[논문]양식 넙치에서 Parvicapsula anisocaudata의 감염 사례에 대한 보고

김남은; 김아란; 노형진; 강경식; 김도형

doi:10.7847/jfp.2018.31.2.123

양식 넙치에서 Parvicapsula anisocaudata의 감염 사례에 대한 보고
A case report of farmed olive flounder Paralichthys olivaceus infected with Myxosporean Parvicapsula anisocaudata 원문보기

韓國魚病學會誌= Journal of fish pathology, v.31 no.2, 2018년, pp.123 - 129

김남은 (부경대학교 수산생명의학과) , 김아란 (부경대학교 수산생명의학과) , 노형진 (부경대학교 수산생명의학과) , 강경식 (부경대학교 수산생명의학과) , 김도형 (부경대학교 수산생명의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Parvicapsula anisocaudata, a myxosporean parasite, is presumably one of causative agents of emaciation in olive flounder Paralichthys olivaceus in Korea. In this study, we report a case of unusual abdominal distension due to exceptionally enlarged liver in farmed olive flounder. For the identification of the causative agent, bacteria and nucleic acids of virus that are possibly present were attempted to isolate from internal organs of five fish sampled from a fish farm in Jeju. Although a few bacterial colonies were isolated from some samples, there was no evidence that fish were primarily affected by virus and/or bacteria. From histopathological analysis, myxosporean were found in almost all internal organs, particularly in the stomach. The causative agent was identified as P. anisocaudata by sequencing a part of small subunit rRNA. This study contains a very unusual case of olive flounder heavily and systemically infected with P. anisocaudata, showing excessively enlarged liver with a small amount of ascitic fluid.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Infected olive flounder (Paralichthys olivaceus) showing severe distended abdomen (A), notably caused by hypertrophied liver (B), and hemorrhages in the stomach (C).
표 Table 1. 18S SSU rDNA sequences of Pavicapsula spp. used in this study
그림 Fig. 2. Histopathological changes in olive flounder infected with Pavicapsula anisocaudata. The myxosporean was found in all the tested organs. Notably, a large number of myxospores were found in the submucosa in stomach (asterisks). Notice that vacuolation was observed in the kidney, spleen, intestine and gills due to P. anisocaudata, and some vacuoles in the kidney, spleen and intestine (arrows) contained the parasite. (A) Gill; (B) Liver; (C) Kidney; (D) Spleen (E) Stomach; (F) Intestine. H&E stain, X400 magnification.
그림 Fig. 3. PCR reaction for the detection of P. anisocaudata in different organs in infected fish. Five fish samples (from no.1 to 5) from a fish farm in Jeju island, and 1 healthy fish (no. 6) from University aquarium were used to detect P. anisocaudata. Note that infection degree is varing from very weak reaction (detected only in the intestine of no. 1 sample) to strong reactions in all the organs (no. 4 sample).
그림 Fig. 4. Phylogenetic tree constructed with Maximum likelihood method. Branch supports were obtained by 1000 bootstrap replicates with random sequence additions. The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. Tetracapsuloides bryosalmonae was used as an outgroup. All positions with less than 95% site coverage were eliminated. There were a total of 1047 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA7.

AI 본문요약
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문제 정의

, 2016)가 검출 되는 것으로 나타나 우리나라 넙치 여윔증의 원인은 두 가지 이상인 것으로 생각된다. 본 연구에서는 극심한 복부팽만 증상을 보이는 양식 넙치로부터 P. anisocaudata를 검출 및 동정하였으며, 감염 개체의 병리조직학적 변화를 조사하였고 그 내용을 본 논문을 통해 보고하고자 하였다.

제안 방법

Accu- Power™ PCR premix (Bioneer Corp., Taejon, Korea)와, Myxosporean에 속하는 종의 small subunit (SSU) rRNA를 타겟으로 하는 MyxospecF(5’-TTCTGCCCTATCAACTWGTTG-3'), MyxospecR(5’-GGTTTCNCDGRGGGMCCAAC- 3’)(Fiala, 2006), P. anisocaudata에 대한 특이프라이머 EM-F(5‘-CAACCGCAATGTGTTTACTC-3’), EM-R(5’-CCAAACAACCTGCCACAATG-3’) (Kim et al., 2015)과 E. leei에 대한 특이프라이머 MM18S-F(5’-CTGGTTGATTCTGCCAGTGGTC-3’), MM18S-R(5’-CGGTACTAGCGACGGGCG-3’) (Palenzuela et al., 2002)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 산물은 1% agarosegel에서 전기영동 후 Gel Doc™ 2000 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)으로 이미지화하여 amplicon의 일치 여부를 확인하였다.
PCR산물 중 양성 밴드는 AccuPrep™ PCR purificationkit(Bioneer Corp., Taejon, Korea)로 분리하여 sangersequencing 방법으로 염기서열을 얻었으며 NCBIBLAST program으로 blast를 수행하여 일치 여부를 확인하였다.
anisocaudata와E. leei를 타겟으로 하는 특이프라이머를 이용하여 장기별 감염 여부를 확인하였다. 넙치 5마리로부터 간, 신장, 아가미, 위, 장 조직을 적출하여 Genomic DNA는 Accuprep™ Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Corp.
는 Table 1에나타냈다. 계통수는 MEGA 7 프로그램의 Maximum likelihood 방법을 이용하여 작성하였으며 1,000회 반복하여 bootstrap value 값을 구하였다.
넙치 5마리로부터 간, 신장, 아가미, 위, 장 조직을 적출하여 Genomic DNA는 Accuprep™ Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer Corp., Daejon, Korea)를 사용하여DNA를 분리하였다.
89cm)를 조사하였다. 모든 어류는 샘플링 전에 MS222로 마취하였으며 외부 증상 관찰 후 개복하여내부 증상을 관찰하고 신장, 비장 및 복수를 무균적으로 채취하여 1% NaCl이 첨가된 BHIA (Brainheart infusion agar, Oxoid)에 도말하여 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세균이 배양된 경우 우점종의 16S rDNA 염기서열을 분석하였다.
세균이 배양된 경우 우점종의 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 바이러스 검사를 위해 OIE 매뉴얼(OIE, 2017)에 따라 상기의 동일한 조직 시료로부터 RNA를 분리하여 바이러스성출혈성패혈증 (Viral hemorrhagic septicemia;VHS)의 원인체인 VHS virus (VHSV)의 존재를 확인하였다. 조직병리학적 시험을 위하여 넙치로부터 간, 아가미, 신장, 비장, 위 및 장 조직을 10%중성 포르말린(pH 7.
모든 어류는 샘플링 전에 MS222로 마취하였으며 외부 증상 관찰 후 개복하여내부 증상을 관찰하고 신장, 비장 및 복수를 무균적으로 채취하여 1% NaCl이 첨가된 BHIA (Brainheart infusion agar, Oxoid)에 도말하여 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 세균이 배양된 경우 우점종의 16S rDNA 염기서열을 분석하였다. 바이러스 검사를 위해 OIE 매뉴얼(OIE, 2017)에 따라 상기의 동일한 조직 시료로부터 RNA를 분리하여 바이러스성출혈성패혈증 (Viral hemorrhagic septicemia;VHS)의 원인체인 VHS virus (VHSV)의 존재를 확인하였다.
바이러스 검사를 위해 OIE 매뉴얼(OIE, 2017)에 따라 상기의 동일한 조직 시료로부터 RNA를 분리하여 바이러스성출혈성패혈증 (Viral hemorrhagic septicemia;VHS)의 원인체인 VHS virus (VHSV)의 존재를 확인하였다. 조직병리학적 시험을 위하여 넙치로부터 간, 아가미, 신장, 비장, 위 및 장 조직을 10%중성 포르말린(pH 7.2-7.4)에 고정하였다. 이후 파라핀 포매하고 섹션을 제작하여 H&E 염색하였다.

대상 데이터

2015년 11월 제주도 소재의 넙치 양식장에서 수집한 병어를 살아있는 상태로 실험실로 운반하여정밀 조사를 실시하였다. 매우 극심한 복부팽만 증상을 나타내는 7마리의 넙치(평균 체장= 11.
All positions with less than 95% site coverage were eliminated. There were a total of 1047 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA7.
매우 극심한 복부팽만 증상을 나타내는 7마리의 넙치(평균 체장= 11.3±3.89cm)를 조사하였다.

이론/모형

기존에 알려진 Parvicapsula 종들과의 계통분석을 위해 18S rRNA gene 염기서열을 얻기 위하여 EIRB1(5’-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3’)과EIRB10(5’-CTTCCGCAGGTTCACCTACGG-3’) 프라이머 세트(Barta et al., 1997)를 이용하여 PCR을수행하였다.

성능/효과

3). PCR amplicon의 염기서열 분석 결과 기존의 P. anisocaudata과100% 일치하였고 여러 Parvicapsula 종 간의 계통발생학적 분석 결과에서도 P. anisocaudata (KY341924.1, KU377575.1)와 클러스터링 되는 것을 확인하였다(Fig. 4).
PCR을 이용한 장기별 감염도를 확인한 결과 감염 정도가 약한 개체의 경우 장에서만 검출되는 반면(Fig. 3, 1번) 감염이 심한 경우 모든 장기에서 검출되었다(Fig. 3, 4번). 본 연구의 병리조직학적시험 결과에서도 본 병원체가 시험된 모든 조직에 감염되어 있음이 확인되었다.
harveyi (검출률 = 100%(7/7개체))가 분리되었으나 감염 정도는 미미하여(10 colony 미만) 분리된 병원성 세균이 관찰된 증상의 주 원인은 아닌 것으로 판단하였다 (data notshown). 그리고 모든 실험 개체에서 VHSV 또한 검출되지 않았다.
anisocaudata가 넙치의 조직 기생(histozoic)으로 특히 위의 점막하조직에 집중되어 있었으며 출혈을 동반하는 특징이 있었다. 또한 각 장기의 조직병리학적 시험 결과 특징적으로 신장, 장및 아가미에서 공포(vacuolation)가 확인되었다. 대부분의 공포는 비어 있었으나 신장과 장에서는 공포 내 원형 또는 난원형의 포자가 함께 있는 것이 확인되었다(Fig 2).
2) 그 형태가 myxosporean과 유사하였다. 먼저 Myxosporean 특이프라이머로 PCR한 결과는 사용한 병어(5 마리)에서 모두 양성을 나타내었다(data not shown). Myxospec 프라이머는 Pavicapsula, Enteromyxum, Ceratomyxa, Myxidium및 Kudoa clade에 속한 점액포자충 SSU rRNA의 증폭에 사용되었다(Fiala, 2006).
leei를 지목하였고 후자의 연관성이 휠씬 더 높은 것으로 결론을 짓고 있다. 물론 이번 연구에서 사용된 병어 개체는 뚜렷한 여윔 증상이 관찰되지 않았으나 위 점막 하조직 등에서 고농도로 분포하는 것으로 보아 여윔증과의 연관성을 완전히 배제할 수는 없을 것으로 보인다. 점액포자충의 경우 치료가 어려우므로 향후 감염 양식장에서의 감염경로 확인을 통해 본 병원체의 예방을 위한 연구도 병행되어야 할 것으로 판단된다.
병리조직학적 시험 결과 조직에서 기생충 포자가 확인되었으며(Fig. 2) 그 형태가 myxosporean과 유사하였다. 먼저 Myxosporean 특이프라이머로 PCR한 결과는 사용한 병어(5 마리)에서 모두 양성을 나타내었다(data not shown).
병어로부터 병원체 검사를 실시한 결과, 비장, 신장 및/또는 복수에서 Vibrio scophthalmi (검출률 = 약 86% (6/7 개체))와 V. harveyi (검출률 = 100%(7/7개체))가 분리되었으나 감염 정도는 미미하여(10 colony 미만) 분리된 병원성 세균이 관찰된 증상의 주 원인은 아닌 것으로 판단하였다 (data notshown). 그리고 모든 실험 개체에서 VHSV 또한 검출되지 않았다.
대부분의 공포는 비어 있었으나 신장과 장에서는 공포 내 원형 또는 난원형의 포자가 함께 있는 것이 확인되었다(Fig 2). 본 연구에서 P. anisocaudata가 아가미, 위의 점막하조직 등 조직 내에 감염된 것을 통해 Ceratomyxa와 유사한 생활사를 가지며(Molnar, 1994) 혈액을 통한 순환계를 통해 발달하여 전신적인 감염을 일으켜 복부팽만의 특이한 증상을 일으킨 것으로 추측된다. 이전 보고(Kim etal.
본 연구의 병리조직학적시험 결과에서도 본 병원체가 시험된 모든 조직에 감염되어 있음이 확인되었다. 본 연구에서 관찰된 감염은 P. anisocaudata가 넙치의 조직 기생(histozoic)으로 특히 위의 점막하조직에 집중되어 있었으며 출혈을 동반하는 특징이 있었다. 또한 각 장기의 조직병리학적 시험 결과 특징적으로 신장, 장및 아가미에서 공포(vacuolation)가 확인되었다.
본 연구에서 확인된 결과를 종합하여 볼 때, P.anisocaudata에 감염된 넙치는 극심한 간의 비대증상을 나타내고 위 점막하 조직에 감염되는 특징은 이전의 보고된 케이스와는 다소 다른 독특한 감염 상태인 것으로 판단된다. 최근 연구(Shin etal.
3, 4번). 본 연구의 병리조직학적시험 결과에서도 본 병원체가 시험된 모든 조직에 감염되어 있음이 확인되었다. 본 연구에서 관찰된 감염은 P.
샘플링된 모든 넙치의 공통적인 외부증상으로는 두드러지는 복부팽만이 확인되었다(Fig. 1). 내부증상으로는 아가미 빈혈, 간의 비대와 탈색이 가장 뚜렷했으며, 일부 개체에서 경미한 투명한 복수(5/7개체)와 신장 및 비장의 비대(4/7개체)가 관찰되었다.

후속연구

물론 이번 연구에서 사용된 병어 개체는 뚜렷한 여윔 증상이 관찰되지 않았으나 위 점막 하조직 등에서 고농도로 분포하는 것으로 보아 여윔증과의 연관성을 완전히 배제할 수는 없을 것으로 보인다. 점액포자충의 경우 치료가 어려우므로 향후 감염 양식장에서의 감염경로 확인을 통해 본 병원체의 예방을 위한 연구도 병행되어야 할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한국에서 넙치의 여윔증이 주로 발생하는 지역은?	한국에서 넙치의 여윔증은 2007년부터 주로 제주 지역에서 지속적으로 발생하고 있다. 어류 여윔증은 대부분 점액포자충이 그 원인인 것으로 알려져 있다.
	우리나라 양식어류 여윔증(넙치)의 원인체는 무엇인가?	최근 연구(Shin etal., 2018)에서 한국의 양식 넙치의 여윔증의 원인체로 P. anisocaudata와 E. leei를 지목하였고 후자의 연관성이 휠씬 더 높은 것으로 결론을 짓고 있다. 물론 이번 연구에서 사용된 병어 개체는 뚜렷한 여윔 증상이 관찰되지 않았으나 위 점막 하조직등에서 고농도로 분포하는 것으로 보아 여윔증과의 연관성을 완전히 배제할 수는 없을 것으로 보인다.
	Parvicapsula의 특징은?	점액포자충이 감염하는 숙주와 장기는 특이적인 것으로 알려져 있다. Parvicapsula는 숙주의 비뇨기계(신장의 tubule 및 방광)나 담낭에 감염되기 때문에 체강기생충(coelozoic parasite)으로 분류하기도 하며 일부 종은 위새(pseudobranch)나 신장에 감염되어 조직기생충(histozoic parasite)으로 불리기도 한다(Køie, 2003). Parvicapsula 속의종은 모두 어류 유래이나 병원성이 보고된 종은 P.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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