선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- yezoensis의 methanol (MeOH) 추출에 의한 유기 용매별 분획물로부터 폴리페놀 함량, 항산화 활성 그리고 인간 간암세포주인 HepG2 세포의 증식 억제를 평가하였다. 또한 이를 토대로 P. yezoensis의 chloroform (CHCl3) 분획물이 HepG2 세포에 미치는 작용 양상을 DNA microarray로 확인하여 김이 HepG2 세포의 유전자 발현에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.
- yezoensis 의 효능과 연관되어 있는 IL6R, CYP1A1, 그리고 ARNT에 대하여 추가적인 분자생물학적 분석이 요구된다. 또한 효능별 적합한 세포주를 재선정하여 추가적인 유전체 분석 및 분자기전 규명 연구를 수행하여 P. yezoensis의 생리활성 효과에 대한 구체적인 영향을 평가하고 유효단일물질을 탐색하고자 한다.
- 김에 함유된 다양한 생리활성물질에 의한 인체 내의 여러 가지 조절 기능에 관한 활발한 연구가 진행되고 있으나, 세포 내에서의 작용 기전에 대해서는 연구된 바가 없다. 본 연구는 생리활성 기능 성분을 활용한 고부가가치의 기능성 식품 소재화 기술개발의 일환으로 P. yezoensis의 methanol (MeOH) 추출에 의한 유기 용매별 분획물로부터 폴리페놀 함량, 항산화 활성 그리고 인간 간암세포주인 HepG2 세포의 증식 억제를 평가하였다. 또한 이를 토대로 P.
제안 방법
- HepG2 세포주에 CHCl3 분획물의 처리는 75개의 유전자가 2 배 이상으로 발현의 증가를 보였고, 39개의 유전자에서 발현이 감소하였다(Table 4). 2 배 이상 발현 차이가 있는 유전자를 대상으로 P. yezoensis의 효능 예측을 위한 Gene Ontology 분석으로 비타민 D 대사 과정(vitamin D metabolic process), 항균작용에 대한 반응(response to molecule of bacterial origin), 그리고 영양물질에 대한 반응(response to nutrient)에관련된 유의 유전자를 탐색하였다(Fig. 4). 이들 유의 유전자는 CYP1A1 (cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1), CYP24A1 (cytochrome P450, family 24, subfamily A, polypeptide 1), IL6R (interleukin 6 receptor) 등의 유전자가 중복하여 포함되어 있었다(Fig.
- 20 mg/ml 농도의 분획 별 시료 20 μl에 0.2 M Folin-Ciocalteu’s phenol 용액(Sigma-Aldrich Co., USA) 20 μl를 가하여 실온에서 3분 동안 반응시킨 다음 20 μl의 10% Na2CO3용액과 140 μl의 증류수를 가하여 암소에서 1시간 동안 방치 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. 750 ng cRNA를 이용 하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다. Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다.
- HepG2 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)와 100 units/ ml penicillin-streptomycin이 포함된 minimum essential media (MEM) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 시 주 2~3회 동일 배지로 갈아준 다음 배양 6~7일경과 후 PBS로 세척 및 0.
- P. yezoensis의 MeOH 추출에 의한 CHCl3 분획물 50 μg/ml과 대조군으로 DMSO가 6시간 또는 24시간 동안 각각 처리된 HepG2 세포를 회수하고, TRIzol® REAGENT (Invitrogen, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다.
- P. yezoensis의 각 분획물과 DPPH의 반응 후 감소하는 흡광도를 측정하여 얻은 자유라디칼 소거 활성법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다(Table 3). 항산화제의 대표적 물질로 알려진 ascorbic acid와 P.
- P. yezoensis의 효능 검증을 위한 분자생물학적 연구의 일환으로 CHCl3 분획물이 처리된 HepG2 세포에 microarray 분석에 의한 gene expression profile을 분석하였다. Time-dependent manner로 2-fold changed gene을 hierarchical cluster 분석 결과, 초기 6시간에서 변화된 유전자 일부는 24시간에서도 유사한 발현패턴이 있는 것으로 나타났다.
- 다시 PBST로 5분 동안 3회 세척 후 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 5분 동안 3회 세척 후 ECL (ATTO, Japan)로 발광하여 X-ray 필름에 노출시켜 단백질 발현 분석을 실시하였다.
- yezoensis의 MeOH 추출에 의한 CHCl3 분획물 50 μg/ml과 대조군으로 DMSO가 6시간 또는 24시간 동안 각각 처리된 HepG2 세포를 회수하고, TRIzol® REAGENT (Invitrogen, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. Total RNA 정량 및 정성분석은 RNA nano kit (2100 Bioanalyzer System, Agilent Techologies, USA)를 사용하였다.
- 각 분획물의 EDA (%) 값을 바탕으로 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 양 ED50(mg/ml)을 구하고, ascorbic acid와 비교하여 P. yezoensis의 MeOH 추출에 의한 유기용매별 분획물의 항산화 활성을 검정하였다.
- 각 시료의 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplification and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다.
- 3 (Agilent Technology)으로 수행하였다. 각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값 으로 나누어 산출하였다. 유전자 선정(gene selection)을 위한 functional annotation은 Gene OntologyTM Consortium (http:// www.
- MeOH 추출 이후 용매에 따른 추출 분획물은 n-hexane, CHCl 3 , EtOAc, n-BuOH, water 순으로 추출하였다. 두 번째 용매 n-hexane 추출은 얻은 MeOH 분획물에 water와 n-hexane을 1:9:10의 비율로 혼합한 후 분액깔대기에 넣어 강한 혼합과 정지를 반복하여 water 층과 분획 용매가 두 층으로 나뉘도록 방치하여 n-hexane 분획물을 얻었다. 이 후 차례로 CHCl3, EtOAc, 및 n-BuOH 순으로 분액 깔대기에서 각 용매를 이용하여 추출한 후 마지막으로 남은 water 잔류액을 회수 water 추출을 분획화 하였다(Fig.
- Time-dependent manner로 2-fold changed gene을 hierarchical cluster 분석 결과, 초기 6시간에서 변화된 유전자 일부는 24시간에서도 유사한 발현패턴이 있는 것으로 나타났다. 따라서 이후의 분석에서는 6시간 및 24시간 모두에서 변화된 유전자를 분석하였다. HepG2 세포주에 CHCl3 분획물의 처리는 75개의 유전자가 2 배 이상으로 발현의 증가를 보였고, 39개의 유전자에서 발현이 감소하였다(Table 4).
- 배양 시 주 2~3회 동일 배지로 갈아준 다음 배양 6~7일경과 후 PBS로 세척 및 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리 및 원심분리하여 새로운 MEM 배지로 재 부유하여 세포 수를 1×105 cell/ml로 조절하여 사용하였다.
- 2 mM DPPH 용액 180 μl에 MeOH에 용해시킨 각 분획의 농도 별시료 20 μl를 혼합하여 실온에서 30분 동안 암실 방치 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조물로는 ascorbic acid (vitamin C)를 실험군과 동일한 농도로 사용하였고 시료의 전자공여능(electron donating ability, EDA)은 다음의 식으로 계산하였다.
- 이 때 생성된 formazan 결정체에 100 μl의 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켜 ELISA reader (TECAN, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포수를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 두 번째 용매 n-hexane 추출은 얻은 MeOH 분획물에 water와 n-hexane을 1:9:10의 비율로 혼합한 후 분액깔대기에 넣어 강한 혼합과 정지를 반복하여 water 층과 분획 용매가 두 층으로 나뉘도록 방치하여 n-hexane 분획물을 얻었다. 이 후 차례로 CHCl3, EtOAc, 및 n-BuOH 순으로 분액 깔대기에서 각 용매를 이용하여 추출한 후 마지막으로 남은 water 잔류액을 회수 water 추출을 분획화 하였다(Fig. 1).
- 인간 간암세포주인 HepG2 세포의 증식억제에 대한 P. yezoensis의 효과를 각 분획물의 농도를 300 μg/ml에서부터 300단위로 1,500 μg/ml까지 희석하여 24시간 동안 처리 한 후 MTT assay로 확인하였다(Fig. 3).
- 대조군 시료는 cyanine 3, 실험군 시료는 cyanine 5로 각각을 증폭 및 라벨시켰다. 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. 750 ng cRNA를 이용 하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다.
대상 데이터
- FBS (Fetal Bovine Serum) 은 Wisent (USA)에서 구입하였고 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide), DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), 0.2 M Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, galic acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다.
- HepG2 (human hepatocellular carcinoma cells) 세포는 호서대학교 혈관 생물학 연구실에서 제공받았으며, MEM (Minimum Essential Medium)과 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines)는 WELGEN (Korea)에서 구입하였다.
- P. yezoensis를 충남 서천군 소재의 양식장에서 생물 상태의 잎과 줄기를 제공 받아 세척 후 쇄절하여 실험에 사용하였다. 추출 및 분획물의 유기용매로는 MeOH, n-hexane, CHCl 3 , ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)을 Duksan Co.
- 2 M Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, galic acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다. Penicillinstreptomycin은 Gibco (USA)에서 항체는 Ab frontier (Korea) 와 Sigma (USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
- 각 시료의 total RNA로부터 target cRNA의 합성(amplification and labeling) 및 혼성화 반응(nucleic acid hybridization)은 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS (Agilent Technology)를 이용하여 수행하였다. 대조군 시료는 cyanine 3, 실험군 시료는 cyanine 5로 각각을 증폭 및 라벨시켰다. 증폭 및 라벨된 cRNA는 RNase Mini Spin Columns (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 정제, ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다.
- yezoensis를 충남 서천군 소재의 양식장에서 생물 상태의 잎과 줄기를 제공 받아 세척 후 쇄절하여 실험에 사용하였다. 추출 및 분획물의 유기용매로는 MeOH, n-hexane, CHCl 3 , ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (n-BuOH)을 Duksan Co. (Korea)로부터 구입하여 사용하였다. HepG2 (human hepatocellular carcinoma cells) 세포는 호서대학교 혈관 생물학 연구실에서 제공받았으며, MEM (Minimum Essential Medium)과 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salines)는 WELGEN (Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- 데이터의 통계처리는 SPSS program (ver. 12.0.01)을 이용하여 일원배치 분산분석(oneway ANOVA)을 시행하였으며, 신뢰수준 p<0.05에서 평균값들에 대한 유의성을 검증하였다.
- 모든 실험은 최소한 3회 이상 실험을 실시하였으며, 실험군당 평균±표준편차로 표현하였다.
이론/모형
- 30 μg의 상층액을 8% SDS-PAGE[19]로 분리시킨 후, Towbin 등[34]의 방법에 따라 PVDF membrane으로 150 V에서 1시간 동안 전이시켰다.
- yezoensis extract on HepG2 cells. Cell viability was analyzed using the MTT assay. The data are presented as the mean ± SD of three independent experiments performed in triplicate.
- 750 ng cRNA를 이용 하여 hybridization buffer를 만들고 Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (44K)에서 혼성화 반응을 실시하였다. Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다. 모든 데이터의 normalization (LOWESS)과 fold-changed genes의 선택은 GeneSpring GX 7.
- P. yezoensis의 MeOH 추출에 의한 유기용매 별 분획물의 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법[37]에 따라 측정하였다. 20 mg/ml 농도의 분획 별 시료 20 μl에 0.
- Hybridization image는 Agilent DNA microarray scanner를 이용하여 스캔하였으며, 데이터 정량은 Agilent Feature Extraction software를 이용하였다. 모든 데이터의 normalization (LOWESS)과 fold-changed genes의 선택은 GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technology)으로 수행하였다. 각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값 으로 나누어 산출하였다.
- 상기 Gene Ontology 분석에서 P. yezoensis의 효능 예측을 설명할 수 있는 유전자 CYP1A1와 IL6R가 세포 내에서도 동일한 단백질 발현 양상으로 나타나는지를 확인하기 위하여 Western blotting을 수행하였다.
- 각 실험군에서 flag-out genes들은 제거하였으며, normalized ratio는 signal channel intensity 중간값을 control channel intensity 중간값 으로 나누어 산출하였다. 유전자 선정(gene selection)을 위한 functional annotation은 Gene OntologyTM Consortium (http:// www.geneontology.org/index.shtml) DB 정보를 따랐으며, IPA (ingenuity pathways analysis, http://www.ingenuity.com)를 이용하여 상위 조절자(upstream regulator)를 탐색하였다.
- 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)의 자유라디칼 소거효과(free radical scavenging effect)를 측정하는 Blois[1]의 방법에 따라 측정하였다. MeOH에 녹인 0.
성능/효과
- 3). CHCl3 분획물에서 각 농도에 따라 39%, 80%, 90%, 91%, 92%의 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었고, 다음으로 EtOAc 분획물에서 30%, 70%, 80%, 86%, 86%의 암세포 증식억제 효과를 보였다. n-BuOH과 water 분획물에서는 HepG2 세포의 증식억제가 나타나지 않았고, 반면 n-hexane 분획물은 600 μg/ml에서부터 약 30%의 미미한 암세포 증식효과를 보였다.
- 따라서 이후의 분석에서는 6시간 및 24시간 모두에서 변화된 유전자를 분석하였다. HepG2 세포주에 CHCl3 분획물의 처리는 75개의 유전자가 2 배 이상으로 발현의 증가를 보였고, 39개의 유전자에서 발현이 감소하였다(Table 4). 2 배 이상 발현 차이가 있는 유전자를 대상으로 P.
- P. yezoensis의 CHCl3 분획물 50, 100 μg/ml이 48시간 동안 처리된 HepG2 세포와 무처리구 (control)를 대조군 단백질 β-actin (loading control)의 발현 양으로 보정, 비교 시 IL6R와 CYP1A1의 단백질량이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 6).
- yezoensis의 효능 검증을 위한 분자생물학적 연구의 일환으로 CHCl3 분획물이 처리된 HepG2 세포에 microarray 분석에 의한 gene expression profile을 분석하였다. Time-dependent manner로 2-fold changed gene을 hierarchical cluster 분석 결과, 초기 6시간에서 변화된 유전자 일부는 24시간에서도 유사한 발현패턴이 있는 것으로 나타났다. 따라서 이후의 분석에서는 6시간 및 24시간 모두에서 변화된 유전자를 분석하였다.
- 248 g) 순으로 유기용매의 극성이 낮은 것부터 높은 순서로 순차 분획물을 얻었다. 각 분획물의 용매 별 수율은 water 분획물에서 0.52% 로 가장 높았고, 다음으로 n-hexane (0.11%), n-BuOH (0.037%), CHCl3 (0.008%), EtOAc (0.006%) 순으로 CHCl3 과 EtOAc 분획물에서는 비교적 수율이 낮게 나타났다(Table 1).
- 따라서 P. yezoensis의 항산화 활성과 연관하여 인간 간암 세포주에서 효능 예측과 연관된 유전자들은 비타민 D 대사 과정, 항균작용에 대한 반응, 그리고 영양물질에 대한 반응에 관련된 것들 이었다. 향후 HepG2 세포에서 P.
- 6). 또한 IPA 결과, CYP1A1, CYP24A1, IL6R 및 NQO1 유전자의 상위 조절자인 ARNT의 단백질량이 역시 증가하는 것으로 나타남을 확인하여 ARNT의 활성을 검증하였다(Fig. 7).
- 임 등[23]은 해조류 추출물의 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 활성이 높다는 것을 보고하였다. 본 실험에서도 폴리페놀 함량이 높은 CHCl3 분획물에서 항산화 활성이 뛰어남을 나타나는 유의한 결과를 얻었으며, 이는 자유라디칼 소거능과 폴리페놀 함량 간의 밀접한 연관을 나타낸다. 한편 신 등[31]의 유기 용매별 분획물에 대한 활성 실험 에서는 n-hexane 분획물에서 높은 활성을 보였는데, 본 실험과의 추출 및 분획 방법의 차이로 인한 결과로 여겨진다.
- 4). 이들 유의 유전자는 CYP1A1 (cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1), CYP24A1 (cytochrome P450, family 24, subfamily A, polypeptide 1), IL6R (interleukin 6 receptor) 등의 유전자가 중복하여 포함되어 있었다(Fig. 5). 특히 CYP1A1 유전자의 경우 6시간에서 14 배, 24시간에서 31 배로 발현이 증가되었다.
- yezoensis의 용매 별 분획물은 농도가 증가할수록 자유라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보이므로 농도 의존적인 항산화 활성을 나타 내었다. 전자공여능(EDA)에 의해 얻은 분획물 별 ED50 은 CHCl3 분획물에서 16.96 mg/ml으로 가장 높았으며, 다음으로 n-BuOH, EtOAc, water, n-hexane 분획물 순으로 각각 27.51 mg/ml, 31.23 mg/ml, 50.17 mg/ml, 79.26 mg/ml의 ED50 값을 보였다(Fig. 2). 임 등[23]은 해조류 추출물의 폴리페놀 함량이 높을수록 항산화 활성이 높다는 것을 보고하였다.
- yezoensis의 각 분획물과 DPPH의 반응 후 감소하는 흡광도를 측정하여 얻은 자유라디칼 소거 활성법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다(Table 3). 항산화제의 대표적 물질로 알려진 ascorbic acid와 P. yezoensis의 용매 별 분획물을 1~20 mg/ml 농도로 각각 동일하게 처리하였을 때, P. yezoensis의 용매 별 분획물은 농도가 증가할수록 자유라디칼 소거활성이 증가하는 경향을 보이므로 농도 의존적인 항산화 활성을 나타 내었다. 전자공여능(EDA)에 의해 얻은 분획물 별 ED50 은 CHCl3 분획물에서 16.
후속연구
- 특히 CYP1A1 유전자의 경우 6시간에서 14 배, 24시간에서 31 배로 발현이 증가되었다. LOC102725171 유전자는 현재까지 기능이 잘 알려져 있지 않은 유전자로 6시간에서 21 배, 24시간에서 34 배로 발현이 증가된 것으로 나타나 후속 연구를 통하여 그 기능의 규명이 요구된다. Vigna 등[35]은 비타민 D 대사 과정과 항균작용에 대한 반응 관련 기능에서 비타민 D는 골격 형성에 필요한 칼슘의 흡수에 관여하며, 포만감을 느끼게 하는 호르몬인 렙틴 (leptin)의 분비와 연관이 있고, 또한 체중감소에 영향을 줄 수 있다고 보고하였다.
- yezoensis의 MeOH 추출에 의한 용매별 분획물이 암 세포의 증식을 억제한다는 연구 결과와 일치한다. 이러한 결과로 미루어 볼 때 P. yezoensis의 MeOH 추출에 의한 CHCl3 분획물과 EtOAc 분획물은 암세포의 증식을 억제하는 생리활성물질이 존재하며, 이를 토대로 한 김 추출물이 암 세포의 생육을 억제시키는 세포독성 연구[5]는 김에 함유되어 있는 화합물의 생리적 효과 및 기능 연구[21]와 더불어 향후 새로운 암 예방 및 항암 식의약품 소재로의 개발 가능성을 제시한다.
- yezoensis의 항산화 활성과 연관하여 인간 간암 세포주에서 효능 예측과 연관된 유전자들은 비타민 D 대사 과정, 항균작용에 대한 반응, 그리고 영양물질에 대한 반응에 관련된 것들 이었다. 향후 HepG2 세포에서 P. yezoensis 의 효능과 연관되어 있는 IL6R, CYP1A1, 그리고 ARNT에 대하여 추가적인 분자생물학적 분석이 요구된다. 또한 효능별 적합한 세포주를 재선정하여 추가적인 유전체 분석 및 분자기전 규명 연구를 수행하여 P.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.