Janthinobacterium sp. 유래 저온활성 lipase의 발현, 정제 및 효소 특성 연구 Expression, Purification, and Characterization of a Cold-adapted Lipase from Janthinobacterium sp.원문보기
본 연구에서는 극지에서 유래한 Janthinobacterium sp. PAMC25641로부터 분리한 리파아제 유전자를 클로닝 하고 과발현시켜 정제하였으며, 이 분리한 재조합 리파아제 효소의 생화학적 특성에 대해 분석하였다. 이 효소는 $15^{\circ}C$ 이하의 온도에서 장시간 활성을 유지하는 효소로서 산업적으로 활용될 가능성이 높을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 극지에서 유래한 Janthinobacterium sp. PAMC25641로부터 분리한 리파아제 유전자를 클로닝 하고 과발현시켜 정제하였으며, 이 분리한 재조합 리파아제 효소의 생화학적 특성에 대해 분석하였다. 이 효소는 $15^{\circ}C$ 이하의 온도에서 장시간 활성을 유지하는 효소로서 산업적으로 활용될 가능성이 높을 것으로 기대된다.
The expression, purification, and characterization of cold-adapted lipase from the psychrophile, Janthinobacterium sp. were investigated. The gene encoding lipase from Janthinobacterium sp. PAMC 25641 was cloned into a pET28a(+) vector and heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The...
The expression, purification, and characterization of cold-adapted lipase from the psychrophile, Janthinobacterium sp. were investigated. The gene encoding lipase from Janthinobacterium sp. PAMC 25641 was cloned into a pET28a(+) vector and heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence (930 bp) corresponded to a protein having 309 amino acid residues with a molecular weight of 32.7 kDa and a pI of 5.55. Recombinant E. coli harboring the Janthinobacterium lipase gene were induced by addition of isopropyl-${\beta}$-D-thiogalactopyranoside. $Ni^{2+}$-NTA affinity chromatography was used to purify the lipase, which had a specific activity of 107.9 U/mg protein. The effect of temperature and pH on the activity of lipase was measured using p-nitrophenyl octanoate as a substrate. The stability of the lipase at low temperatures indicated it is a cold-adapted enzyme. The lipase activity was increased by $Na^{2+}$, $Mg^{2+}$, and $Mn^{2+}$, and decreased by $Zn^{2+}$ and $Co^{2+}$. Analysis of the lipase activity using various p-nitrophenyl esters showed a strong preference toward short acyl chains of the esters, indicating the ability of the cold-adapted lipase to hydrolyze short-chain esters.
The expression, purification, and characterization of cold-adapted lipase from the psychrophile, Janthinobacterium sp. were investigated. The gene encoding lipase from Janthinobacterium sp. PAMC 25641 was cloned into a pET28a(+) vector and heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence (930 bp) corresponded to a protein having 309 amino acid residues with a molecular weight of 32.7 kDa and a pI of 5.55. Recombinant E. coli harboring the Janthinobacterium lipase gene were induced by addition of isopropyl-${\beta}$-D-thiogalactopyranoside. $Ni^{2+}$-NTA affinity chromatography was used to purify the lipase, which had a specific activity of 107.9 U/mg protein. The effect of temperature and pH on the activity of lipase was measured using p-nitrophenyl octanoate as a substrate. The stability of the lipase at low temperatures indicated it is a cold-adapted enzyme. The lipase activity was increased by $Na^{2+}$, $Mg^{2+}$, and $Mn^{2+}$, and decreased by $Zn^{2+}$ and $Co^{2+}$. Analysis of the lipase activity using various p-nitrophenyl esters showed a strong preference toward short acyl chains of the esters, indicating the ability of the cold-adapted lipase to hydrolyze short-chain esters.
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제안 방법
염기서열분석을 통하여 얻은 신규 리파아제 염기서열과 보고된 다른 리파아제의 유사성을 확인하기 위하여 계통수 분석을 하였다. Blast를 이용하여 상동성이 높은 15종을 선별하여 multiple sequence alignment와 계통수 분석을 실시하였다. 그 결과, 다른 Janthinobacterium 종의 lipase와 매우 유사한 상동성을 나타내었다(Fig.
극지 연구소에서 분양받은 여러 미생물들을 배양하면서 성장률과 리파아제활성을 비교한 결과 Janthinobacterium sp. PAMC25641 균주가 우수한 성장 속도와 리파아제 활성을 나타내어 후속 연구를 진행하였다(data not shown). Janthinobacterium sp.
Janthinobacterium sp. PAMC25641 균주의 리파아제 활성은 R2A-TBN plate에서 확인하였다. R2A-TBN plate는 TBN (200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5%(w/v) gum arabic) 18 ml에 2 ml의 tributyrin을 첨가한 후, 이를 R2A agar 배지 180 ml과 혼합하여 제작하였다.
Janthinobacterium sp. PAMC25641에서 genomic DNA를 분리하기 위하여 genomic DNA purification kit (Invitrogen, USA)을 이용하였다. 리파아제 유전자는 forward primer PAMC25641_Lip-F (5'-CCC GGA TCC ATG AGC CTC GAT CCA CTG AT-3')와 reverse primer PAMC25641_Lip-R (5'-CCC AAG CTT TTA CCT TCC CAG CGC CT-3')를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 증폭하였다.
1 mM이 되도록 첨가한 후, 16℃에서 과발현시켰다. SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel) 분석을 통하여 발현된 단백질을 확인하였다. 16℃에서 재조합 리파아제를 과발현 시킨 결과 대조군과 비교하여 재조합 리파아제가 발현됨을 확인하였다.
pH에 대한 안정성은 pH를 조절한 buffer : 50 mM citric acid (pH 3.0−5.0), 50 mM sodium acetate (pH 6.0), 50 mM Tris (pH 7.0−9.0)에서 효소를 1시간, 18시간 배양한 후 pH 8.0에서 활성을 측정 하였다.
따라서 본 연구에서는 극지에서 분리한 미생물중에서 리파아제 활성이 있는 Janthinobacterium sp. 균주에서 얻은 리파아제 유전자를 대장균에서 발현시켜 정제하였고, 정제한 재조합 리파아제의 생화학적 특성을 규명하였다.
fr/ phyml)을 이용하여 계통수 분석을 실시하였다. 또한 재조합 리파아제를 발현시키기 위하여 pET28a/lipase plasmid를 E. coli BL21(DE3) 균주에 형질전환 하였다.
또한 효소의 pH에 대한 안정성을 확인하기 위하여 pH(3.0−9.0)를 조절한 buffer에서 효소를 1시간, 18시간 방치한 후 활성을 측정하였다.
4A). 또한, 효소의 열안정성을 확인하기 위하여 5℃에서 70℃ 사이에서 효소를 1시간, 18시간 방치한 후 활성을 측정하였다. 효소의 열안정성을 확인한 결과 1시간 후에는 35℃내에서 최대 활성의 80%를 유지하였지만, 18시간 배양후에 활성을 측정한 결과 5−15℃에서는 최대 활성의 80% 이상을 유지하였지만 15℃ 이상의 온도에서는 효소의 활성이 급격히 감소함을 확인하였다(Fig.
리파아제 유전자는 forward primer PAMC25641_Lip-F (5'-CCC GGA TCC ATG AGC CTC GAT CCA CTG AT-3')와 reverse primer PAMC25641_Lip-R (5'-CCC AAG CTT TTA CCT TCC CAG CGC CT-3')를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR)을 통해 증폭하였다.
리파아제의 metal ions, chemical reagents에 대한 활성을 비교하기 위하여 다양한 metal ions (1 mM CaCl2, NaCl, KCl, MgCl2, MnCl2, CoCl2, FeCl3, ZnCl2), chemical reagents (각각 1 mM와 5 mM ammonium persulfate, 1 mM와 5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM와 5 mM EDTA, 1%와 5% SDS, 1%와 5% Triton X-100, 1%와 5% Tween-20, 1%와 5% Tween-80)를 이용하여 활성을 측정하였다.
리파아제의 기질 특이성은 다양한 chain length (C4−C14)의 p-nitrophenyl ester를 기질로 하여 활성을 측정하였다.
리파아제의 최적 활성온도는 상기 기술된 효소 분해활성 buffer를 이용하여 온도 범위(5−70℃)에서 10분간 반응하여 측정하였다.
반응액 900 μl (100 μM pNPO (C8 dissolved in ethanol), 50 mM Tris (pH 8.0), 4% ethanol, 100 mM NaCl, 10% glycerol)와 효소 혼합액 10 μl (50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol, enzyme 0.114 mg/ml)를 37℃에서 5분간 반응시켜 유리된 p-Nitrophenol을 405 nm에서 spectrophotometer로 측정하였다.
열안정성은 온도 범위(5−70℃)에서 enzyme mixture를 1시간, 18시간 배양한 후 활성을 측정하였다.
이러한 예측된 open reading frame이 리파아제를 암호화하는 것인지 확인하기 위하여 유전자를 PCR 증폭하여 pET28a plasmid에 클로닝하고 대장균에 형질전환하였다. 염기서열분석을 통하여 얻은 신규 리파아제 염기서열과 보고된 다른 리파아제의 유사성을 확인하기 위하여 계통수 분석을 하였다. Blast를 이용하여 상동성이 높은 15종을 선별하여 multiple sequence alignment와 계통수 분석을 실시하였다.
5 kDa에서 단일 밴드를 확인하였다. 용출된 재조합 리파아제는 추후 단백질 특성을 분석하기 위하여 dialysis를 수행하였다. 정제된 재조합 리파아제의 활성은 107.
55로 계산되어졌다. 이러한 예측된 open reading frame이 리파아제를 암호화하는 것인지 확인하기 위하여 유전자를 PCR 증폭하여 pET28a plasmid에 클로닝하고 대장균에 형질전환하였다. 염기서열분석을 통하여 얻은 신규 리파아제 염기서열과 보고된 다른 리파아제의 유사성을 확인하기 위하여 계통수 분석을 하였다.
재조합 plasmid를 E. coli DH5α에 형질전환 하였고 colony PCR, double digestion 및 plasmid DNA sequencing (Macrogen, Korea)을 통해 확인하였다.
재조합 리파아제는 Ni-NTA chromatography 와 dialysis를 이용하여 정제하였다. 배양액을 원심분리(8,000 × g, 15 min, 4℃)하여 cell pellet을 확보하였다.
재조합 리파아제를 발현시키기 위해, 대장균 BL21(DE3)를 재조합 벡터 pET28a/lipase plasmid로 형질 전환하였다. 형질전환 시킨 대장균을 37℃에서 50 μg/ml의 kanamycin을 포함한 LB 배지에서 배양하고 IPTG를 최종농도 0.
재조합 리파아제의 metal ions, chemical reagents에 대한 활성을 분석하기 위하여 여러 metal ions (1 mM와 5 mM CaCl2, NaCl, KCl, MgCl2, MnCl2, CoCl2, FeCl3, ZnCl2), chemical reagents (1 mM와 5 mM ammonium persulfate,β-mercaptoethanol, EDTA, 1%와 5% SDS, Triton X-100, Tween-20, Tween-80)를 이용하여 효소의 활성을 측정하였다.
재조합 리파아제의 pH에 따른 분해 활성을 확인하기 위하여 여러 pH(3.0−9.0)에서 p-nitrophenyl octanoate (C8)을 기질로 하여 활성을 측정하였다.
재조합 리파아제의 기질에 따른 활성을 분석하기 위하여 여러 chain length (C4−C14)의 p-nitrophenyl ester를 기질로 하여 활성을 측정하였다(Fig. 6).
1 mg/ml lysozyme)로 현탁하여 16℃에서 1시간 반응시키고 원심분리 (20,000 ×g, 15 min 4℃)를 통하여 상층액과 pellet을 분리하였다. 재조합 리파아제의 발현여부를 확인하기 위하여 분리된 cell pellet과 상층액을 SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel)를 통하여 분석하였다[18].
재조합 리파아제의 온도에 따른 분해 활성을 확인 하기 위하여 온도 범위(5−70℃)에서 p-nitrophenyl octanoate (C8)을 기질로 하여 활성을 측정하였다.
0), 500 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10%(v/v) glycerol)로 투석하였다. 정제된 재조합 단백질은 SDS-PAGE (12% polyacryl-amide gel) 분석을 통해 확인하였다.
정제한 리파아제의 특성을 분석하기 위하여 다양한 온도, pH, 기질, metal ions 및 다양한 chemical reagents 대하여 리파아제의 활성을 측정하였다. 리파아제의 최적 활성온도는 상기 기술된 효소 분해활성 buffer를 이용하여 온도 범위(5−70℃)에서 10분간 반응하여 측정하였다.
정제한 리파아제의 활성은 p-nitrophenyl octanoate를 기질로하여 측정하였다[19]. 반응액 900 μl (100 μM pNPO (C8 dissolved in ethanol), 50 mM Tris (pH 8.
증폭한 리파아제 유전자와 pET28a(+) vector를 BamHI (Promega, USA), Hind III (Promega) 제한 효소로 double digestion을 한 후, ligation하여 재조합 plasmid (pET28a/lipase)를 얻었다.
추후 실험을 진행하기 위하여 dialysis buffer (50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoethanol, 10%(v/v) glycerol)로 투석하였다.
대상 데이터
본 연구에서는 저온 활성 리파아제 유전자를 분리하기 위해 극지연구소(Korea)에서 분양받은 Janthinobacterium sp. PAMC25641 (Polar and Alpine Microbial Collection, Korea)균주를 이용하였다. Janthinobacterium sp.
Plasmid는 kanamycin-resistance gene과 6×His-tag, T7 promoter, T7 terminator를 포함한 pET28a(+)를 사용하였다.
리파아제 유전자의 클로닝과 발현을 위한 균주로는 각각 Escherichia coli DH5α(Invitrogen, USA)와 E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs, USA) 균주를 사용하였고, Luria-Bertani (LB), 37℃에서 배양하였다.
PAMC25641의 염색체의 부분 염기서열을 분석한 결과 기존의 보고된 리파아제의 염기서열과 유사한 open reading frame을 확인하게 되었다. 확인된 open reading frame은 총 930개의 염기로 이루어져 있으며, 309개의 아미노산을 암호화한다. 이 단백질의 이론적인 분자량은 약 32.
데이터처리
coli DH5α에 형질전환 하였고 colony PCR, double digestion 및 plasmid DNA sequencing (Macrogen, Korea)을 통해 확인하였다. NCBI Blast program을 통하여 sequencing한 리파아제 유전자와 유사한 염기 서열을 갖는 종을 확인하였고 online PhyML 3.0 program (atgc.lirmm.fr/ phyml)을 이용하여 계통수 분석을 실시하였다. 또한 재조합 리파아제를 발현시키기 위하여 pET28a/lipase plasmid를 E.
실험은 모두 각각 3 반복하여 진행하였으며, 그 값을 평균값과 표준편차로 나타내었다.
이론/모형
5). The phylogenetic tree was constructed by PhyML (version 3.0).
114 mg/ml)를 37℃에서 5분간 반응시켜 유리된 p-Nitrophenol을 405 nm에서 spectrophotometer로 측정하였다. 단백질 농도는 Bradford assay [20]를 통하여 결정하였다.
성능/효과
SDS-PAGE (12% polyacrylamide gel) 분석을 통하여 발현된 단백질을 확인하였다. 16℃에서 재조합 리파아제를 과발현 시킨 결과 대조군과 비교하여 재조합 리파아제가 발현됨을 확인하였다. 특히, 세포파쇄 상층액으로 재조합 리파아제가 가용성 상태로 과발현 됨을 확인하였다(Fig.
재조합 리파아제의 온도에 따른 분해 활성을 확인 하기 위하여 온도 범위(5−70℃)에서 p-nitrophenyl octanoate (C8)을 기질로 하여 활성을 측정하였다. 5℃에서 70℃까지 재조합 리파아제의 분해 활성을 측정한 결과, 35℃에서 최적 활성을 나타냈으며 15℃에서도 최대활성의 60% 이상을 유지하였다(Fig. 4A). 또한, 효소의 열안정성을 확인하기 위하여 5℃에서 70℃ 사이에서 효소를 1시간, 18시간 방치한 후 활성을 측정하였다.
Janthinobacterium sp. PAMC25641의 염색체의 부분 염기서열을 분석한 결과 기존의 보고된 리파아제의 염기서열과 유사한 open reading frame을 확인하게 되었다. 확인된 open reading frame은 총 930개의 염기로 이루어져 있으며, 309개의 아미노산을 암호화한다.
2). SDS-PAGE 분석 결과 예측 분자량인 32.7 kDa과 유사한 약 36.5 kDa에서 단일 밴드를 확인하였다. 용출된 재조합 리파아제는 추후 단백질 특성을 분석하기 위하여 dialysis를 수행하였다.
6). p-nitrophenyl ester 기질 에 대한 활성을 분석한 결과, 본 연구의 재조합 리파아제는 p-nitrophenyl octanoate(C8)에서 최대의 활성을 나타내었다. 또한, 짧은 chain의 p-NP ester (C4)에 대한 활성이 상대적으로 긴 chain인 p-nitrophenyl decanoate (C10) 보다 높은 것으로 나타났다.
0)에서 p-nitrophenyl octanoate (C8)을 기질로 하여 활성을 측정하였다. pH 3.0에서 pH 9.0까지 재조합 리파아제의 활성을 측정한 결과, pH 7.0에서 최대 활성을 나타냈으며 pH 8.0에서는 최대 활성의 90% 이상의 활성을 보였다(Fig. 4B). 또한 효소의 pH에 대한 안정성을 확인하기 위하여 pH(3.
), chemical reagents (1 mM와 5 mM ammonium persulfate,β-mercaptoethanol, EDTA, 1%와 5% SDS, Triton X-100, Tween-20, Tween-80)를 이용하여 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 1 mM CoCl2, ZnCl2 하에서 효소의 활성은 대조군 대비 40% 이하로 감소하였고, 5 mM 하에서는 각각 30%, 20% 이하의 활성을 나타내었다. 나머지 metal ions(1 mM, 5 mM CaCl2, NaCl, KCl, MgCl2, MnCl2, FeCl3)에서는 효소의 활성이 대조군 대비 증가하였다.
Blast를 이용하여 상동성이 높은 15종을 선별하여 multiple sequence alignment와 계통수 분석을 실시하였다. 그 결과, 다른 Janthinobacterium 종의 lipase와 매우 유사한 상동성을 나타내었다(Fig. 1). 또한, SignaIP 4.
또한, 짧은 chain의 p-NP ester (C4)에 대한 활성이 상대적으로 긴 chain인 p-nitrophenyl decanoate (C10) 보다 높은 것으로 나타났다. 기질로써 p-NP butyrate를 사용할 경우 리파아제의 상대적 활성이 80%까지 가졌으나, decanoate, dodecanoate, myristate 등을 지질로 사용할 경우에는 상대적 활성은 20% 이하의 값을 보였다. 이러한 짧은 chain p-NP ester에 대한 상대적 활성이 높은 것은 리파아제의 일반적인 특성으로, 본 연구에서 사용된 Janthinobacterium sp.
특히 1%, 5%의 SDS 하에서는 효소의 활성이 급격히 감소함을 확인하였다. 또한 detergent인 Triton X-100, Tween-20, Tween-80은 1% 처리하였을 때 효소의 활성을 증가시켰지만 5% 처리하였을 때 Tween-20을 제외한 나머지 detergents는 효소의 활성을 감소 시켰다. metal-chelating agent인 EDTA를 처리하였을 때에는 1 mM, 5 mM 모두 효소의 활성을 증가시켰다(Table 1).
p-nitrophenyl ester 기질 에 대한 활성을 분석한 결과, 본 연구의 재조합 리파아제는 p-nitrophenyl octanoate(C8)에서 최대의 활성을 나타내었다. 또한, 짧은 chain의 p-NP ester (C4)에 대한 활성이 상대적으로 긴 chain인 p-nitrophenyl decanoate (C10) 보다 높은 것으로 나타났다. 기질로써 p-NP butyrate를 사용할 경우 리파아제의 상대적 활성이 80%까지 가졌으나, decanoate, dodecanoate, myristate 등을 지질로 사용할 경우에는 상대적 활성은 20% 이하의 값을 보였다.
본 연구에서의 리파아제는 저온에서 높은 활성을 유지하지만 온도가 상승함에 따라서 활성이 급격히 감소하였다.
여러 chemical reagents를 처리하였을 때 효소의 활성을 측정한 결과, reducing agent인 β-mercaptoethanol에서는 1 mM, 5 mM 처리하였을 때 효소의 활성이 감소함을 확인하였다.
재조합 리파아제의 열안정성 분석을 통하여 5−15℃에서 최대활성의 80% 이상을 유지하는 것으로 보아 본 연구에서 분리한 재조합 리파아제가 저온성 효소임을 확인하였다.
용출된 재조합 리파아제는 추후 단백질 특성을 분석하기 위하여 dialysis를 수행하였다. 정제된 재조합 리파아제의 활성은 107.9Unit/mg protein로 확인되었다.
여러 chemical reagents를 처리하였을 때 효소의 활성을 측정한 결과, reducing agent인 β-mercaptoethanol에서는 1 mM, 5 mM 처리하였을 때 효소의 활성이 감소함을 확인하였다. 특히 1%, 5%의 SDS 하에서는 효소의 활성이 급격히 감소함을 확인하였다. 또한 detergent인 Triton X-100, Tween-20, Tween-80은 1% 처리하였을 때 효소의 활성을 증가시켰지만 5% 처리하였을 때 Tween-20을 제외한 나머지 detergents는 효소의 활성을 감소 시켰다.
16℃에서 재조합 리파아제를 과발현 시킨 결과 대조군과 비교하여 재조합 리파아제가 발현됨을 확인하였다. 특히, 세포파쇄 상층액으로 재조합 리파아제가 가용성 상태로 과발현 됨을 확인하였다(Fig. 1). 재조합 리파아제를 정제하기 위해 세포파쇄 상층액을 Ni-NTA resin에 결합시킨 후 350 mM Imidazole이 포함된 buffer를 이용하여 용출하였다(Fig.
효소의 pH에 대한 안정성을 확인한 결과, 1시간 방치하였을 때 pH(5.0−7.0)에서 최대 활성의 90% 이상을 유지하였다.
효소의 열안정성을 확인한 결과 1시간 후에는 35℃내에서 최대 활성의 80%를 유지하였지만, 18시간 배양후에 활성을 측정한 결과 5−15℃에서는 최대 활성의 80% 이상을 유지하였지만 15℃ 이상의 온도에서는 효소의 활성이 급격히 감소함을 확인하였다(Fig. 5A).
후속연구
이는 온도에 의해 효소가 쉽게 불활성화 됨을 의미한다. 따라서 본 연구에서 사용된 리파아제는 반응 이후에 상대적으로 낮은 온도에서도 쉽게 불활성화가 되어 효소활성을 억제해야 하는 부수적인 공정을 단순화 할 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
산업적으로 이용되는 리파이제는 무엇에 의해 생산되나?
또한 산업적으로 이용되는 리파이제는 주로 곰팡이와 박테리아 같은 미생물에 의해서 생산되는데 그 기원에 따라 생산되는 리파아제의 종류에 따라 효소의 특성이 매우 다양하기 때문에 미생물에서 유래한 리파아제는 산업적으로 이용하기에 매우 유용하다[5, 6].
리파아제는 무엇인가?
1.3)는 글리세롤 에스테르 가수분해 효소로서 트리아실글리세롤(triacylglycerol)을 유리 지방산 및 글리세롤로 가수 분해하는 효소이다. 리파아제(lipase)는 트리글리세라이드의 가수분해 활성 뿐만 아니라 에스테르화, 에스테르 교환 반응, 산분해, 알코올 분해 및 아미노 분해를 촉진한다.
저온 생장 균주에서 분리한 효소를 유전자 재조합 기술을 통해 대장균과 같은 균주에서 대량생산 할 수 있는 방안에 대한 연구가 필요한 이유는?
그러나 저온 환경에서 생장하는 미생물은 성장 속도가 느리고 그로부터 생산할 수 있는 리파아제는 제한적이다. 따라서 저온 생장 균주에서 분리한 효소를 유전자 재조합 기술을 통해 대장균과 같은 균주에서 대량생산 할 수 있는 방안에 대한 연구가 필요하다[17].
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