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문제 정의
- 즉, 산도는 증가하 게 되고 pH는 감소하는 산성환경이 되어 이러한 환경에 견디지 못하는 유해균들은 그 수가 감소하게 되고 산성에서 생육이 잘 되는 유익균들은 더욱 증식하게 된다18) .그 러므로 유산균이 감소되어 젖산을 생성하지 못하게 되면 pH는 증가하게 되고, 산도는 감소하게 될 것이므로 유통 되는 제품의 유산균수와 함께 본 연구에서 산도와 pH를 조사하게 되었다.
- 유산균에 대한 생체시험에 관한 많은 논문들은 있지만 유통되어 판매되고 있는 제품의 품질에 대한 연구는 상대 적으로 미미한 실정이며, 2016년 본 경기도보건환경연구 원에서 실시한 유통 건강기능식품 중 프로바이오틱스 제 품 124건의 검사결과 3건이 부적합으로 판정되어 유통 제 품에 대한 안전성 확립이 필요할 것으로 보여진다. 따라 서본연구에서는경기도내 유통 중인 유산균 함유 제품 중 건강기능식품과 쵸콜릿류, 음료류, 과자류 등 가공식품 의 유산균수를 조사하고, 보존온도에 따른 균수 변화를 조 사하여 올바른 보존방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 의심되는 집락 의 경우 다시 TSA 한천배지에 순수배양한 뒤, 그람염색을 실시하고 VITEC2와 MALDI-TOF MS를 이용하여 균을 동정하였다. VITEC2는 그람양성균의 경우 GP Card, Lactobacillus속의 경우 CBC Card, Bifidobacterium속의 경 우 ANC Card를 사용하여 확인 동정하였다.
- pH 및 산도 측정은 건강기능식품의 프로바이오틱스 제품에 대하여 시험을 실시하였다. pH는 pH meter (S220, Mettler-Toledo, Greifensee, Switzerland)를 이용하여 측정 전에 pH 4.
- 이 시험용액 1 mL에 희석액으로 멸균생리식염수 9 mL를 혼합하여 10배 희석법으로 희석하였다. 각 희석액 을 멸균된 유산균 배지 BL 한천배지 또는 BCP첨가 평판 측정용 배지 및 TOS-MUP 배지에 2매씩 접종하여, 37 C incubator (IN 450, Memmert, Germany)에서 48~72시간 호기 또는 혐기 배양 후에 형성된 colony수를 계측하고, 여기에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 CFU (colony forming unit)로 표시하였다. 지방분이 많은 시료의 경우는 polysorbate 80 (MD21152, Becton Dickinson and Company Sparks, USA)과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하여 실험하였다.
- 본 연구는 2017년 국내에서 유통되는 유산균을 함유한 건강기능식품과 가공식품 120건에 대하여 프로바이오틱스 함량, pH와 산도를 분석하였다. 또한, 건강기능식품 중 프로바이오틱스 5개 제품에 대한 보존방법에 따른 변화를 조사하였다. 프로바이오틱스 제품 85건 중 2건이 표시량 이하였고, 가공식품 35건은 모두 적합이었다.
- 본 연구는 2017년 국내에서 유통되는 유산균을 함유한 건강기능식품과 가공식품 120건에 대하여 프로바이오틱스 함량, pH와 산도를 분석하였다. 또한, 건강기능식품 중 프로바이오틱스 5개 제품에 대한 보존방법에 따른 변화를 조사하였다.
- 유산간균 및 구균수 측정을 위한 Bromo cresol purple (BCP) 첨가 평판측정용 배지(63003, Eiken Chemical Co., Tokyo, Japan)는 24.6 g에 증류수 1,000 mL을 녹여 pH 6.8 ± 0.2으로 조정한 후 121 oC에서 15분간 멸균하여 사용 하였고, TOS-MUP 배지(MB-TO892, MB Cell, Los Angeles, USA)는 62.5 g에 증류수를 990 mL에 녹이고 pH 6.3 ± 0.2 로조정한후115C에서15분간멸균하여50oC정도로식 힌 다음 MUP (mupirocin) supplement (MB-M3006, MB Cell, Los Angeles, USA) 2 vials를 위의 배지에 첨가하여 사용하였다.
- 유산균수 측정은 유통 건강기능식품의 프로바이오틱스 제품과 가공식품에 대하여 시험을 실시하였다.
- 유산균수 측정을 위한 BL (Blood Liver) agar는 BL 한 천배지(MB-B1380, MB Cell, Los Angeles, USA) 60.23 g 에 증류수 1,000mL에 녹이고 pH 7.2로 조정한 후 121 C 에서 15분간 멸균하여, 50oC로 냉각시킨 후 말의 탈섬유소혈액(Horse Blood Defibrinated, MB-H18, MB Cell, Los Angeles, USA)을 5% 되도록 첨가하여 사용하였다.
- 시료가 접종된 BCP 첨가 평판측정용배지의 경우, 37o C에서 72시간 호기 또는 혐기 배양하였고, BL 한천배지와 TOS-MUP 배지의 경 우, 37o C에서 48~72시간 혐기 배양하였다. 의심되는 집락 의 경우 다시 TSA 한천배지에 순수배양한 뒤, 그람염색을 실시하고 VITEC2와 MALDI-TOF MS를 이용하여 균을 동정하였다. VITEC2는 그람양성균의 경우 GP Card, Lactobacillus속의 경우 CBC Card, Bifidobacterium속의 경 우 ANC Card를 사용하여 확인 동정하였다.
- 각 희석액 을 멸균된 유산균 배지 BL 한천배지 또는 BCP첨가 평판 측정용 배지 및 TOS-MUP 배지에 2매씩 접종하여, 37 C incubator (IN 450, Memmert, Germany)에서 48~72시간 호기 또는 혐기 배양 후에 형성된 colony수를 계측하고, 여기에 희석배수를 곱하여 시료 mL당 CFU (colony forming unit)로 표시하였다. 지방분이 많은 시료의 경우는 polysorbate 80 (MD21152, Becton Dickinson and Company Sparks, USA)과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가하여 실험하였다. 유산균수 측정은 모두 3번 반복 측정하여 나타내었다.
- 프로바이오틱스 5개의 제품을 온도별(−20 oC, 4oC, 20o C 와 40 oC)로 각각 보관하면서, 구매 후 1, 3, 6개월 경과 후 의 프로바이오틱스수, pH와 산도를 측정하였다.
- 혐기성 배양을 위해 AnaeroGen Jar (BD-Gas Pak Anaerobe container system, USA, Oxoid Gas-Pak, UK)와 AnaeroGen (BD BBL, USA, Oxoid, UK)과 함께 Dry Anaerobic Indicator strips (BD BBLTM , USA)을 사용하였 으며, 의심 집락에 대해서는 VITEC2 Compact (Biomerieux, Hazelwood, MO, USA)와 MALDI-TOF MS (Bruker Matrix HCCA, USA)를 사용하여 확인하였다.
대상 데이터
- 보존방법에 따른 변화 연구를 위한 시료는 프로바이오틱스 제품 5건(Table 3)을 구매하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 제품은 2017년 국내 유통 건강기능식품 중 프로바이오틱스 제품 85건(Table 1)과 유산균 함유 가공식품 35건(Table 2)을 사용하였다.
- 분석저울(Practum513, Satorius, Regensburg, Germany)과 자동배지분주 시스템 (Mediajet 360, IBS, Zurich, Switzerland)를 사용하여 배지 를 제조하였으며, 저장온도 유지를 위한 장비로 냉장냉동 고(CA-D17DZ, LG, Korea)와 Incubator (JP/MIR-154, Sanyo, Japan)를 사용하였다.
- 시료 희석에 사용된 멸균 생리식염수는 상용 9 mL Saline (BFD009, BNF Korea, Gyeonggi, Korea)과 Saline Tablets (BR0053G, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) 사용 하여 제조하였다.
- 유산균 대조균주로서 Lactobacillus acidophilus (ATCC- 4356L), Lactobacillus casei (ATCC393L), Lactobacillus plantarum (ATCC8014L), Lactobacillus fermentum (ATCC- 9338), Lactobacillus rhamnosus (ATCC7469), Enterococcus faecalis (ATCC51575), Enterococcus faecium (ATCC700- 221), Bifidobacterium bifidum (ATCC11863), Bifidobacterum animalis subsp lactis (ATCC25527), Bifidobaterium breve (ATCC 15700, Microbiologics, USA)를 사용하였다.
데이터처리
- a,b: Different superscripts in the same column indicate significant differences between groups at p < 0.05 by Duncan’s multiple comparison test.
- 각 실험군 간의 유의성을 검증하기 위하여 ANOVA 분석을 하 였으며, 사후검증으로 Duncan’s multiple range test에 의해 5% 유의수준에서 검증하였다.
- 모든 실험은 3회 반복 측정하였으며, 본 연구에서 얻어진 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software를 이용하여 분산분석을 실시하였다. 각 실험군 간의 유의성을 검증하기 위하여 ANOVA 분석을 하 였으며, 사후검증으로 Duncan’s multiple range test에 의해 5% 유의수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 산도는 건강기능식품공전 시험법 2-4-2과 AOAC법에 준 하여시료5g에끓여서식힌증류수50mL를가하여페 놀프탈레인 시액 0.5mL를 가한 후 이를 0.1 N NaOH Solution (Wako, Japan)으로 pH 8.3이 될 때까지 적정하였다. pH, 산도는 모두 3번 반복 측정한 평균값으로 나타내었다.
성능/효과
- 6과 같다. 가공식품은 빙과류와 음료류를 제외하고 모두 실온으로 유통되고 있 었으며, 가공식품 제조에 사용되는 유산균종은 Lactobacillus plantarum (64.7%), S. thermophilus (64.7%) 2종을 가장 많이 사용하고 있었다.
- 따라서 가장 낮은 감소율은 4 C에서 나타났고, 40C에서가장높은감소율을보여,보관온도집단간유 의한 차이를 나타내었다(p < 0.05).
- 또 한, 프로바이오틱스수 평균은 수입제품 3.3 × 1010 CFU/g(중 간값 2.3 × 10 CFU/g), 국내제품 5.3 × 10 9CFU/g(중간값 1.1 × 10 CFU/g)으로 수입제품이 국내제품에 비해 g당 프로바이오틱스 함량이 높게 나타났다.
- 이러한 결과는 4 oC는 초콜릿에 함유된 프로바이오틱스 생존 능력을 유지하는데 적합하다는 보고 와 온도가 높을수록 유산균의 생균수는 감소하였다는보고와유사하였다.또한,5개제품중3 제품에서 보존기간 1개월에서 3개월 경과 후 40o C에서 70%이상 급격한 균수 감소를 관찰할 수 있었다.
- 유산균수와 산도는 보존기간이 지남에 따라 낮아지고, pH 는 보존기간이 지남에 따라 높아지는 경향을 관찰하였다. 또한, pH는 유산균수가 감소할수록 증가하였으며, 산도는 유산균수가 감소할수록 감소하였다.
- 이러한 결과는 4 oC는 초콜릿에 함유된 프로바이오틱스 생존 능력을 유지하는데 적합하다는 보고 와 온도가 높을수록 유산균의 생균수는 감소하였다는보고와유사하였다.또한,5개제품중3 제품에서 보존기간 1개월에서 3개월 경과 후 40o C에서 70%이상 급격한 균수 감소를 관찰할 수 있었다.
- 반면, 유통되는 프로바이오틱스 제품의 표시량에 대한 프로바이오틱스 함량은 평균적으로 국내 제품이 10배, 수 입 제품이 2배로 국내 제품이 수입제품에 비해 표시함량 대비 프로바이오틱스 함량은 높아 국내·수입제품의 t-검 정 결과 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p < 0.05).
- 보존기간 1개월에서 6개월 후 유산균수 감소율(Fig. 8) 은 평균 59%이었고, 온도변화에 따른 감소율은 4oC에서 41%, 20 C에서 54%, −20o C에서 55%, 40 oC에서 84%로 나 타났다.
- 요구르트 함유 제품은 평균 9.0 × 105 CFU/g이었으며, 열처리유산균 함유 제품과 살균 처리된 제품은 모두 유산균이 검출되지 않았다.
- 7에 나타내었다. 유산균수와 산도는 보존기간이 지남에 따라 낮아지고, pH 는 보존기간이 지남에 따라 높아지는 경향을 관찰하였다. 또한, pH는 유산균수가 감소할수록 증가하였으며, 산도는 유산균수가 감소할수록 감소하였다.
- 유산균이 함유된 가공식품 35건 중 유산균 함량이 표기 되어 있는 가공식품 17건의 유산균수 평균은 3.2×108 CFU/g로 모두 표시량 이상으로 나타났다.
- 유산균함량 표기가 없는 유산균 함유(열처리 유산균이 나 요구르트 함유) 가공식품 18건의 유산균수 평균은 2.0 × 106 CFU/g으로 나타났다.
- 전체 제품 평균 pH는 5.35 (2.73~9.01) 수준을 보였으며, 그 중 포제품은 5.16 (2.73~7.31), 캡슐제품은 5.73 (3.92~9.01), 정제품은 5.28 (3.78~7.93) 수준을 나타내었다. 전체 제품 평균 산도는 1.
- 프로바이오틱스 5 제품의 보존온도(−20oC, 4 oC, 20o C, 40o C)와 보존기간(1, 3, 6개월) 경과에 따른 프로바이오틱스 함량 변화를 관찰 한 결과, 보존기간 1개월에서 6개월 후 프로바이오틱스수 감소율은 평균 59%이었고, 4oC에서 가장 낮은 감소율과 40oC에서 가장 높은 감소율을 나타내었다.
- 또한, 건강기능식품 중 프로바이오틱스 5개 제품에 대한 보존방법에 따른 변화를 조사하였다. 프로바이오틱스 제품 85건 중 2건이 표시량 이하였고, 가공식품 35건은 모두 적합이었다. 프로바이오틱스 제품의 프로바이오틱스수, pH, 산도 평균은 각각 1.
- 프로바이오틱스 제품에 사용된 유산균종의 조사결과, Lactobacillus acidophilus (81.2%), Bifidobacterium animalis subsp lactis (77.6%), Lactobacillus rhamnosus (75.3%), Bifidobacterium bifidum (72.9%), Lactobacillus plantarum (68.2%), Bifidobacterium longum (65.9%) 순으로 사용하고 있었다.
- 프로바이오틱스 제품의 포, 캡슐, 정제의 프로바이오틱스수는 포제품에서 평균 3.3 × 109 CFU/g(중간값 1.0 × 109 CFU/g, 6.7 × 107 CFU/g~2.5 × 1010 CFU/g)이 함유되었고, 캡슐제품은 평균 3.0 × 1010 CFU/g(중간값 2.2 × 1010 CFU/ g, 1.8 × 107 CFU/g~1.0 × 1011 CFU/g), 정제품은 평균 5.1 ×109 CFU/g(중간값 4.6 × 109 CFU/g, 1.3 × 108 CFU/g~1.4 ×1010 CFU/g)로 함유되어, 캡슐제품이 프로바이오틱스 함량이 높아 통계적으로 유의한 차이를 보였다(p < 0.05).
- 프로바이오틱스 제품의 프로바이오틱스수, pH, 산도 평균은 각각 1.2 × 1010 CFU/g (표시량: 3.4 × 109 CFU/g), 5.35, 1.29%이 었으며,가공식품중유산균함유량표시식품17건의유산균수 평균은 5.8 × 108 CFU/g이었다.
- 한편, 프로바이오틱스 제품의 유산균종별 검체 빈도는 7종이 21건(24.7%), 19종이 10건(11.8%), 6종이 10건 (11.8%)이었으며, 평균 유산균 함유 균종수는 9종이었다.
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