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문제 정의
- 따라서 본 연구는 기존의 A543G SNP가 한국재래계의 체중과 유의한 연관성이 있었음을 상기하며, 닭의 20번째 염색체상에서의 A543G SNP의 정확한 위치를 파악하고, 주변의 SNP를 탐색하여 체중과 관련된 유의한 추가적인 HNF4α 유전자 내 분자 마커를 발굴하여 재래계의 성장률 개선에 활용할 수 있는 유전정보를 제공하고자 한다.
- 기존에 보고된 SNP와 비교하였을 때, NCBI상에 등록된 8개 SNP를 확인할 수 없었으며, 1개의 기보고 되지 않은 새로운 SNP을 발견하였다. 이러한 닭의 동일한 유전자 위치에서 발생하는 SNP의 차이는 한국 재래계와 외래계간의 유전적 차이에 기인한 것으로 사료되며, 이는 외래계를 대상으로 기존에 조사된 유전자마커가 한국재래계의 경제형질 증진에 대한 효과가 기대에 미치지 못할 수도 있는 점을 시사하는 것으로 한국재래계에 적합한 유전자마커 개발의 필요성을 역설하는 바이다.
- 선행연구에서 보고된 HNF4α 유전자 내 A543G SNP은 외래 육계뿐만 아니라, 외래 육계와 유전적 차이를 가지는 한국 재래계의 생시체중과 생체중에 유의적 연관성을 보인 바 있으나, 해당 SNP의 정확한 위치는 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 sequencing을 통하여 A543G SNP의 정확한 위치를 파악하고, A543G SNP의 주변 부위의 한국 재래계의 산육형질에 유의적 연관성이 있는 SNP을 파악하고자 하였다. Genomic DNA는 128수의 한국 재래계의 혈액을 이용하여 추출하였으며, PCR 뒤 sequencing 에 사용되었다.
제안 방법
- PCR 과정으로 증폭된 산물을 정제하기 위해 Multiscreen filter plate(Millipore Corp, Darmstadt, Germany)를 이용하여 증폭에 이용되지 않은 nucleotide와 primer를 제거하였다.
- 재래계의 체중과 유의한 연관성이 기보고된 SNP rs73124 6957을 포함하는 HNF4α 유전자의 6번 intron 전후의 염기 서열을 분석하기 위해 Primer3 Plus program을 이용하여 염기서열 627 bp를 증폭할 수 있도록 primer를 디자인하였으며, GeneBank(Accession #NC_006107.4)에서 검토하였다.
- 각각의 날개대정맥에서 3.0 mL의 혈액을 채취하여 EDTA tube에 보관하였고, 이후 1X SSC로 2회 세척 및 원심분리하여 혈액내의 혈구성분만 얻었으며, 이를 genomic DNA 추출에 이용하였다.
- 재래계의 산육형질로써 생시부터 2∼4주 간격으로 40주간 생체중을 측정하였다.
- Genomic DNA를 추출하기 위해 각 공시동물의 혈구 10μL, 1× Red Blood Cell Lysis Buffer(Sigma-Aldrich, USA) 90μL, 1× SSC 100 μL를 첨가해 혈구 희석액을 조성한 후 상온에 10분간 인큐베이팅한 뒤, 희석액을 G-spinTM Total DNA Extraction Mini Kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 닭의 gDNA를 추출하였다.
- Total DNA Extraction Mini Kit(Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 닭의 gDNA를 추출하였다. 추출된 gDNA는 NanoDrop ND-2000(NanoDrop Technologies, USA)로 DNA의 농도와 흡광도 260/280 nm 순도를 측정하였다.
- PCR은 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Cycle(Bio-RAD, CA, USA)을 이용하였다. 온도 및 반응시간 조건은 Pre-denaturation을 95℃에서 5분간 진행하였고, 이후 denaturation 95℃ 30초, annealing 58℃ 30초, extension 72℃ 1분간 35회 반복 진행하였다.
- PCR은 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Cycle(Bio-RAD, CA, USA)을 이용하였다. 온도 및 반응시간 조건은 Pre-denaturation을 95℃에서 5분간 진행하였고, 이후 denaturation 95℃ 30초, annealing 58℃ 30초, extension 72℃ 1분간 35회 반복 진행하였다. Final extension을 72℃ 7분간 진행한 뒤 반응을 종료하였으며, 증폭 산물을 —20℃에서 냉동 보관하였다.
- Sequencing BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, ABIPRISM 3730XL Analyzer(Applied Biosystems)를 이용해 PCR 산물의 염기서열 분석을 진행하였다.
대상 데이터
- 본 연구는 경남과학기술대학교 부설농장에서 사육된 국내 H사 보유의 토종 순계 5계통의 이면교잡으로 생산된 한국재래계 25개 조합 중 사육기간 체중 평균을 기준으로 상· 하위 각각 5개 조합에서 128수를 공시재료로 이용하였다.
- 본 연구에서는 HNF4α 유전자의 부분 염기서열분석을 위해 128수의 한국재래계 DNA를 이용하였으나, 17개의 시료가 PCR에 의해 증폭되지 않아 111개의 시료를 이용하여 분석을 진행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 sequencing을 통하여 A543G SNP의 정확한 위치를 파악하고, A543G SNP의 주변 부위의 한국 재래계의 산육형질에 유의적 연관성이 있는 SNP을 파악하고자 하였다. Genomic DNA는 128수의 한국 재래계의 혈액을 이용하여 추출하였으며, PCR 뒤 sequencing 에 사용되었다. Sequencing 결과, 증폭범위 내에서 총 14개의 SNP가 탐색되었으며, 이 중 HNF4α 유전자의 intron 4 상에서 기존에 보고되지 않은 1개의 새로운 SNP를 발견하였다.
데이터처리
- HNF4α 유전자의 sequencing을 통해 발견된 SNP들과 체중과의 연관성을 분석하기 위하여 SAS 9.4 package(SAS Institute, USA)를 이용하여 GLM(general linear model)방법 으로 통계 분석하였으며, 사후 검정은 t검정을 이용하여 유의수준 P<0.05 범위 내에서 실시하였다.
성능/효과
- 4)에 의하면 닭의 HNF4α 유전자상의 5,566,470∼ 5,567,096번째 염기서열 안에 총 21개의 SNP의 존재가 보고되었다. 한편, 한국 재래계를 대상으로 동일 위치의 염기 서열 분석한 결과, 한국재래계의 염기서열 내에서 14개의 SNP가 존재를 확인하였다(Fig. 1, Table 2). 기존에 보고된 SNP와 비교하였을 때, NCBI상에 등록된 8개 SNP를 확인할 수 없었으며, 1개의 기보고 되지 않은 새로운 SNP을 발견하였다.
- 1, Table 2). 기존에 보고된 SNP와 비교하였을 때, NCBI상에 등록된 8개 SNP를 확인할 수 없었으며, 1개의 기보고 되지 않은 새로운 SNP을 발견하였다. 이러한 닭의 동일한 유전자 위치에서 발생하는 SNP의 차이는 한국 재래계와 외래계간의 유전적 차이에 기인한 것으로 사료되며, 이는 외래계를 대상으로 기존에 조사된 유전자마커가 한국재래계의 경제형질 증진에 대한 효과가 기대에 미치지 못할 수도 있는 점을 시사하는 것으로 한국재래계에 적합한 유전자마커 개발의 필요성을 역설하는 바이다.
- 또한 rs736159604 SNP의 유전자형에 따라 생시체중부터 40주령 체중까지 재래계의 전체 성장기간 동안 닭의 체중에 통계적으로 유의미한 차이가 나타나는 것을 확인하였다(P<0.001)(Table 4).
- 본 연구에서 A543G SNP의 위치파악을 위해서 선행논문에 제공된 primer 정보와 제한효소 자리를 토대로 SNP의 위치를 추정하여 해당 부위의 염기서열을 확인한 결과, SNP의 NCBI 데이터베이스 상에서의 A543G SNP의 이름은 rs731246957이며, 위치는 5,566,970이고, 해당 SNP의 유전자형은 T와 C로 나타났다. Silva 등(2012, 2013)과 Choi 등(2016)에서 SNP의 유전자형을 A와 G로 표기한 것은 NCBI의 HNF4α 유전자 염기서열 정보(NC_006107.
- 5배 가량 높은 체중 증가치를 보인다고 보고된 바 있다(Choi 등, 2016). 이러한 연구결과는 rs731246957 SNP가 외래육계뿐만 아니라, 한국재래계를 대상으로 한 체중관련 분자마커로서 활용될 수 있음을 시사하는 바이며, 시퀀싱을 통하여 분석한 본 연구결과에서도 선행연구와 유사한 유전자형 빈도 및 체중과의 연관성을 얻어내 선행 실험의 연구재현성을 입증할 수 있었다(Fig. 1, Table 3).
- 001)(Table 4). rs736159604 SNP의 GG 유전자형 그룹의 체중이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 생시체중부터 40주령 체중까지 유의하게 높은 관측치를 유지하며, 전체 사육기간 중 약 6 g에서 최대 1,700 g까지 높게 나타났다. 특히 40주령 체중에서는 GG 유전자형 그룹이 AA유전자형 그룹보다 약 1.
- rs736159604 SNP의 GG 유전자형 그룹의 체중이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 생시체중부터 40주령 체중까지 유의하게 높은 관측치를 유지하며, 전체 사육기간 중 약 6 g에서 최대 1,700 g까지 높게 나타났다. 특히 40주령 체중에서는 GG 유전자형 그룹이 AA유전자형 그룹보다 약 1.8배 높은 체중 관측치를 보이며, 사육기간이 길어질수록 rs736159604 SNP의 유전자형에 따른 체중이 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다(Table 4). 이러한 결과는 기존의 선행연구들에서 체중과의 연관성이 밝혀지지 않은 rs726159604 SNP가 기존에 연구되었던 rs731246957 SNP와 함께 한국재래계에 있어서 생시체중 및 증체와 같은 산육 특성 마커로 활용할 수 있을 것이며, 재래계의 시장 경제성을 높이기 위한 선발 및 육종에 적합한 유전자 마커로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- NCBI 의 데이터베이스의 reference 종으로 제시된 적색야계에 존재하지 않는다. 새로 발견된 SNP는 발현 빈도가 낮고 실험에 사용된 계군 내에서는 hetero형(GT)만 확인되었으나(Table 3), 두 개의 유전자형간의 통계적인 유의미함을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이러한 새로운 SNP에 대한 정보는 한국 재래계의 유전적 기초 자료로서의 의미를 가지며, 보다 많은 실험 개체를 추가하여 후속실험을 진행할 필요가 있다고 사료된다.
- Sequencing 결과, 증폭범위 내에서 총 14개의 SNP가 탐색되었으며, 이 중 HNF4α 유전자의 intron 4 상에서 기존에 보고되지 않은 1개의 새로운 SNP를 발견하였다.
- 확인된 14개의 SNP 중 rs731246957과 rs736159604가 재래계의 생시체중 및 생체중에 유의적 연관성(P<0.001)을 보였다.
- 001)을 보였다. rs731246957은 닭의 20번 염색체의 5,566,970번째에 위치하며, 선행논문에서 체중과의 연관성이 보고된 A543G SNP인 것으로 확인되었으며, 기존의 연구결과와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 반면에 선행논문에서 닭의 성장형질 과의 연관성이 보고된 적 없는 rs736159604 SNP는 GG 유전자형 그룹이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 꾸준히 높은 체중 관측치를 보였으며, 특히 40주령의 체중은 다른 유전자형 그룹에 비해 약 1.
- rs731246957은 닭의 20번 염색체의 5,566,970번째에 위치하며, 선행논문에서 체중과의 연관성이 보고된 A543G SNP인 것으로 확인되었으며, 기존의 연구결과와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 반면에 선행논문에서 닭의 성장형질 과의 연관성이 보고된 적 없는 rs736159604 SNP는 GG 유전자형 그룹이 GA, AA 유전자형 그룹에 비해 꾸준히 높은 체중 관측치를 보였으며, 특히 40주령의 체중은 다른 유전자형 그룹에 비해 약 1.8배 높게 관측되었다. 뿐만 아니라 신규 발견한 SNP의 T allele을 가지는 계군이 G allele을 가지는 계군보다 성장면에서 고능력을 보이는 것을 확인하였다.
- 8배 높게 관측되었다. 뿐만 아니라 신규 발견한 SNP의 T allele을 가지는 계군이 G allele을 가지는 계군보다 성장면에서 고능력을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구결과는 한국재래계의 산육형질과 연관된 후보유전자로써 HNF4α 유전자의 기초정보를 제공하며, 해당 유전자내 특정 단일염기의 변이가 재래계의 체중 관련 유전자 마커로 유용하게 활용 가능할 것을 시사한다.
후속연구
- 결론적으로 HNF4α 유전자는 한국재래계의 성장과 연관된 후보유전자로써 rs731246957과 rs736159604 SNP, 새로이 발견된 SNP인 intron 6(249)의 특정 유전자형이 재래계의 생시체중 및 주차별 체중에 유의적 연관성을 보인 바, 한국 재래계의 경제형질 개량을 위한 선발 육종에 유용한 유적적 마커로서 활용 가능할 것이며, 본 실험 결과를 적용하여 재래계의 계통 선발에 이용한다면 산육겸용종으로 이용되는 한국재래계를 외래계와 같이 산란 또는 산육에 특화된 실용계 개발 및 우수한 종계 개발에 도움이 될 것이라 판단된다.
- 8배 높은 체중 관측치를 보이며, 사육기간이 길어질수록 rs736159604 SNP의 유전자형에 따른 체중이 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다(Table 4). 이러한 결과는 기존의 선행연구들에서 체중과의 연관성이 밝혀지지 않은 rs726159604 SNP가 기존에 연구되었던 rs731246957 SNP와 함께 한국재래계에 있어서 생시체중 및 증체와 같은 산육 특성 마커로 활용할 수 있을 것이며, 재래계의 시장 경제성을 높이기 위한 선발 및 육종에 적합한 유전자 마커로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 2). 이러한 새로운 SNP에 대한 정보는 한국 재래계의 유전적 기초 자료로서의 의미를 가지며, 보다 많은 실험 개체를 추가하여 후속실험을 진행할 필요가 있다고 사료된다.
- 따라서 본 연구결과는 한국재래계의 산육형질과 연관된 후보유전자로써 HNF4α 유전자의 기초정보를 제공하며, 해당 유전자내 특정 단일염기의 변이가 재래계의 체중 관련 유전자 마커로 유용하게 활용 가능할 것을 시사한다.
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