[논문]RANKL 유도된 파골세포 분화에 대한 풀무치 에탄올 추출물의 분화 억제 효과

백민희; 서민철; 이준하; 이화정; 김인우; 김선영; 김미애; 황재삼

doi:10.5352/jls.2019.29.10.1104

RANKL 유도된 파골세포 분화에 대한 풀무치 에탄올 추출물의 분화 억제 효과
Inhibitory Effects of Locusta migratoria Ethanol Extracts on RANKL-induced Osteoclast Differentiation 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.10, 2019년, pp.1104 - 1110

초록
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최근 노령인구의 증가로 고령화 사회로 접어들면서 골다공증과 같은 골 대사 질환이 사회적 문제로 대두되고 있다. 파골세포는 골 흡수 역할을 하는 세포이며 골 흡수가 강하게 일어나는 경우 골다공증이 유발된다. 그러나 현재 사용 중인 골 흡수 억제제는 장기간 사용 시 부작용이 발생할 수 있어, 파골세포 분화 억제에 효과가 있는 새로운 소재 개발이 필요한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 풀무치 에탄올 추출물을 대상으로 RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화에 대한 억제 효능 확인 및 그 기작을 구명하고자 하였다. RAW264.7 파골세포에서 풀무치 추출물의 독성 및 증식 효과를 확인하기 위하여 MTS assay를 진행하였고 $2,000{\mu}g/ml$ 농도까지 세포 독성은 확인되지 않았다. 풀무치 추출물이 파골세포의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 3일 동안 RAW264.7 세포에 파골세포 분화 촉진제인 RANKL을 단독 처리 및 풀무치 추출물과 함께 처리한 후 TRAP 활성을 비교하였다. 그 결과 RANKL에 의해 증가한 파골세포 분화가 풀무치 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 파골세포 분화와 관련된 유전자(TRAP, RANK, NFATc1 및 CK)의 발현량 변화를 확인한 결과, RANKL 처리 시에 증가한 유전자 발현량이 풀무치 추출물 처리에 의해 현저하게 감소하는 것을 확인하였고, NFATc1, c-Src와 같은 분화 관련 단백질 발현량 또한 풀무치 추출물 처리에 의해 감소하였다. 풀무치 에탄올 추출물은 $NF-{\kappa}B$, ERK 및 JNK 신호전달에 영향을 미쳐 그 결과로 파골세포 분화 억제 효과가 나타나는 것으로 판단된다. 이러한 결과로 보아 풀무치 에탄올 추출물은 골 흡수를 억제하는 역할을 함으로써 골다공증 예방 및 치료를 위한 새로운 기능성 소재로 사용 가능성이 있음을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Recently, there has been an increase in the elderly population of the world. Consequently, bone metabolic diseases such as osteoporosis are emerging as a social problem. Osteoclasts play a role in bone resorption, and osteoporosis is induced when bone resorption occurs excessively. Because currently used bone resorption inhibitors may cause side effects when used for a long period of time, it is necessary to develop a new material that effectively inhibits osteoclast differentiation. This study aimed to confirm the inhibitory effect of ethanol extract of Locusta migratoria on RANKL-induced osteoclast differentiation and its mechanism. The toxicity and proliferation effects of LME on RAW264.7 osteoclasts were measured by an MTS assay. There was no cytotoxicity or proliferation when the osteoclasts were treated with up to $2,000{\mu}g/ml$ of LME. In order to confirm the effect of LME on the differentiation of osteoclasts, osteoclasts were treated with RANKL alone or with LME for 3 days. As a result of a TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) assay, the increasing osteoclast differentiation by RANKL decreased in a concentration-dependent manner with the treatment of LME. In addition, LME suppressed the expression of differentiation-related marker genes (TRAP, RANK, NFATc1, and CK) and proteins (NFATc1 and c-Src) that had been increased by RANKL. Also, LME influenced the $NF-{\kappa}B$, ERK and JNK signaling pathways, resulting in the inhibition of osteoclast differentiation. These results suggest that LME may be used as a novel functional material for the prevention and treatment of osteoporosis by playing a role in inhibiting bone absorption.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effect of Locusta migratoria extract on the osteoclastic cell cytotoxicity.
그림 Fig. 2. Effect of Locusta migratoria extract on the TRAP activity and staining of osteoclastic cells.
그림 Fig. 3. Effect of Locusta migratoria extract on osteoclatogenesis related gene expression.
그림 Fig. 4. Effect of Locusta migratoria extract on osteoclatogenesis related protein expression.
그림 Fig. 5. Mechanism of inhibitory effects of Locusta migratoria extract on osteoclatogenesis.

AI 본문요약
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문제 정의

현재 풀무치를 이용한 식·약용 소재로 이용하기 위한 연구는 풀무치 추출물을 이용한 세포유전학적 영향 분석[31], 풀무치로부터 추출한 지방과 단백질의 조성 및 특성 분석[6] 등이 진행되었으며, 본 연구진에 의해 풀무치 추출물의 조골세포 분화 촉진 효과가 확인되었다[2]. 따라서 본 연구에서는 풀무치 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였으며, 이를 통해 풀무치 추출물의 골다공증 개선 효능을 확인하고자 하였다.

제안 방법

7의 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 TRAP staining kit (Kamiya Biomedical Co, WA, USA)를 사용하여 kit의 instruction에 따라 실험을 진행하였다. RAW264.7 세포를 96-well plate (SPL life sciences)에 5.0×10³ cells/well로 분주하여 24시간 배양한 다음, 100 ng/ml RANKL과 함께 풀무치 추출물을 농도별(50, 100, 500 및 1,000 μg/ml)로 처리하여 3일간 배양하였다. TRAP 활성의 변화를 확인하기 위하여 분화가 끝난 배양액에 TRAP solution 을 혼합하여 3시간 동안 37℃에서 배양한 후, 550 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
7 세포를 1×10⁵ cells/well의 농도로 6-well plate (SPL life sciences)에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 100ng/ml RANKL과 함께 풀무치 추출물을 농도별(50, 100, 500 및 1,000 μg/ml)로 처리하여 3일간 배양하였다. TRIzol reagent (Ambion Life Technology, MA, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였으며 RNA의 정량은 50배 희석한 후 UV/vis 분광 광도계(Beckman coulter, CA, USA)를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하였다.
7 세포를 1×10⁵ cells/well의 농도로 6-well plate (SPL life sciences)에 분주하여 24시간 배양하였다. 그 후 100ng/ml RANKL과 함께 풀무치 추출물을 농도별(50, 100, 500및 1,000 μg/ml)로 처리하여 20분(MAPK 및 IκB) 또는 3일 (NFATc1 및 c-Src)간 배양하였다. 배양이 끝나는 날, 세포를 PBS (Caisson laboratories)로 세척한 뒤 protease와 phosphatase inhibitor cocktail가 함유된 RIPA buffer를 사용하여 세포를 lysis 하고 원심분리하여 상등액을 회수하였다.
0× 10⁴cells/well로 분주하여 약 80%의 confluency에 도달할 때까지 10% FBS (Hyclone)가 들어있는 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 그 후 풀무치 추출물을 100, 500, 1,000 및 2,000 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) reagent (Sigma, MO, USA) 를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다.
이러한 결과는 라즈베라트롤의 유사체인 Pterostilbene을 이용한 연구 결과[21]와 유사하게 풀무치 추출물은 RANKL에 의해 유도된 MAPK 중 JNK와 ERK의 인산화 억제를 통해 파골세포 분화를 조절하는 것으로 사료된다. 다음으로 파골세포 분화에 영향을 미치는 NF-κB의 활성화를 확인하기 위하여 IκB의 인산화 및 proteasome에 의한 분해 정도를 관찰하였다. 그 결과 RANKL 처리에 의한 IκB의 인산화가 풀무치 추출물의 농도에 의존적 으로 감소함을 확인하였으며, RANKL 처리에 의해 감소한 IκB 단백질의 양 또한 회복됨을 확인 할 수 있었다.
반면에 CK가 감소되면 조골세포에 의한 골 형성이 촉진된다[7, 11]. 따라서 본 연구에서는 풀무치 에탄올 추출물과 RANKL을 처리한 후 RAW264.7 세포로부터 RNA를 분리하여 파골세포 분화 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하였다(Fig. 3).
TRAP은 파골세포의 리소좀에 다량 분포하며 TRAP 활성은 골 조직에서 다핵세포를 인식하는 세포화학적 마커로 알려 져있다[3]. 따라서 파골세포의 분화 정도를 나타내는 표지인자 로써 파골세포에서의 TRAP 활성을 측정하여 풀무치 에탄올 추출물이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 파골세포의 TRAP 활성은 RANKL 단독 처리군과 무처리군인 CTR 군에 대한 비율로 나타냈으며 그 결과는 Fig.
풀무치 에탄올 추출물과 RANKL을 처리한 후, RAW264.7 세포로부터 단백질을 추출하여 파골세포 분화와 관련된 단백질 발현의 변화를 확인하였다(Fig. 4).
풀무치 에탄올 추출물이 파골세포 분화에 영향을 미치는 신호전달 기작을 확인하기 위해 Raw264.7 세포에 풀무치 에탄올 추출물을 1시간 전처리한 후 RANKL을 20분간 처리하고 단백질을 추출하여 파골세포 분화 신호전달에 관련된 단백질들의 변화를 관찰하였다(Fig. 5).
7 세포는 파골세포 전구체로 주로 사용되고 있으며 RANKL의 자극에 의해 파골세포로 분화된다[35]. 풀무치 추출물(LME)이 RAW264.7 세포의 증식 및 독성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 추출물을 24시간 처리한 후 MTS assay 를 통해 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과, LME는 2,000 μg/ ml 농도까지 세포 독성을 유발하지 않았으며 LME에 의한 세포 증식 또한 나타나지 않았다(Fig.
풀무치 추출물이 RAW264.7의 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해 TRAP staining kit (Kamiya Biomedical Co, WA, USA)를 사용하여 kit의 instruction에 따라 실험을 진행하였다. RAW264.

대상 데이터

단백질이 흡착된 Membrane을 5% skim milk 용액으로 blocking 한 후 각각의 1차 항체를 4℃에서 overnight으로 반응시켰으며, 그 후 각 항체에 대한 2차 항체를 반응시킨 후 ECL kit를 이용하여 각 band를 관찰하였다. Western blot에 사용한 시약은 Thermo fisher (MA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 1차 항체는 Cell signaling (MA, USA) 및 Santa cruz biotechnology (TX, USA), 2차 항체는 Promega (WI, USA)에서 구입하여 사용하였다.
마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 ATCC (VA, USA)에서 구입하였으며 10% FBS (fetal bovine serum) (Hyclone, UT, USA)와 1× penicillin-streptomycin (Hyclone)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Hyclone)을 사용하여 배양하였고 세포는 37℃, 5% CO₂의 배양조건을 유지하였다. 세포가 충분히 성장하는 2-3일 간격으로 계대 배양하며 실험을 진행하였다.
본 연구에 사용한 풀무치(Locusta migratoria)는 국립농업과 학원 곤충산업과에서 실내 계대 사육하여 사용하였다. 실험 곤충은 30℃, 65% R.

데이터처리

모든 실험 결과는 3회 반복하여 평균과 표준편차(mean±SD) 로 나타냈다. 실험군 간의 유의성은 Student’s t-test를 통해 검정하였고, p<0.05일 때 군 간의 차이가 유의적인 것으로 판단하였다.

이론/모형

, 9L/15D, 1,800 Lux의 조건에서 밀을 먹이로 하여 사육하였다. 곤충 추출물은 풀무치를 세척 및 동결건조한 후 분말화하여 Baek 등[1] 방법에 따라 추출하였다. 풀무치 동결건조 분말을 70% 에탄올 용액에 혼합하여 초음파 처리(250 J, 10 s, twice)한 후 30분간 실온에서 방치하였다.
7세포에 RANKL을 처리하면 RANK를 통하여 TRAF6를활성화시키며, 활성화된 TRAF6는 MAPKs (p38, ERK 및 JNK) 와 NF-κB의 신호전달경로를 활성화함으로써 NFATc1, TRAP 및 CK 등과 같은 파골세포 분화 관련 인자의 발현을 증가시키는 것으로 보고되어 있다[16, 25]. 따라서 본 연구에서는 풀무치 추출물이 파골세포 분화 신호전달 기작인 MAPKs 및 NF-κ B 신호전달경로에 미치는 영향을 Western blot을 통하여 확인하였다. 그 결과 MAP kinase인 ERK, JNK 및 p38의 인산화가 RANKL 처리에 의해 증가한 것을 확인하였으나 풀무치 에탄올 추출물을 함께 처리한 경우 ERK 및 JNK의 인산화가 억제됨을 확인 할 수 있었다.
풀무치 추출물이 RAW264.7의 세포 생존율에 미치는 영향은 Chao 등[5]의 방법에 따라 확인하였다. RAW264.

성능/효과

4). NFATc1 단백질은 RANKL 처리에 의해 발현량이 2배 이상 증가하였고 풀무치 에탄올 추출물에 의해 발현량이 현저하게 감소하였다. 이는 앞서 확인한 NFATc1 유전자 발현과 유사한 경향을 나타내었다.
c-Src 는 파골세포에 존재하는 단백질로 mature osteoclast에서 골흡수 활성을 조절하는 역할을 하며, NFATc1에 의해 조절되는 여러 유전자 중 하나이다[14, 36]. RANKL만 처리한 군에서 c-Src 단백질 발현량이 증가하였으나 풀무치 에탄올 추출물을 함께 처리한 경우 단백질 발현량이 현저히 감소함을 확인 할수 있었다. 따라서 풀무치 에탄올 추출물의 파골세포 분화 억제효능은 분화관련 단백질인 NFATc1 및 c-Src 단백질 발현의 조절을 통해 이루어진 것으로 판단된다.
이러한 결과는 세포의 TRAP 염색을 통해서도 확인할 수 있었다. RANKL만 처리한 군에서는 RAW264.7 세포가 다핵세포로 분화되었고 붉은색을 나타내며 염색된 반면 풀무치 에탄올 추출물을 농도별로 처리하는 경우에는 다핵세 포의 개수 및 면적이 감소하면서 붉은색으로 염색된 정도도 연하게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2B).
결과 RANKL을 단독 처리하여 파골세포 분화관련 유전 자의 발현이 증가하는 것으로 확인 하였으며, 풀무치 추출물 처리에 의해 각 유전자의 발현이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인 하였다. 따라서 풀무치 추출물은 파골세포 분화와 관련된 TRAP, RANK, NFATc1 및 CK 유전자 발현에 영향을 미치며 그에 따라 파골세포 분화 억제 효능을 가지는 것으로 판단된다.
따라서 본 연구에서는 풀무치 추출물이 파골세포 분화 신호전달 기작인 MAPKs 및 NF-κ B 신호전달경로에 미치는 영향을 Western blot을 통하여 확인하였다. 그 결과 MAP kinase인 ERK, JNK 및 p38의 인산화가 RANKL 처리에 의해 증가한 것을 확인하였으나 풀무치 에탄올 추출물을 함께 처리한 경우 ERK 및 JNK의 인산화가 억제됨을 확인 할 수 있었다. 그러나 풀무치 추출물은 p38의 인산화에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.
다음으로 파골세포 분화에 영향을 미치는 NF-κB의 활성화를 확인하기 위하여 IκB의 인산화 및 proteasome에 의한 분해 정도를 관찰하였다. 그 결과 RANKL 처리에 의한 IκB의 인산화가 풀무치 추출물의 농도에 의존적 으로 감소함을 확인하였으며, RANKL 처리에 의해 감소한 IκB 단백질의 양 또한 회복됨을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 파골세포 분화의 주요 매커니 즘인 MAPKs (ERK 및 JNK)와 NF-κB 신호전달경로의 인산화및 활성화 억제를 통해 파골세포 분화를 조절하는 것으로 판단된다.
2B). 따라서 풀무치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 TRAP 활성을 감소시키며, 이를 통해 파골세포의 분화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
RANKL만 처리한 군에서 c-Src 단백질 발현량이 증가하였으나 풀무치 에탄올 추출물을 함께 처리한 경우 단백질 발현량이 현저히 감소함을 확인 할수 있었다. 따라서 풀무치 에탄올 추출물의 파골세포 분화 억제효능은 분화관련 단백질인 NFATc1 및 c-Src 단백질 발현의 조절을 통해 이루어진 것으로 판단된다.
결과 RANKL을 단독 처리하여 파골세포 분화관련 유전 자의 발현이 증가하는 것으로 확인 하였으며, 풀무치 추출물 처리에 의해 각 유전자의 발현이 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인 하였다. 따라서 풀무치 추출물은 파골세포 분화와 관련된 TRAP, RANK, NFATc1 및 CK 유전자 발현에 영향을 미치며 그에 따라 파골세포 분화 억제 효능을 가지는 것으로 판단된다.
그 결과 RANKL 처리에 의한 IκB의 인산화가 풀무치 추출물의 농도에 의존적 으로 감소함을 확인하였으며, RANKL 처리에 의해 감소한 IκB 단백질의 양 또한 회복됨을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 파골세포 분화의 주요 매커니 즘인 MAPKs (ERK 및 JNK)와 NF-κB 신호전달경로의 인산화및 활성화 억제를 통해 파골세포 분화를 조절하는 것으로 판단된다. 본 연구의 결과에 따라 풀무치 에탄올 추출물은 골흡수 과정 억제를 통해 골다공증 예방 및 치료에 도움을 줄수 있는 새로운 의료용 소재개발에 이용 가능할 것으로 사료된다.
2와 같다. 파골세 포의 분화를 유도하는 RANKL을 단독으로 처리한 군에서 TRAP 활성이 CTR군에 비해 약 3배 정도 증가하였으나 풀무치 에탄올 추출물을 함께 처리한 군에서는 추출물 농도에 의존적으로 TRAP 활성이 유의적으로 감소함을 확인 할 수 있었다(Fig. 2A).

후속연구

이러한 결과는 풀무치 에탄올 추출물이 파골세포 분화의 주요 매커니 즘인 MAPKs (ERK 및 JNK)와 NF-κB 신호전달경로의 인산화및 활성화 억제를 통해 파골세포 분화를 조절하는 것으로 판단된다. 본 연구의 결과에 따라 풀무치 에탄올 추출물은 골흡수 과정 억제를 통해 골다공증 예방 및 치료에 도움을 줄수 있는 새로운 의료용 소재개발에 이용 가능할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	파골세포란 무엇인가?	파골세포는 조혈모세포로부터 유래된 전구세포인 단핵 및 대식 세포에서 분화되어 발생하는 다핵 세포로서 조골세포와 함께 뼈의 형성 및 흡수를 담당하므로 골격계 형성에 필수적인 세포이다[17]. 조골세포가 활성화되어 골 형성이 일어나면 receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand (RANKL)와 macrophage colony stimulating factor (M-CSF)가 분비되며 파골세포 전구체의 융합 및 파골세포의 분화에 영향을 미치게 된다[32].
	풀무치에 함유되어 있는 단백질 비중은 얼마인가?	뿐만 아니라 풀무치는 풍부한 단백질, 식이섬유, 필수지방산 등을 함유하고 있어 영양적으로도 우수한 것으로 알려져 있다. 평균적으로 50-65% 정도의 단백질을 함유하고 있으며 필수 아미노산의 비율이 높아 기존의 육류로부터 섭취하던 단백질을 충분이 대체할 수 있을 것으로 사료된다[20, 22, 24]. 현재 풀무치를 이용한 식·약용 소재로 이용하기 위한 연구는 풀무치 추출물을 이용한 세포유전학적 영향 분석[31], 풀무치로부터 추출한 지방과 단백질의 조성 및 특성 분석[6] 등이 진행되었으며, 본 연구진에 의해 풀무치 추출물의 조골세포 분화 촉진 효과가 확인되었다[2].
	RANKL과 RANK의 결합은 어떤 기능을 하는가?	조골세포의 표면으로부터 분비되는 RANKL과 파골세포의 표면에 존재하는 RANK (Receptor activator of nuclear factor kappa-b)의 결합은 파골세포 분화에서 가장 먼저 발생하는 자극이다. RANKL과 RANK의 결합은 세포질내의 TNF receptor-associated factor (TRAF6)를 활성화 시키며, 활성화된 TRAF6는 nuclear factor κB (NF-κB) 및 mitogenactivated protein kinases (MAPKs) 를 통하여 RANKL의 신호 전달을 촉진시킨다[4, 30]. MAPK pathway의 활성화는 파골 세포에서 c-Fos 발현을 증가시키며 그에 따라 파골세포 분화의 주요 전사인자인 NFATc1의 발현 또한 증가하게 된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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