3%)을 제조하였다(Figure 1).
활성산소로 인해 적혈구 세포가 50% 감소하는데 걸리는 시간(τ50)으로 세포보호 효과를 평가하였다.
대상 데이터
그 외 FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan)에서 구입하였고, 완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4⋅12H2O, NaH2PO4⋅2H2O, NaCl, trizma base, HCl 그리고 H2SO4, 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다.
그라비올라 잎은 인도네시아산을 2017년 5월 경동시장에서 구입하였다. 그라비올라 잎 200 g을 50% 에탄올 3 L에 24 h 동안 침적시켜 추출하였다.
라디칼 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical과 화학발광 실험에 사용한 luminol과 ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), H2O2, 그리고 세포보호 효과 측정에 사용한 heparin 및 rose-bengal은 Sigma-Aldrich (Korea)에서 구입하였다. 그 외 FeCl3⋅6H2O는 Junsei Chemical Co.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, kaempferol, rutin, nicotiflorin, kaempferol-3-O-neohesperidoside, p-coumaricacid는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
이번 실험에서 설정한 조건의 적합성을 확인하기 위해 강력한 1O2 소광 물질인 β-carotene로 예비실험을 통해 기존 문헌 값과 비교하였으며, 비교물질로 항산화제 (+)-α-tocopherol과 L-ascorbic acid를 사용하였다.
데이터처리
0min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균하였다.
본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고 통계자료의 값은 mean ± S.D.로 표시하였다.
통계적 유의성 검증은 Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., USA)프로그램을 이용하였으며, one-way ANOVA 검정을 적용하여 p < 0.05 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
TLC 전개용매는 ethyl acetate : chloroform : formic acid : distilled water = 8 : 1 : 1 : 1 (v/v) 및 hexane : ethyl acetate: acetic acid = 21 : 14 : 5 (v/v)를 사용하였다. TLC에서 성분 분석을 위해 표준물질의 Rf 값, 자외선 그리고 2-aminoethyl diphenylbroinate (NP) 발색법을 이용하였고 이미 보고된 분광학적 자료를 참고하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 및 0.
이와 같은 과정을 이용하여 DPBF의 4개의 농도에 대해 각각의 흡광도 감소를 측정하였다. 또한 시료에 대해서도 최소 4개의 농도에 대해 위와 같은 과정을 반복한 뒤, steady-state approximation, Stern-Volmer식을 이용하여 1O2 소광 속도 상수인 Kq값을 구할 수 있었다[25]. 공시험(blank)으로 DPBF를제외한 rose-bengal 1 mL, 메탄올 1 mL, 시료 1 mL를 시험관에 넣고 410 nm에서 흡광도를 측정하여 rose-bengal과 시료의 영향을 보정하였다.
성능/효과
1) 그라비올라 잎 추출물의 자유라디칼 소거 활성(FSC50) 측정 결과, 아글리콘 분획(18.0 µg/mL) > 에틸아세테이트 분획(29.8 µg/mL) > 50% 에탄올 추출물(45.6 µg/mL) 순서로 나타났으며, 비교물질인 (+)-⍺-tocopherol (9.0 µg/mL) 및 L-ascorbic acid (4.0 µg/mL)보다는 낮은 활성을 나타내었다.
2) 그라비올라 잎 추출물의 총 항산화능(OSC50)은 에틸아세테이트 분획(1.1 µg/mL) > 아글리콘 분획(2.8µg/mL) > 50% 에탄올 추출물(4.4 µg/mL) 순서로 나타났으며, 모두 비교물질 (+)-⍺-tocopherol (9.0 µg/mL)보다 활성이 뛰어났다.
3) 1O2 소광 속도 상수 실험에서 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획의Kq값은 각각 1.0 × 108M-1S-1, 1.1 × 108M-1S-1, 1.1 × 108M-1S-1로 계산되었다.
4) 1O2으로 유도된 적혈구 세포 파괴에 대한 세포보호 효과(τ50)는 그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물이 5-50 µg/mL에서 농도 의존적으로 용혈을 억제하였다.
5) TLC와 HPLC를 이용한 성분 분석을 통해 그라비올라 잎 추출물의 에틸아세테이트 분획에서는 rutin(quercetin-3-O-rutinoside), kaempferol-3-O-neohesperidoside, nicotiflorin (kaempferol-3-O-rutinoside), p-coumaricacid를 확인하였고 아글리콘 분획에서는 kaempferol을 확인하였다.
50 µg/mL 농도에서 항산화제 (+)-⍺-tocopherol과 비교한 결과, 50% 에탄올 추출물 및 (+)-⍺-tocopherol의 τ50값은 각각 37.7 min 및 38.7 min로 유사한 세포보호 효과를 나타내었다.
50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획에서 1O2을 더욱 효과적으로 소광시켰으며, 이들은 비교물질 (+)-α-tocopherol보다는 소광능이 떨어졌으나 L-ascorbic acid와 유사한 1O2 소광 효과를 보여주었다.
TLC 및 HPLC를 통하여 에틸아세테이트 분획의 주성분인 nicotiflorin 및 kaempferol-3-O-neohesperidoside 가 아글리콘 분획에서 가수분해에 의해 kaempferol로 성분 변화함을 확인하였으며, 배당체인 peak 3, 4번이 두드러지게 사라졌고, peak 5 (kaeampferol)의 함량이 증가함을 보였다. 한편 에틸아세테이트 분획의 rutin은 아글리콘 분획에서 quercetin으로 성분 변화가 일어나야한다.
이는 에틸아세테이트 분획에서 kaempferol 배당체가 대부분을 차지하고 있고, 아글리콘 분획 시 모두 kaempferol로 변화되기 때문에, 상대적으로 매우 극소량인 quercetin은 육안으로 관찰될 수 있는 범위에 들지 않는 것으로 사료된다. 결론적으로 그라비올라 잎 에틸아세테이트 분획보다 아글리콘 분획에서 당이 제거된 아글리콘 구조의 플라보노이드가 증가함을 확인할 수 있으며, 이러한성분 변화가 그들의 활성에 차이를 나타낼 것으로 사료된다.
그라비올라 잎 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 활성산소 소거 활성(OSC50)은 각각 4.4, 1.1 및 2.8 µg/mL로 나타났으며, 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid는 1.5 µg/mL, (+)-α-tocopherol은 6.3 µg/mL로 나타났다(Figure 3).
그라비올라 잎의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성(FSC50)은 각각 45.6, 29.8 및 18.0 µg/mL으로 나타났다(Figure 2).
76으로 표준물질과 비교하여 kaempferol로 추정되었다(Figure 5(B)). 또한 HPLC로 retention time을 표준물질과 비교하고, UV 스펙트럼 및 LC/ESI-MS을 통해 peak 5는 kaempferol임을 확인하였다(Table 4).
이상의 결과들로부터 그라비올라 잎 추출물은 항산화 활성이 뛰어남을 알 수 있었고, 분획을 함으로써 항산화 활성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 성분 분석을 통해 이러한 항산화 효과가 다양한 플라보노이드에 기인된 것으로 확인하였다. 다만, 그라비올라 잎 추출물 또는 분획을 화장품에 적용할 경우는 추출물 중에 클로로필 또는 포르피린류가 함유되지 않도록 제조해야 활성산소로부터 세포보호능을 향상시키는 기능성 소재로서 응용가능성이 있음을 시사하였다.
HPLC 상에서 주성분으로 확인된 네 개의 띠(AME-1, 2, 3, 8)를 중점적으로 분석하였다. 먼저 UV 스펙트럼 및 LC/ESI-MS를 통하여 분석한 결과로 peak 1은 p-coumaric acid, peak 2는 rutin, peak 3은 kaempferol-3-O-neohesperidoside, peak 4는 nicotiflorin로 추정되었다(Table 4). Peak 3과 4의 경우 UV 스펙트럼 및 LC/ESI-MS 결과가 같았으나 문헌을 통해 이성질체인 kaempferol-3-O-neohesperidoside와 nicotiflorin이라는 것을 알 수 있었다.
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 25.0 min으로 오차범위 ± 1.0min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
모든 추출물 및 분획은 (+)-α-tocopherol보다 높은 활성을 나타냈으며, 에틸아세테이트 분획은 강력한 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid보다도 큰 소거능을 보였다.
비교물질인 (+)-⍺-tocopherol (1.7× 108M-1S-1)보다는 낮은 활성을 나타내었지만, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획은 L-ascorbic acid (1.1 × 108M-1S-1)와 유사한 1O2 소광 효과를 나타내었다.
0 µg/mL으로 나타났다(Figure 2). 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성이 50% 에탄올 추출물의 활성보다 각각 34.6%, 60.5% 증가했으며, 특히 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성이 가장 높게 나타났다. 비교물질로 사용된 (+)-α-tocopherol (9.
이상의 결과들로부터 그라비올라 잎 추출물은 항산화 활성이 뛰어남을 알 수 있었고, 분획을 함으로써 항산화 활성에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한 성분 분석을 통해 이러한 항산화 효과가 다양한 플라보노이드에 기인된 것으로 확인하였다.
특히 가장 소거능이 큰 에틸아세테이트 분획은 강력한 수용성 항산화제 L-ascorbic acid(1.5 µg/mL)보다도 높은 활성을 나타내었다.
후속연구
또한 성분 분석을 통해 이러한 항산화 효과가 다양한 플라보노이드에 기인된 것으로 확인하였다. 다만, 그라비올라 잎 추출물 또는 분획을 화장품에 적용할 경우는 추출물 중에 클로로필 또는 포르피린류가 함유되지 않도록 제조해야 활성산소로부터 세포보호능을 향상시키는 기능성 소재로서 응용가능성이 있음을 시사하였다.
클로로필 및 포르피린 유도체들은 그 농도가 낮아도 1O2을 비롯한 활성산소를 생성시키는 광증감 작용을 일으킬 수 있다. 앞으로 추가 연구를 통해 클로로필 및 그 유도체를 완전히 제거한 후 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획을 대상으로 실험을 하면 농도 의존적으로 세포보호 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
세포외기질의 중요한 구조와 그들의 기능은 무엇인가?
지속적인 자외선 노출은 진피의 세포외기질(ECM)이라고 하는 결합 조직에서 가장 눈에 띄는 손상을 발생시킨다. 세포외기질의 가장 중요한 구조는 콜라젠, 엘라스틴 및 글리코사미노글리칸이며 이들은 피부의 탄력 및 수분을 유지하는 기능을 갖는다. 광노화 된 피부에서는 콜라젠이 손상되고 감소되며 비정상적인 엘라스틴 섬유와 글리코사미노글리칸이 축적되는 특징이 있다[1-4].
그라비올라는 무엇인가?
그라비올라(Annona muricata Linn.)는 남미⋅북미⋅필리핀⋅인도네시아 등 열대지방에서 재배되는 목련 목 포도나무과로, 잎은 타원형이며 7-20 cm의 길이, 2-5 cm의 폭을 갖는다. 주요 성분으로는 flavonoids, isoquinoline alkaloids, annonaceous acetogenins 등이 풍부하게 함유되어 있는 것으로 보고되고 있다[13-19].
ROS에 의한 세포 구성 요소의 변형은 어떤 문제를 일으키는가?
이들 ROS는 DNA, 지질 막 및 단백질과 같은 세포 구성 요소를 변형시킬 수 있다. 이는 비정상적인 세포 기능을 유발할 수 있으며 비정상적인 단백질 생성, 결합 조직의 분해 및 발암 등을 유발한다. 지속적인 자외선 노출은 진피의 세포외기질(ECM)이라고 하는 결합 조직에서 가장 눈에 띄는 손상을 발생시킨다.
참고문헌 (31)
A. Kammeyer and R. M. Luiten, Oxidation events and skin aging, Ageing Res. Rev., 21, 16 (2015).
H. J. Yang, E. H. Kim, and S. N. Park, Antioxidative activity and component analysis of Psidium guajava leaf extracts, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 34(3), 233 (2008).
H. U. Simon, A. Haj-Yehia, and F. Levi-Schaffer, Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction, Apoptosis, 5(5), 415 (2000).
S. N. Park, Protective effect of isoflavone, genistein from soybean on singlet oxygen induced photohemolysis of human erythrocytes, Korean J. Food Sci. Technol., 35(3), 510 (2003).
J. Yamakoshi, F. Otsuka, A. Sano, S. Tokutake, M. Saito, M. Kikuchi, and Y. Kubota, Lightening effect on ultraviolet-induced pigmentation of guinea pig skin by oral administration of a proanthocyanidin-rich extract from grape seeds, Pig. Cell Res., 16(6), 629 (2003).
Y. Gavamukulya, F. Abou-Elella, F. Wamunyokoli, and H. AEl-Shemy, Phytochemical screening, anti-oxidant activity and in vitro anticancer potential of ethanolic and water leaves extracts of Annona muricata (Graviola), Asian Pac. J. Trop. Med., 7S1, S355 (2014).
J. Paul, R. Gnanam, R. M. Jayadeepa, and L. Arul, Anti cancer activity on Graviola, an exciting medicinal plant extract vs various cancer cell lines and a detailed computational study on its potent anti-cancerous leads, Curr. Top. Med. Chem., 13(14), 1666 (2013).
S. Sun, J. Liu, H. Kadouh, X. Sun, and K. Zhou, Three new anti-proliferative Annonaceous acetogenins with mono-tetrahydrofuran ring from graviola fruit (Annona muricata), Bioorg. Med. Chem. Lett., 24(12), 2773 (2014).
T. D. Thang, D. N. Dai, T. M. Hoi, and I. A. Ogunwande, Study on the volatile oil contents of Annona glabra L., Annona squamosa L., Annona muricata L. and Annona reticulata L., from Vietnam, Nat. Prod. Res., 27(13), 1232 (2013).
M. Nawwar, N. Ayoub, S. Hussein, A. Hashim, R. El-Sharawy, K. Wende, M. Harms, and U. Lindequist, A flavonol triglycoside and investigation of the antioxidant and cell stimulating activities of Annona muricata Linn., Arch. Pharm. Res., 35(5), 761 (2012).
A. Matsushige, Y. Kotake, K. Matsunami, H. Otsuka, S. Ohta, and Y. Takeda, Annonamine, a new aporphine alkaloid from the leaves of Annona muricata, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 60(2), 257 (2012).
A. Matsushige, K. Matsunami, Y. Kotake, H. Otsuka, and S. Ohta, Three new megastigmanes from the leaves of Annona muricata, J. Nat. Med., 66(2), 284 (2012).
S. Adewole and J. Ojewole, Protective effects of Annona muricata Linn. (Annonaceae) leaf aqueous extract on serum lipid profiles and oxidative stress in hepatocytes of streptozotocin-treated diabetic rats, Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med., 6(1), 30 (2009).
G. A. Asare, D. Afriyie, R. A. Ngala, H. Abutiate, D. Doku, S. A. Mahmood, and H. Rahman, Antiproliferative activity of aqueous leaf extract of Annona muricata L. on the prostate, BPH-1 cells, and some target genes, Integr. Cancer Ther., 14(1), 65 (2015).
I. O. Ishola, O. Awodele, A. M. Olusayero, and C. O. Ochieng, Mechanisms of analgesic and anti-inflammatory properties of Annona muricata Linn. (Annonaceae) fruit extract in rodents, J. Med. Food, 17(12), 1375 (2014).
S. Z. Moghadamtousi, H. Karimian, E. Rouhollahi, M. Paydar, M. Fadaeinasab, and H. A. Kadir, Annona muricata leaves induce G1 cell cycle arrest and apoptosis through mitochondria-mediated pathway in human HCT-116 and HT-29 colon cancer cells, J. Ethnopharmacol., 156, 277 (2014).
M. P. Torres, S. Rachagani, V. Purohit, P. Pandey, S. Joshi, E. D. Moore, S. L. Johansson, P. K. Singh, A. K. Ganti, and S. K. Batra, Graviola: a novel promising natural-derived drug that inhibits tumorigenicity and metastasis of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo through altering cell metabolism, Cancer Lett., 323(1), 29 (2012).
S. N. Park, Quenching effect of carotenoids on singlet oxygen, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 10(1), 75-89 (1984).
K. M. Kim, A. R. Kim, A. Y. Kim, J. H. Ha, S. H. Xuan, Y. J. Jeong, Y. M. Park, H. J. Jeong, I. G. Hong, and S. N. Park, Antioxidative and cellular protective effects of Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) extracts against oxidative stress, Kor. J. Pharmacogn., 48(2), 125 (2017).
A. Y. Kim, J. H. Ha, A. R. Kim, H. J. Jeong, K. M. Kim, and S. N. Park, Cellular protective effect and active component analysis of Lavender (Lavandula angustifolia) extract/fraction, Appl. Chem. Eng., 28(4), 479 (2017).
S. H. Xuan, G. Y. Kim, J. Y. Yu, J. W. Kim, Y. R. Yang, Y. H. Jeon, Y. J. Jeong, A. R. Kim, and S. N. Park, Antioxidant and cellular protective effects against oxidative stress of Calendula officinalis flowers extracts in human skin cells, Appl. Chem. Eng., 27(6), 620 (2016).
R. J. Grayer, G. C. Kite, M. Abou-Zaid, and L. J. Archer, The application of atmospheric pressure chemical ionisation liquid chromatography-mass spectrometry in the chemotaxonomic study of flavonoids: characterisation of flavonoids from Ocimum gratissimum var. gratissimum, Phytochem. Anal., 11, 257 (2000).
A. Plazonic, F. Bucar, Z. Males, A. Mornar, B. Nigovic, and N. Kujundzic, Identification and quantification of flavonoids and phenolic acids in Burr Parsley (Caucalis platycarpos L.), using high-performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry, Molecules, 14(7), 2466 (2009).
T. Iwashina and G. Kokubugata, Flavone and flavonol glycosides from the leaves of Triumfetta procumbens in Ryukyu islands, Bull. Natl. Mus. Nat. Sci., 38(2), 63 (2012).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.