[논문]LPS로 자극된 미세아교세포에서 풀무치 에탄올 추출물의 신경염증 억제 효능

이화정; 서민철; 이준하; 김인우; 김선영; 황재삼; 김미애

doi:10.5352/jls.2018.28.11.1332

LPS로 자극된 미세아교세포에서 풀무치 에탄올 추출물의 신경염증 억제 효능
Anti-neuroinflammatory Effects of a Locusta migratoria Ethanol Extract in LPS-stimulated BV-2 Microglia 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.11 = no.223, 2018년, pp.1332 - 1338

이화정 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 서민철 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 이준하 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 김인우 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 김선영 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 황재삼 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부) , 김미애 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부)

초록
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뇌신경 질환의 주요 원인이 되는 것으로 알려진 미세아교세포의 과도한 활성화에 의한 신경염증반응에서 풀무치 에탄올 추출물이 미세아교세포의 염증 반응에 미치는 영향을 검토하였다. 미세아교세포의 활성화를 유도하기 위해 LPS를 사용하였으며, LPS 처리에 의해 신경염증반응의 지표인 NO의 생성량과 이들을 조절하는 iNOS, COX-2의 발현이 증가됨을 확인 할 수 있었다. 그러나 풀무치 에탄올 추출물을 1시간 전처리 한 후 LPS를 처리한 경우 추출물의 농도에 의존적으로 이들의 발현량이 현저히 감소되는 것을 확인 하였다. 또한 LPS 처리로 인해 분비되는 염증성 cytokine들의 생성량도 풀무치 에탄올 추출물에 의해 현저히 억제 됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구의 결과는 미세아교세포의 과도한 활성화로 인해 발생되는 뇌 신경질환의 치료 소재로서 풀무치 에탄올 추출물의 활성 가능성을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Activated microglia, induced by various pathogens, protect neurons and maintain homeostasis of the central nervous system (CNS). However, severe activation causes neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease because of the secretion of various neurotoxic molecules, such as nitric oxide (NO), prostaglandin (PG), and pro-inflammatory cytokines. Because chronic microglial activation endangers neuronal survival, negative regulators of microglial activation have been identified as potential therapeutic candidates for treatment of many neurological diseases. One potential source of these regulators is Locusta migratoria, a grasshopper of the Acrididae, usually 4-6 cm in size, belonging to the family of large insects in Acrididae. This grasshopper is an edible insect resource that can be consumed by humans as protein source or used for animal feed. The aim of the present study was to examine the inhibitory effects of a L. migratoria ethanol extract (LME) on the production of inflammatory mediators in LPS-stimulated BV-2 microglia cells. The extract significantly inhibited the NO, iNOS, COX-2, and pro-inflammatory cytokine ($TNF-{\alpha}$, IL-6 and $IL-1{\beta}$) levels in BV-2 microglia cell. Because the inhibition of microglial activation may be an effective solution for treating brain disorders like Alzheimer's and Parkinson's diseases, these results suggest that LME may be a potential therapeutic agent for the treatment of brain disorders induced by neuroinflammation.

주제어

표/그림 (6)

그림 Fig. 1. LME on the cell viability in BV-2 microglia.
표 Table 1. Sequences of primes used for RT-PCR
그림 Fig. 2. Inhibitory effect of LME extract on the production of nitric oxide in BV-2 microglia.
그림 Fig. 3. Inhibitory effect of LME on iNos and Cox-2 expression in LPS stimulated BV-2 microglia.
그림 Fig. 4. Inhibitory effect of LME on the protein levels of iNOS and COX-2 in LPS stimulated BV-2 microglia.
그림 Fig. 5. Inhibitory effect of LME on the production of proinflammatory cytokine in LPS stimulated BV-2 microglia.

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 풀무치는 농작물 피해를 일으키는 메뚜기과 곤충에 해당되어 해충으로 언급되고 있기 때문에 [7, 27], 대부분의 집단형 풀무치에 대한 방제[12]연구가 대부분이며 식․약용소재로써 이용하기 위한 연구는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 풀무치의 신경염증 억제 효능을 알아보기 위하여 중추신경계의 면역반응을 담당하는 미세아교세포인 BV-2 세포를 이용하여 풀무치 에탄올 추출물이 신경염증에 미치는 효능 및 조절기전을 조사하였다.

제안 방법

TNFα는 LPS에 의해 활성화된 면역세포로부터 다량 분비되어 폐혈증이나 류마티스 관절염과 같은 염증질환 발달에 매우 중요한 역할을 하며, 암, 악액질(cachexia), 당뇨, 비만 등 대사성질환에서 인슐린 저항성을 유도하는 것으로 알려져 있다[4, 24]. 따라서 본 실험에서는 풀무치 에탄올 추출물이 염증성 cytokine 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 풀무치 추출물을 전처리한 BV-2 세포에 LPS로 염증 반응을 유도 한 후 염증성 cytokine의 발현을 단백질 및 유전자 발현 수준에서 관찰하였다(Fig. 5). 먼저 염증성 cytokine인 IL-6와 TNF-α의 단백질 수준에서의 발현 변화를 확인하기 위하여 IL-6와 TNF-α ELISA kit를 이용하여 확인 한 결과 LPS단독 처리군에서 무처리 군에 비해 각각 800배와 2.
정상적인 NO는 신경 보호나 뇌 발달에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나[15], LPS나 interferon-gamma (IFN-γ), β-amyloid 등으로 인해 활성화된 미세아교세포로부터 과도하게 생성될 경우 중추신경계에서 심각한 세포독성과 신경염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다[5]. 따라서 본 연구에서는 풀무치 에탄올 추출물의 신경염증 억제효능을 알아보기 위해 BV-2 세포에 LPS (100 ng/ml)를 처리하여 과도한 신경염증을 유도 시킨 후 염증반응의 대표적인 지표물질 NO의 생성량을 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 BV-2 세포에 LPS를 단독 처리한 실험군의 경우 대조군에 비해 약 12배정도 NO생성량이 증가되었으나, 풀무치 에탄올 추출물 농도별(100~2,000 μg/ml) 로 처리한 실험군에서는 풀무치 추출물농도에 의존적으로 NO분비량이 유의적으로 감소됨을 확인 할 수 있었다.
풀무치 에탄올 추출물이 LPS에 의해 활성화된 BV-2 세포로부터 생성되는 NO의 합성효소인 iNos의 유전자 발현과 PGE2의 합성효소인 Cox-2 유전자 발현을 억제시키는 이상의 결과에서 우리는 풀무치 에탄올 추출물이 활성화된 BV-2 세포에서 iNOS와 COX-2 단백질 발현 또한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 단백질 발현 양상을 Western blot으로 분석 하였다(Fig. 4). 그 결과 Fig.

대상 데이터

풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육한 해남 6세대를 사용하였다. 실험 곤충은 밀을 먹이로 사용하였으며, 30℃, 65% R.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타냈다. 실험결과의 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성 검증을 실시하였고 유의성은 p<0.05로 하였다.

성능/효과

3). BV-2세포에 LPS를 단독으로 처리하여 염증반응을 유도 시켰을 때 대조군에 비해 각각 약4-5배 이상 증가하였으며, 풀무치 에탄올 추출물을 농도별(100~2,000 μg/ml)로 함께 처리한 경우 추출물의 처리 농도에 의존적으로 iNos와 Cox-2 유전자의 발현이 현저히 억제됨을 확인 할 수 있었다.
4에서 보는 바와 같이 LPS처리에 의해 증가된 iNOS와 COX-2단백질의 발현은 풀무치 에탄올 추출물에 의해 농도 의존적으로 감소하는 양상을 나타내었다. 결론적으로 풀무치 에탄올 추출물은 iNOS, COX-2 유전자와 단백질 발현의 억제를 통해 NO의 생성 및 신경염증 억제 활성을 가지는 것으로 사료된다.
2). 그 결과 BV-2 세포에 LPS를 단독 처리한 실험군의 경우 대조군에 비해 약 12배정도 NO생성량이 증가되었으나, 풀무치 에탄올 추출물 농도별(100~2,000 μg/ml) 로 처리한 실험군에서는 풀무치 추출물농도에 의존적으로 NO분비량이 유의적으로 감소됨을 확인 할 수 있었다. 특히 풀무치 추출물의 최고농도인 2,000 μg/ml의 농도에서는 LPS만 단독으로 처리한 실험군에 비해 약 90% 이상의 감소 효과를 관찰 할 수 있었다.

후속연구

BV-2 세포에 IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β가 LPS만 단독으로 처리한 경우 대조군에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하였으며, 풀무치 에탄올 추출물에 의해 농도 의존적으로 유전자의 발현이 억제 되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 염증매개인자인 염증성 사이토카인 생성을 현저히 억제 시킴으로써 신경염증억제 효능을 갖고 있을 뿐만 아니라 새로운 천연물 유래 신경염증 억제 물질로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	미세아교세포의 과도한 활성화는 어떤 영향을 미치는가?	미세아교세포(microglia)는 전체 뇌 세포의 12%를 차지하는 중추신경계(central nervous system; CNS)의 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 외부에서 유입되거나 내부에서 발생하는 독소들이 존재하게 되면 이들 독소로부터 신경세포를 보호하기 위해 활성화 된다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 역할을 가지고 있으나, 과도한 활성화는 iNOS의 발현 증가를 통한 Nitric Oxide 합성과 COX-2에 의한 Prostaglandin, TNF-α 등의 합성 증가로 인해 신경세포에 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 된다. 또 사멸중인 신경세포가 방출하는 물질들이 미세아교세포의 활성을 다시 유발하게 되므로, 신경퇴행은 지속적인 악순환에 빠지게 된다[8].
	과량의 Nitric oxide는 어떤 문제점을 일으키는가?	활성 산소종의 일종인 Nitric oxide (NO)는 무기 저분자 라디칼로써 신경전달 기능, 혈액응고 및 혈압 조절 기능, 암세포에 대항하는 면역기능 등의 역할을 하며 대식세포 및 간세포에서 NO합성 경로인 nitric oxide synthase (NOS)를 통해 L-arginine으로부터 합성된다[13]. 그러나 면역반응에서 숙주의 방어기전으로 만들어지는 과량의 NO는 오히려 자가 면역질환이나 만성염증의 원인이 되며[20], cyclooxygenase (COX)의 활성을 촉진시켜[21] prostaglandin (PG) 등의 생합성을 유도하여 염증반응을 심화시키는 것으로 보고되어있다[14]. 따라서 미세아교세포의 염증반응 관련 유전자의 발굴이나 이들의 조절을 통한 퇴행성 뇌질환 치료에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있으며[6, 8] 염증반응이 진행되는 동안 유의적으로 증가하는 NO의 분비를 효과적으로 억제할 수 있는 억제제 개발은 각종 뇌질환을 치료하는 유용한 치료방법으로 여겨지고 있다[9, 11].
	미세아교세포의 활성화의 역할은?	미세아교세포(microglia)는 전체 뇌 세포의 12%를 차지하는 중추신경계(central nervous system; CNS)의 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 외부에서 유입되거나 내부에서 발생하는 독소들이 존재하게 되면 이들 독소로부터 신경세포를 보호하기 위해 활성화 된다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 역할을 가지고 있으나, 과도한 활성화는 iNOS의 발현 증가를 통한 Nitric Oxide 합성과 COX-2에 의한 Prostaglandin, TNF-α 등의 합성 증가로 인해 신경세포에 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 된다. 또 사멸중인 신경세포가 방출하는 물질들이 미세아교세포의 활성을 다시 유발하게 되므로, 신경퇴행은 지속적인 악순환에 빠지게 된다[8].

참고문헌 (29)

Angus, J. A. and Cocks, T. M. 1989. Endothelium-derived reaxing factor. Pharmacol. Ther. 41, 303-352.
Benveniste, E. N. 1997. Immunology of the nervous system. pp.419-459. Oxford University press, New York.
Benveniste, E. N. 1998. Cytokine actions in the central nervous system. Cytokine Growth Factor Rev. 9, 259-275.
Beutler, B. and Cerami, A. 1988. The history, properties, and biological effects of cachectin. Biochemistry 27, 7575-7582.
Boje, K. M. and Arora, P. K. 1992. Microglia-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxide mediate neuronal cell death. Brain Res. 587, 250-256.
Cross, A. K. and Woodroofd, M. N. 2001. Immunoregulation of microglial functional properties. Microsc. Res. Tech. 54, 10-17.

상세보기
Farrow, R. A. and Colless, D. H. 1980. Analysis of the interrelationships of geographical races of Locusta migratoria (Linnaeus) (Orthoptera: Acrididae), by numerical taxonomy, with special reference to sub-speciation, in the tropics and affinities of the Australian race. Acrida 9, 77-99.
Gonzalez-Scarano, F. and Baltuch, G. 1999. Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases. Annu. Rev. Neurosci. 22, 219-240.

상세보기
Hanada, T. and Yoshimura, A. 2002. Regulation of cytokine signaling and inflammation. Cytokine growth Factor. Rev. 3, 413-421.
Hobbs, A., Higgs, A. and Moncada, S. 1999. Inhibition of nitric oxide synthase as a potential therapeutic target. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39, 191-220.

상세보기
Ignarro, L. J., Buga, G. M., Wood, K. S., Byrns, R. E. and Chaudhuri, G. 1987. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9265-9269.

상세보기
Lee, M. R., Kim, J. C., Lee, S. J., Kim, S. H., Lee, S. J., Park, S. E., Lee, W. H. and Kim, J. S. 2017. Assessment of Physiological Activity of Entomopathogenic Fungi with Insecticidal Activity Against Locusts. Kor. J. Appl. Entomol. 56, 301-308.
Knott, C., Shern, G. and Wilkin, G. P. 2000. Inflammatory regulators in Parkinson's disease: iNOS, lipocortin-1, and cyflooxygenase-1 and -2. Mol. Cell. Neurosci. 16, 724-739.
Mason, R. P. and Cockcroft, J. R. 2006. Targeting nitric oxide with drug therapy. J. Clin. Hypertens (Greenwich) 8, 40-52.
McCartney-Francis, N., Allen, J. B., Mizel, D. E., Albina, J. E., Xie, Q. W., Nathan, C. F. and Wahl, S. M. 1993. Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase. J. Exp. Med. 178, 749-754.

상세보기
Okamoto, S. and Lipton, S. A. 2015. S-nitrosylation in neurogenesis and neuro-nal development. Biochim. Biophys. Acta. 1850, 1588-1593.
Park, D. S., Yoon, M. Z., Xu, H., Yu, J. R. and Kom, T. S. 2004. Screening of anti-atherogenic substances from insect resources. Kor. J. Phar-macogn. 35, 233-238.
Park, J. H., Kim, S. H. and Lee, S. R. 2017. Inhibitory effect of Petalonia binghamiae on neuroinflammation in LPS-stimulated microglial cells. J. Nutr. Health. 50, 25-31.
Park, J. Y., Heo, S. M., An, E. Y., Han, J. S., Hwang, S. W. and Kang, C. Y. 2005. High throughput-compatible screening of anti-oxida-tive substances by insect extract library. Kor. J. Food Preserv. 12, 482-488.
Perry, V. H. and Gordon, S. 1997. Immunology of the nervous system. pp.155-172. Oxford University press, New York.
Pfeilschifter, J., Eberhardt, W., Hummel, R., Kunz, D., Muhl, H., Nitsch, D., Pluss, C. and Walker, G. 1996. Therapeutic strategies for the inhibition of inducible nitric oxide synthase-potential for a novel class of anti-inflammatory agents. Cell Biol. Int. 20, 51-58.

상세보기
Salvemini, D., Misko, T. P., Masferrer, J. L., Seibert, K., Cur-rie, M. G. and Needleman, P. 1993. Nitric oxide activates cyclooxygenase enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 7240-7244.

상세보기
Scapagnini, G., Foresti, R., Calabrese, V., Giuffrida Stella, A. M., Green, C. J. and Motterlini, R. 2002. Caffeic acid phenethyl ester and curcumin: a novel class of heme oxygenase-1 inducers. Mol. Pharmacol. 3, 554-561.
Seo, M. C., Lee, J. H., Baek, M. H., Kim, M. A., Ahn, M. Y., Kim, S. H., Yun, E. Y. and Hwang, J. S. 2017. A novel role for earthworm peptide Lumbricusin as a regelator of neurinfammation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 490, 1004-1010.
Son, E. H., Lee, J. W. and Yoo, J. Y. 2004. Brain disease treatment. KISTI. 11, 1-39.
Takeuchi, T. 2007. Clinical development and future perspective of biological agents. Nippon Rinsho Review 65, 1185-1188.
Uvarov, B. P. 1977. Grasshoppers and Locusts. pp.475. Centre for Overseas Pest Research, London.
Tassoni, D., Kaur, G., Weisinger, R. S. and Sinclair, A. J. 2008. The role of eicosanoids in the brain. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 17, 220-228.

상세보기
Yoon, H. J., Lee Y, B., Lee, K. Y., Kim. S. Y. and Jeong, J. K. 2016. Artificial breeding method of Locust migratoria. Korea patent. 10-2016-0071011.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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