[논문]Edwardsiella tarda의 특이 Bacteriophage와 Bacillus subtilis KM-1혼합액이 Edwardsiella tarda 에 미치는 항균효과

백민석; 황요셉; 최상훈

doi:10.7847/jfp.2013.26.3.185

Edwardsiella tarda의 특이 Bacteriophage와 Bacillus subtilis KM-1혼합액이 Edwardsiella tarda 에 미치는 항균효과
Mixture of Edwardsiella tarda specific Bacteriophage and Bacillus subtilis KM-1enhanced bactericidal activity against Edwardsiella tarda 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.26 no.3, 2013년, pp.185 - 191

백민석 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 황요셉 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과) , 최상훈 (군산대학교 해양과학대학 수산생명의학과)

초록
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본 연구는 E. tarda에 대한 특이박테리오phage와 생균제의 일종인 B. subtilis KM-1의 혼합제가 E. tarda에 대한 항균활성에 미치는 효과를 알아보고자 수행되었다. 가장 효과적인 혼합제의 항균활성을 보인 phage의 적정 수는 B. subtilis 가 $2{\times}10^5$ CFU/ml의 농도로 존재할 때 배양 36시간째 $2{\times}10^5$ PFU/ml로 나타났다. B. subtilis의 경우 $2{\times}10^5$ PFU/ml의 phage가 존재할 때 첨가량에 비례하는 항균활성을 보여주었다. phage와 B. subtilis의 혼합투여는 phage나 B. subtilis 각각을 투여한 그룹보다 훨씬 높은 항균활성을 나타냈다. 본 연구의 결과는 수산양식에서 대두되고 있는 양식어류의 E. tarda 감염성 질병 치료를 위한 항생제 대체제로서의 사료첨가제 개발 가능성을 제시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

The present study was performed to investigate an antibacterial activity of specific bacteriophage (phage) and Bacillus subtilis KM-1 (B. subtilis) mixture against Edwardsiella tarda (E. tarda). An appropriate number of phage showing the most effective antibacterial activity was $2{\times}10^5$ PFU/ml with $1{\times}10^7$ CFU/ml of B. subtilis 36 h post incubation. On the other hand, B. subtilis showed a dose dependant manner in inducing antibacterial activity in the presence of phage ($2{\times}10^5$ PFU/ml). The phage and B. subtilis mixture showed higher antibacterial activity against E. tarda than phage or B. subtilis only. These results suggest that the phage and B. subtilis mixture could be utilized as an alternative to antibiotics in the control of fish diseases caused by E. tarda.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 E. tarda에 대한 특이박테리오phage와 생균제의 일종인 B. subtilis KM-1의 혼합제가 E. tarda에 대한 항균활성에 미치는 효과를 알아보고자 수행되었다. 가장 효과적인 혼합제의 항균활성을 보인 phage의 적정 수는 B.
본 연구에서는 수산양식산업에 있어서 다양한 항생제 내성균의 출현으로 기존의 항생제 대체제로서의 이용가능성이 높아지고 있는 친환경적인 박테리아 특이 phage와 생균제의 일종인 B. subtilis 혼합제재를 이용하여 에드와드증의 원인균인 E. tarda에 대한 항균효과를 조사하였다. 분리된 phage는 여러 종이었으나 그 중 가장 활성이 강한 phage를 선별하였으며 담수보다는 해수에서 안정성이 높게 나타났으며 수온 약 50℃까지 그 활성이 유지됨을 관찰하였다(결과 미 제시).
subtilis 각각을 투여한 그룹보다 훨씬 높은 항균활성을 나타냈다. 본 연구의 결과는 수산양식에서 대두되고 있는 양식어류의 E. tarda 감염성 질병 치료를 위한 항생제 대체제로서의 사료첨가제 개발 가능성을 제시하고 있다.
이에 본 연구에서는 항생제 대체제를 개발하기 위한 기초적 자료를 수집하고자 E. tarda의 특이 phage와 B. subtilis의 혼합액이 in vitro 상의 E. tarda에 어떠한 항균효과를 나타내는 지 조사하였다.

제안 방법

1차 실험은 E. tarda (2×108 CFU/㎖)와 B. subtilis (1×107 CFU/㎖)의 농도는 변함없이 phage농도만을 2×101, 103, 105 107 및 109 PFU/㎖ 씩 변화를 주었다.
2차 실험은 E. tarda (2×108 CFU/㎖)와 phage (2×103 PFU/㎖)의 농도는 변함없이 B. subtilis농도만을 2×103, 105, 107 CFU/㎖ 씩 변화를 주어 1차 실험과 같은 방법으로 측정하였으며 대조군으로는 B. subtilis를 적용하지 않은 것으로 하였다.
E. tarda에 대한 B. subtilis와 phage의 in vitro상 항균효과를 조사하기 위해 3가지 방법으로 실험을 수행하였다. 1차 실험은 E.
Phage를 순수 정제하기 위해 멸균된 Top agar를 E. tarda와 phage가 손상을 받지 않도록 45∼50 ℃의 적정온도를 유지한 상태에서 107 CFU/㎖의 E. tarda 500 ㎕을 첨가하고 100 ㎕의 phage를 첨가하여 중층배지를 만들었다.
Plaque assay를 통해 10¹¹ PFU/㎖ 정도까지 증폭된 phage를 확인한 후 0.2 ㎛ 실린지 필터로 여과하였다.
두 번째 sample은 BHI broth 5 ㎖에 E. tarda (2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, B. subtilis (1×107 CFU/㎖) 100 ㎕를 각각 분주 하였고 세 번째 sample은 BHI broth 5 ㎖에 E. tarda (2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, phage (2×105 PFU/㎖) 100 ㎕를 분주하였다.
tarda (2×10⁸ CFU/㎖) 100 ㎕만 분주한 후모든 sample을 25℃에서 배양하였다. 배양 0, 6, 12, 18, 24, 36시간 및 48시간째에 각각의 sample에서 SS agar에 평판도말법을 이용하여 E. tarda의 생균수를 측정하였다.
숙성된 김치를 Luria Bertani (LB) broth에 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후 멸균된 생리식염수(Phosphate Buffered Saline, pH 9.2, PBS)로 1:10 단계 희석하고 LB agar에 도말하여 B. subtilis와 유사한 형태 집락 5가지를 분리하였다. 분리된 균들은 E.
2 ㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 여과된 phage sample을 E. tarda 500 ㎕가 도말되어 있는 BHI agar에 접종하여 나타나는 monolayer spot plaque을 관찰하였다. Phage를 순수 정제하기 위해 멸균된 Top agar를 E.
subtilis (1×10⁷ CFU/㎖)의 농도는 변함없이 phage농도만을 2×10¹, 10³, 10⁵ 10⁷ 및 10⁹ PFU/㎖ 씩 변화를 주었다. 이 때 BHI broth 5 ㎖에 E. tarda, B. subtilis 및 각기 다른 농도의 phage를 각각 100 ㎕를 분주하였으며 대조군으로는 phage를 첨가하지 것으로 하였다. 2차 실험은 E.
약 12시간 후 박테리아가 증식되지 않는 것이 관찰되면 더 많은 양의 phage를 증폭시키기 위해 박테리아 5 ㎕를 더 첨가하여 32 ℃에 배양하였다. 이후 E. tarda가 더 이상 자라지 않는 것을 확인한 후 phage가 있는 것으로 추정되는 배양액을 800 x g로 원심 분리하였으며 상청액을 0.2 ㎛ 실린지 필터로 여과하였다. 여과된 phage sample을 E.

대상 데이터

본 연구에서 사용한 E. tarda (KCTC 12267)는 Korean Collection for Type Culture (KCTC)에서 분리 보존하고 있던 균주를 분양받았다. 분양 받은 균주는 brain heart infusion (BHI) broth 와 Salmonella shigella (SS) agar를 이용하여 2차 계대배양 한 후 사용하였다.
tarda (KCTC 12267)는 Korean Collection for Type Culture (KCTC)에서 분리 보존하고 있던 균주를 분양받았다. 분양 받은 균주는 brain heart infusion (BHI) broth 와 Salmonella shigella (SS) agar를 이용하여 2차 계대배양 한 후 사용하였다.
서해안 및 남해안에 위치한 100여 군데의 양식장에서 확보한 물 sample 20 ㎖를 기준으로 이 등(2001)이 분리한 방법을 이용하였다. E.
첫 번째 sample은 BHI broth 5 ㎖에 E. tarda (2×108 CFU/㎖) 100 ㎕, B. subtilis (1×107 CFU/㎖) 100 ㎕, phage (2×105 PFU/㎖) 100 ㎕를 분주하였다.

성능/효과

3에서 보여주고 있다. B. subtilis만을 첨가한 군은 배양 24시간 이후부터대조군과 phage만을 첨가한 군에 비해 E. tarda의 생균수가 감소되는 것이 확인되었다. 이전 연구에서 다른 종류의 probiotics를 이용한 어류의 병원성 세균에 대한 항균효과 보고(백 등, 2001)와 본 연구의 결과는 유사하였다.
subtilis의 경우 2×10⁵ PFU/㎖의 phage가 존재할 때 첨가량에 비례하는 항균활성을 보여주었다. phage와 B. subtilis의 혼합투여는 phage나 B. subtilis 각각을 투여한 그룹보다 훨씬 높은 항균활성을 나타냈다. 본 연구의 결과는 수산양식에서 대두되고 있는 양식어류의 E.
tarda에 대한 항균활성에 미치는 효과를 알아보고자 수행되었다. 가장 효과적인 혼합제의 항균활성을 보인 phage의 적정 수는 B. subtilis 가 2×10⁵ CFU/㎖의 농도로 존재할 때 배양 36시간째 2×10⁵ PFU/㎖로 나타났다. B.
그러나 phage의 수가 105 PFU/㎖ 이후부터는 농도에 상관없이 배양 36시간 째 가장 높은 항균효과가 나타났다.
분리된 phage는 여러 종이었으나 그 중 가장 활성이 강한 phage를 선별하였으며 담수보다는 해수에서 안정성이 높게 나타났으며 수온 약 50℃까지 그 활성이 유지됨을 관찰하였다(결과 미 제시). 김치에서 분리된 균주를 16S rRNA universal primer를 이용 한 염기서열 분석 결과 Genbank에 등록된 accession number JF496383.1인 B. subtilis의 16S ribosomal RNA gene과 100% 상동성을 나타내었다.
이전 연구에서 다른 종류의 probiotics를 이용한 어류의 병원성 세균에 대한 항균효과 보고(백 등, 2001)와 본 연구의 결과는 유사하였다. 또한 phage만을 첨가한 sample에서는 배양 6시간째에 B. subtilis와 phage를 함께 첨가한 sample과 유사한 결과를 보였지만 그 이후부터는 E. tarda의 생균수가 증가 되는 것이 확인되었다(Fig. 3). 이러한 결과는 phage에 대한 내성균주가 배양 6시간째에 형성되어 E.
tarda에 대한 항균효과를 조사하였다. 분리된 phage는 여러 종이었으나 그 중 가장 활성이 강한 phage를 선별하였으며 담수보다는 해수에서 안정성이 높게 나타났으며 수온 약 50℃까지 그 활성이 유지됨을 관찰하였다(결과 미 제시). 김치에서 분리된 균주를 16S rRNA universal primer를 이용 한 염기서열 분석 결과 Genbank에 등록된 accession number JF496383.
subtilis와 유사한 형태 집락 5가지를 분리하였다. 분리된 균들은 E. tarda에 대한 항균효과를 측정한 후 가장 효과가 좋은 균주를 16S rRNA gene을 이용하여 B. subtilis임을 증명하였다. DNA sequencing에 사용된 B.
subtilis가 배지 내에서 우점하기 더좋은 환경이 되었기 때문일 것으로 추측 된다. 사실 phage나 B. subtilis 만을 첨가한 sample보다 함께 복합 투여 한 그룹에서 배양 18시간부터 E. tarda에 대한 더 좋은 항균효과가 확인되었다. 또한 지금까지 많이 보고된 B.
즉 phage (2x101, 103, 105, 107, 109 PFU/㎖)농도 차에 따른 B. subtilis와 phage의 E. tarda에 대한 in vitro 항균효과 실험을 통해 2×101 PFU/㎖ 만큼의 phage만 존재하더라도 B. subtilis만 첨가한 대조군보다 높은 항균효과가 확인되었다.

후속연구

, 1999; Bizani and Brandelli, 2002)와 phage의 상호작용에 의해 항균효과가 향상되었을 것이라고 추측된다. 그러나 E. tarda에 대한 B. subtilis와 phage의 상호작용에 의한 항균효과에 관한 추가적인 보충연구를 통하여 이에 대한 정확한 메커니즘을 규명할 필요성이 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	에드와드증은 어떤 조건에서 많이 발병하는가?	, 1992). 특히 넙치 양식에서 가장 많은 피해를 주는 병원성균으로서 에드와드증의 발병 증상으로는 복부팽창, 탈장 등의 증상이 있으며 주로 고수온기에 많이 나타나는 질병이다(Kusuda and Kawai, 1998). 현재 본 질병은 화학적 치료와 관련된 오염 및 다양한 항생제 내성균의 출현 때문에 어류양식에 있어서 예방 및 치료가 더욱 어려워지고 있다(Chinabut and Puttinaowarat, 2005).
	에드와드증의 발병 증상은 무엇인가?	, 1992). 특히 넙치 양식에서 가장 많은 피해를 주는 병원성균으로서 에드와드증의 발병 증상으로는 복부팽창, 탈장 등의 증상이 있으며 주로 고수온기에 많이 나타나는 질병이다(Kusuda and Kawai, 1998). 현재 본 질병은 화학적 치료와 관련된 오염 및 다양한 항생제 내성균의 출현 때문에 어류양식에 있어서 예방 및 치료가 더욱 어려워지고 있다(Chinabut and Puttinaowarat, 2005).
	에드와드증의 치료가 더욱 어려워진 이유는?	특히 넙치 양식에서 가장 많은 피해를 주는 병원성균으로서 에드와드증의 발병 증상으로는 복부팽창, 탈장 등의 증상이 있으며 주로 고수온기에 많이 나타나는 질병이다(Kusuda and Kawai, 1998). 현재 본 질병은 화학적 치료와 관련된 오염 및 다양한 항생제 내성균의 출현 때문에 어류양식에 있어서 예방 및 치료가 더욱 어려워지고 있다(Chinabut and Puttinaowarat, 2005). 따라서 기존의 질병예방 및 치료의 문제점에 대한 대책으로 친환경적인 bacteriophage (phage)나 Bacillus subtilis (B.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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