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문제 정의
- 본 연구에서는 보익양음의 강장작용, 즉 면역력을 강화할 수 있는 제제로 알려져 있는 익수영진고의 유효성을 강화하기 위하여 꽃송이버섯, 노루궁뎅이버섯, 초석잠을 가미한 제제(가미I 군)와 추가로 지황박과 복령외피를 가미한 제제(가미II군), 그리고 이들 제제 각각에 대하여 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 5-1 균주로서 발효과정을 진행한 제제(가미I발효군, 가미II발효군)를 Methotrexate 유발 면역저하에 미치는 영향을 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- 3일 동안 자동 온도조절 시스템으로 100±2℃로 유지하면서 1차 중탕을 시행하였고, 이때 중탕기 내 물은 옹기가 80% 이상 잠길 수 있게 자동으로 유지되게 하였다. 1차 중탕이 끝난 후 1일 동안 실온에 방치하면서 1차 숙성 과정을 진행하였다. 다시 1일 동안 1차 중탕과 같은 조건으로 2차 중탕을 시행하였고, 이후 1일 동안 1차 숙성과 같은 조건으로 2차 숙성 과정을 진행하였다.
- IL-2 측정은 Rat IL-2(R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.
- IL-6 측정은 Rat IL-6(R&D Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.
- Standard curve를 만들어 sample의 TNF-α 양을 assay하였다.
- TNF-α 측정은 Rat TNF-α(Invitrogen, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 익수영진고의 유효성을 강화하기 위하여 익수영진고에 꽃송이버섯, 노루궁뎅이버섯, 초석잠을 가미한 제제와 추가로 지황박과 복령외피를 가미한 제제, 그리고 이들 제제 각각에 대하여 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 5-1 균주로 발효한 제제를 시료로 하여 이들 시료 투여가 Methotrexate 유발 면역저하에 미치는 영향을 TNF-a, IL-2, Il-6, Ig E 및 비장무게 변화 등으로 관찰한 바, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- dextranicum 5-1 균주로 발효한 제제를 시료로 하여 이들 시료 투여가 Methotrexate 유발 면역저하에 미치는 영향을 혈액학적변화, IL-2, Il-6, Ig E, TNF-a 및 비장무게 변화 등으로 관찰한 바, 다음과 같은 지견을 얻었다.
- 각 시료는 음용수에 희석하여 매일 200 mg/Kg의 양으로 전체 실험기간(20일)동안 음용수와 함께 투여하였다.
- 각 실험군은 대조군에 비하여 α=0.05 수준(P<0.05)과 α=0.01 수준(P<0.01)에서 유의성을 검정하였다.
- 군 분리는 아무처치를 하지 않은 정상군(Normal), Methotrexate(MTX) 면역저하 유발 후 시술을 하지 않은 대조군(Control), MTX 면역저하 유발 후 익수영진고 가미I군(IYGgami-I군, 가미I군), MTX 면역저하 유발 후 익수영진고가미I발효 시료 투여군(IYGgami-I -F군, 가미I발효군), MTX 면역저하 유발 후 익수영진 고가미II 군(IYGgami-II군, 가미II군), MTX 면역저하 유발 후 익수영진고가미II발효군(IYGgami-II-F군, 가미II발효군)으로 각각 분류하였다.
- 면역저하 유발은 Methotrexate(Sigma, USA)를 2mg/Kg 의 농도로 정하였으며, 전체 실험기간 20일 중 8 일째부터 11일째 4일간 1회/1일 총 4회 구강 투여를 시행하였다.
- 채혈에 의하여 얻어진 혈액중약 100μl를 EDTA-bottle에 넣은 후 곧바로 Multi species Hematology Analyser(950, Hemavet, USA)에 주입하여 Leukocytes를 측정하였다.
- 체중은 전자 저울(Cass, China)을 이용하여 을 이용하여 실험 시작일, 5일째, 10일째, 15일째, 20일째 측정하였으며, 비장무게는 실험 종료 후 비장을 분리해 무게를 측정하였다.
대상 데이터
- 꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 (영)백아산꽃송이버섯(Hwasun, Korea)에서, 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceus)은 (주)유림바이오(Pyeongteck, Korea) 구입하여 사용하였다. 홍삼(Red Ginseng radix), 백복령(Poria cocos), 천문동(Asparagi radix), 맥문동(Liriopis tuber), 구기자(Lycii fructus), 초석잠(Stachys sieboldii Miq), 봉밀(Honey)은 한약재유통센터(Hwasun, Korea)와 옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 홍삼 900 g, 봉밀 6,000 g, 천문동 150 g, 맥문동 150 g, 구기자 300 g, 꽃송이버섯 200 g, 노루궁뎅이버섯 700 g, 초석잠 300 g을 사용하였다. 복령원물 1,800 g을 복령외피와 백복령으로 구분하였고, 백복령 1,530 g(복령원물의 85%)과 함께, 복령외피 270 g(복령원물의 15%)을 함께 사용하였다. 생지황 9,600 g을 착즙하여 생지황즙과 지황박으로 구분하였고, 생지황즙 5,760 g(착즙율 60%)과 함께, 지황박 3,840 g을 함께 사용하였다.
- 홍삼(Red Ginseng radix), 백복령(Poria cocos), 천문동(Asparagi radix), 맥문동(Liriopis tuber), 구기자(Lycii fructus), 초석잠(Stachys sieboldii Miq), 봉밀(Honey)은 한약재유통센터(Hwasun, Korea)와 옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 생지황 (Rehmanniae radix)은 생지황영농조합(Geumsan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 재료는 모두 국내산을 사용하였다.
- 복령원물의 복령외피를 제거한 후 백복령 1,800 g을 사용하였다. 생지황 9,600 g을 착즙하여 생지황즙 5,760 g(착즙율 60%)을 사용하였다.
- 복령원물 1,800 g을 복령외피와 백복령으로 구분하였고, 백복령 1,530 g(복령원물의 85%)과 함께, 복령외피 270 g(복령원물의 15%)을 함께 사용하였다. 생지황 9,600 g을 착즙하여 생지황즙과 지황박으로 구분하였고, 생지황즙 5,760 g(착즙율 60%)과 함께, 지황박 3,840 g을 함께 사용하였다.
- 생지황 (Rehmanniae radix)은 생지황영농조합(Geumsan, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 재료는 모두 국내산을 사용하였다.
- 체중이 약 170~180 g의 Sprague Dawley계의 백서를 항온항습 환경의 사육장(실내온도 24~26 ℃, 습도 40~ 60%)내에서 고형사료(Pellet, GMO, 한국)와 물을 충분히 공급하면서1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험기간 동안에도 물과 고형사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 홍삼 900 g, 봉밀 6,000 g, 천문동 150 g, 맥문동 150 g, 구기자 300 g, 꽃송이버섯 200 g, 노루궁뎅이버섯 700 g, 초석잠 300 g을 사용하였다. 복령원물의 복령외피를 제거한 후 백복령 1,800 g을 사용하였다.
- 꽃송이버섯(Sparassis crispa)은 (영)백아산꽃송이버섯(Hwasun, Korea)에서, 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceus)은 (주)유림바이오(Pyeongteck, Korea) 구입하여 사용하였다. 홍삼(Red Ginseng radix), 백복령(Poria cocos), 천문동(Asparagi radix), 맥문동(Liriopis tuber), 구기자(Lycii fructus), 초석잠(Stachys sieboldii Miq), 봉밀(Honey)은 한약재유통센터(Hwasun, Korea)와 옴니허브(Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 생지황 (Rehmanniae radix)은 생지황영농조합(Geumsan, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 Excel statistic program(Microsoft, USA)을 이용하여 평균치와 표준오차(mean±standard error)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS(SPSS, USA)를 사용하였다.
이론/모형
- 각 시료의 제조는 중탕법(double boiling method)를 적용하였다. 각 고형재료는 미세분말화 하였고, 이를 생지황즙, 꿀을 함께 넣어 균일하게 혼합 반죽하였다.
성능/효과
- 1. TNF-α 변화에서, 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다.
- 2. IL-2 변화에서, 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다.
- 3. IL-6 변화에서, 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다.
- 4. IgE 변화에서, 대조군에 비하여 IYGgami-I-F군, IYGgami-II군, IYGgami-II-F군이 유의한 감소를 나타내었다.
- 5. 비장무게 변화에서, 대조군에 비하여 IYGgami-I-F군이 유의한 증가를 나타내었다.
- 6. 혈액 Leukocytes 변화에서, 대조군에 비하여 WBC와 Lymphocytes의 경우 IYGgami-I군이 유의한 증가를 나타내었다.
- 7. 증체량 변화에서, 대조군에 비하여 IYGgami-I-F군이 15일째, 20일째에 유의한 증가를 보였고, IYGgami-I군과 IYGgami-II-F군이 15일째에 유의한 증가를 나타내었다.
- 가미I발효군, 가미II발효군 모두 유의한 감소 수준을 보인 것으로 볼 때 발효가 주요하게 면역을 조절하는데 관여할 수 있다고 사료되며, 또한 가미II군에서 유의한 감소를 나타낸 것으로 볼때, 지황박과 복령외피 역시 면역 조절에 주요하게 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 IgE 함량은 대조군은 정상군에 비하여 4.7배로 유의하게 높은 수준을 나타내었고, 대조군에 비하여 가미I발효군, 가미II군, 가미II발효군이 유의한 감소를 나타내었으며, 가미I군은 감소의 경향을 나타내었으나 유의성은 인정되지 않았다. IgE는 알레르기와 아토피 피부염과 같은 질환 환자의 혈청에서 특히 높은 수치를 보인다 24-26).
- 본 연구에서 MTX 면역저하에 대하여 시료별 투여가 비장 무게 변화에 미치는 영향에서 면역저하된 대조군 (Control)은 정상군보다 유의한 감소를 보였으며, 대조군에 비하여 익수영진고에 꽃송이버섯, 노루궁뎅이버섯, 초석잠 그리고 지황박과 복령외피를 추가로 배합하고 이를 발효한 가미II발효군이 유의한 증가를 나타내었다. 가미I군, 가미I발효군, 가미II군은 대조군에 비하여 증가의 경향을 보였으나 유의성은 인정되지 않았다.
- 본 연구에서 면역저하에 대하여 시료별 투여가 사이토카인 함량에 미치는 영향을 관찰한 결과, TNF-α, IL-2, IL-6 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다.
- 본연구의 4종 시료 이들 지표에 대하여 모두 억제 작용을 발휘되는 것으로 보아 익수영진고에 배합된 시료및발효된시료는 모두 유의한 효능을 나타낸 것으로 보여지며, 단 억제효과의 패턴을 볼 때, TNF-α, IL-2, IL-6에서 공통적으로 발효를 시행했을 때 억제 효과가 좀더 우수한 것으로 사료된다.
- 위의 결과로 볼 때, 익수영진고에 꽃송이버섯, 노루궁뎅이버섯과 초석잠을 가미한 제제, 지황박과 복령외피를 추가로 배합한 제제, 그리고 각각을 발효한 제제등 4가지 시료는 면역활성을 증강하는 작용이 일정하게 발휘됨을 관찰할 수 있었고, 지황박과 복령외피를 추가로 배합할 시에도 그 효능이 일정하게 유지됨과 함께 효능 강화시킬 수 있음을 확인할 수 있었으며, 아울러 발효를 시행했을 때 그 면역활성 효과가 증강됨을 확인 할 수 있었다.
- 이상에서 본 연구의 4가지 시료 모두 면역활성에 일정한 효과가 발휘됨을 관찰할 수 있었으며, 이러한 면역활성 효과는 지황박과 복령외피 배합 및 발효가 좀 더 유리하게 작용될 수 있음을 제시하는 것으로 사료된다.
- 증체량에 미치는 영향에서 정상군에 비하여 MTX에 의해 면역저하를 유발시켰을 경우 대조군은 15일째, 20일째에 유의한 감소를 나타낸 반면에, 대조군에 비하여 15일동안 약을 투여한 가미Ⅰ발효군, 가미Ⅱ군, 가미Ⅱ 발효군에서 유의한 증가를 나타내었다. 이의 결과는 본 연구의 제제가 체내의 흡수를 촉진시켜 체중이 증가된것으로 사료되며, 이의 결과도 발효한 제제가 좀더 효과적으로 나타났다.
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 IL-2 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 13.4±0.36pg/ml, 대조군은 18.5±1.71 pg/ml로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, IYGgami군은 13.8±0.48 pg/ml, IYGgami-I-F 군은 12.8±0.81pg/ml, IYGgami-II군은 12.5±0.49pg/ml, IYGgami-II-F군은 12.5±0.3 pg/ml로 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다(Table 2, Fig. 2).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 IL-6 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 9.5±1.08 pg/ml, 대조군은 15.7±1.29 pg/ml 로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, IYGgami군은 9.0±0.46 pg/ml, IYGgami-I-F 군은 7.7±0.95 pg/ml, IYGgami-II군은 8.9±1.27 pg/ml, IYGgami-II-F군은 9.1±0.47 pg/ml로 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다(Table 3, Fig. 3).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 TNF-α 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 7.8±0.53 pg/ml, 대조군은 10.6±0.54 pg/ml 로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, IYGgami-I군은 7.7±0.50 pg/ml, IYGgami-I -F군은 6.2±0.33 pg/ml, IYGgami-II군은 8.1±0.57 pg/ml, IYGgami-II-F군은 6.2±0.18 pg/ml로 대조군에 비하여 실험군 모두 유의한 감소를 나타내었다(Table 1, Fig. 1).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 비장무게 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군은 0.83±0.03 g, 대조군은 0.71±0.03 g로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 감소를 나타내었으며, IYGgami군은 0.78±0.06 g, IYGgami-I-F군은 0.78±0.05 g, IYGgami-II군은 0.78±0.03 g, IYGgami-II-F군은 0.81±0.02 g으로 대조군에 비하여 IYGgami-II-F군 은 유의한 증가를 나타내었다(Table 5, Fig. 5).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 증체량 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, 정상군에 비하여 대조군은 15일째, 20일째에 유의한 감소를 보였으며, 대조군에 비하여 IYGgami-I -F군은 15일째, 20일째에 유의한 증가를 보였고, IYGgami-II군과 IYGgami-II-F군은 15일째에 유의한 증가를 나타내었다(Table 7, Fig. 7).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에 따른 제제가 혈액 Leukocytes 변화에 미치는 영향을 관찰한 결과, WBC와 Lymphocytes의 경우 대조군에 비하여 IYGgami-I-F군은 유의한 증가를 나타내었다(Table 6, Fig. 6).
- 익수영진고에 재료별로 가미한 제제와 그리고 이들의 발효에따른제제가IgE변화에미치는영향을관찰한결과, 정상군은 0.16±0.05 pg/ml, 대조군은 0.75±0.18 pg/ml로 정상군에 비하여 대조군은 유의한 증가를 나타내었으며, IYGgami군은 0.27±0.14 pg/ml, IYGgami-I-F군은 0.21±0.06 pg/ml, IYGgami-II군은 0.19±0.07 pg/ml, IYGgami-II-F군은 0.13±0.02 pg/ml로 대조군에 비하여 IYGgami-I-F군, IYGgami-II군, IYGgami-II -F군은 유의한 감소를 나타내었다(Table 4, Fig. 4).
- 증체량에 미치는 영향에서 정상군에 비하여 MTX에 의해 면역저하를 유발시켰을 경우 대조군은 15일째, 20일째에 유의한 감소를 나타낸 반면에, 대조군에 비하여 15일동안 약을 투여한 가미Ⅰ발효군, 가미Ⅱ군, 가미Ⅱ 발효군에서 유의한 증가를 나타내었다. 이의 결과는 본 연구의 제제가 체내의 흡수를 촉진시켜 체중이 증가된것으로 사료되며, 이의 결과도 발효한 제제가 좀더 효과적으로 나타났다.
- 혈액 내 백혈구(WBC)함량은 정상군에 비하여 MTX에 의해 면역저하를 유발시켰을 경우 대조군은 유의적으로 감소하였으며, 익수영진고에 꽃송이버섯, 노루궁뎅이버섯, 초석잠을 배합하고 이를 발효한 가미I발효군이 유의한 증가를 나타내었고, 지황박과 복령외피를 배합한 가미II군과 이를 발효한 가미II발효군은 유의성은 인정되지 않았으나 증가의 경향을 나타내었고, 이러한 결과는 림프구(lymphocyte)에서 동일한 패턴을 보였다.
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