[논문]Ethidium monoazide (EMA) - PCR 법을 이용한 비배양성 생존 상태(VBNC)의 Edwardsiella tarda 검출

강남이; 김은희

doi:10.7847/jfp.2018.31.2.093

Ethidium monoazide (EMA) - PCR 법을 이용한 비배양성 생존 상태(VBNC)의 Edwardsiella tarda 검출
Differentiations between the viable but nonculturable (VBNC) or dead state of Edwardsiella tarda by ethidium monoazide (EMA) treatment-PCR 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.31 no.2, 2018년, pp.93 - 99

강남이 (전남대학교 수산생명의학과) , 김은희 (전남대학교 수산생명의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Edwardsiella tarda predominantly causes edwardsiellosis in fish at high temperature, but is rarely isolated from water when water temperature is low. However, E. tarda is viable but nonculturable (VBNC) in low water temperature, but it can be revived when water temperature rises and cause disease to fish. Therefore, in order to prevent disease, it is very important to identify pathogens that are in the VBNC state in environmental water. In this study, E. tarda cells in the VBNC state were detected by the ethidium monoazide (EMA)-PCR method using the low-temperature oligotrophic sea water microcosm obtained by inoculation of E. tarda at a concentration of $10^8CFU/ml$. In order to distinguish between live and dead bacteria in E. tarda, each sample was treated with EMA at different concentrations, photoactivated with a 500 W halogen lamp, and PCR was performed with E. tarda specific primer. At the concentration of $10^7CFU/ml$ bacterium, DNA amplification was observed only in the live cells when treated with $60{\mu}g/ml$ of EMA, and smaller amounts of live cells could be distinguished from dead cells by adjusting the EMA concentration. In addition, the VBNC cells of E. tarda in the oligotrophic low temperature seawater microcosm were estimated to be in the range of $10^4{\sim}10^5CFU/ml$ by EMA-PCR. Therefore, it is possible to detect VBNC cells that will act as potential pathogens in environmental water using EMA-PCR method, and quantitative confirmation using concentration change is also possible.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. DNA amplification in live or heat-killed Edwardsiella tarda (10⁷ CFU/ml) photoactivated at various concentrations of EMA 40, 50, 60, 70, or 80 μg/ml. M, 100 kb ladder used as a size marker.
그림 Fig. 2. DNA amplification of live and heat-killed Edwardsiella tarda at various concentrations ; 10⁵, 10⁶, 10⁷ or 10⁸ CFU/ml, photoactivated with 60 μg/ml of EMA. P, original E. tarda; M, 100 kb ladder used as a size marker.
표 Table 1. Specific primer sets and conditions for the detection of Edwardsiella tarda by polymerase chain reaction
그림 Fig. 3. DNA amplification of live and heat-killed Edwardsiella tarda at various concentrations (10⁴, 10⁵, 10⁶ CFU/ml) photoactivated with 40 μg/ml of EMA. P, original E. tarda; M, 100 kb ladder used as a size marker.
그림 Fig. 4. DNA amplification of the heat-treated VBNC and VBNC of Edwardsiella tarda photoactivated with various concentrations of EMA; 0, 20, 40, 60, 80 μg/ml. P, original E. tarda; M, 100 kb ladder used as a size marker.
표 Table 2. Comparisons of DNA amplification according to the concentration of Edwardsiella tarda (10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴ CFU/ml) with 40 μg/ml or 60 μg/ml of EMA
표 Table 3. Comparisons of DNA amplification according to the concentrations of EMA in the heat-treated VBNC and VBNC cells of Edwardsiella tarda artificially induced in low temperature oligotrophic sea water microcosm

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

이에 본 연구에서는 EMA-PCR 방법을 이용하여E. tarda의 사균 상태와 VBNC 상태가 구분 가능한 조건을 찾고 인위적으로 제작한 저온 빈영양해수로부터 E. tarda의 VBNC 세포를 검출하는 것이 가능한 지를 알아보고자 하였다.

제안 방법

, 2012). E. tarda의 mi- crocosm을 100℃에서 10분간 열처리한 것과 열처리 하지 않은 것을 준비하고 각각 EMA 0, 20, 40,60, 80 μg/ml의 농도에서 photo activation 시킨 후위와 동일한 방법으로 PCR template를 제작하였다.
tarda를 10⁶ CFU/ml농도로 25℃에서 해수 또는 담수에서 배양하였을 때 해수에서는 7일, 담수에서는 15일 내에 plate 상배양 가능한 cell이 계수되지 않는다고 하였다. 이 기간 후에 세균은 해수에서 사멸할 것인지 아니면 VBNC와 같은 상태로 남아있는지 알아보기 위하여 형광현미경을 이용한 DVC 방법을 이용하지만VBNC cell을 계수 할 때 발생하는 시각적인 한계가 있어 이를 극복하고자 EMA - PCR 방법을 실시하였다. ;

대상 데이터

본 연구에 사용된 E. tarda 103 균주는 2002년7월 전라남도 해남에서 채집한 넙치 병어의 복수로부터 분리한 것이다. 냉동보관 되어있던 균을tryptic soy agar (TSA, BD) 배지에서 25℃로 배양한 후 생화학적 특성을 분석하였고, 16S rRNA gene sequence를 분석하여database 내의 E.

성능/효과

20μg/ml로 처리 하였을 때는 5개 시료 중 2개의 시료에서 생균과 사균의 구분이 가능했지만 60 이나80 μg/ml의 EMA 농도에서는 모두 DNA 증폭이 억제되어 VBNC인 생균과 사균의 구분이 불가능했다. EMA 40, 60 μg/ml에서 E. tarda의 생균과 사균을 농도별로 처리한 결과 (Table 2)와 EMA 20 ~ 40 μg/ml에서 VBNC E. tarda의 DNA 증폭이 확인된 결과 (Table 3)를 비교하여 볼 때 VBNC E. tarda는 약 10⁴ ~ 10⁵ CFU/ml의 농도로 빈영양 해수 mi- crocosm 내에 있을 것이라 추측되었으며 이는 DVC 방법으로 VBNC cell을 계수한 결과 (Kangand Kim, 2016)와 일치하였다 ;.
2 and 3, Table 2). 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ CFU/ml의 생균또는 사균 E. tarda을 EMA 60 μg/ml 농도로 처리하였을 때 10⁵ CFU/ml의 농도에서는 모두 DNA 증폭이 억제된 반면 약 10⁶ CFU/ml에서는 사균 E. tarda는 DNA 증폭이 완전히 억제되었으나 생균 E. tar- da는 DNA가 증폭됨으로써 생균과 사균의 구별이 가능하였다. 하지만 10⁷ ~ 10⁸ CFU/ml 농도에서는 생균과 사균 모두에서 DNA 증폭이 일어나 구분이 불가능하였다.
따라서 질병이 발생한 어류에 항균제 처리를 하더라도 VBNC 상태의 병원균은 살아남아 다시 재감염을 일으키는 것으로 여겨진다. 그러므로 농도변화를 이용하여 양적인 확인도 가능한 EMA-PCR 방법은 환경수 내에 있으면서 잠재적인 병원체로 작용할 VBNC cell을 모니터링하기에 적합한 방법으로 판단된다. ;

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	direct viable count (DVC) 방법이란?	따라서 VBNC 상태의 세균과 사균 상태의 세균을 구별하기 위한 다양한 방법들이 시도되고 있다. 영양기질과 DNA 합성저해제를 첨가한 후, 단시간 배양하여 세포분열이 억제된 상태에서 신장, 비대된 세포를 검출하는direct viable count (DVC) 방법, 온전한 세포질막의 유무로 확인할 수 있는 BacLight® 법, 막전위, 세포내 효소 활동을 측정하는 multi-parameter flow cytometry 법, 지속적인 유전자 발현을 확인하는 re- verse transcriptase PCR 등을 이용하여 VBNC 세포가 사균 세포와 다름을 증명하고 있다 (Whang etal., 2003; Oliver, 2010).
	세균들이 VBNC 상태를 유지하는 이유는?	일부 세균이 극한 환경에서의 생존 전략으로써 포자를 형성하는 것과 같이 영양고갈, 온도 변화, 삼투압, 식품보존료, 중금속, 백색광 노출과 같은 환경적 스트레스에 대한 생존전략으로 다른 세균들은 VBNC 상태를 유지하고 있다고 볼 수 있다. VBNC 세포는 일반적인 세균 배양 배지에서는 집락을 형성하지 않지만 적절한 조건이 되면 다시배양 가능한 상태로 소생 될 수 있다 (Mc Dougaldet al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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