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문제 정의
- 옹저는 몸에 생긴 종기를 의미하며 옹저문에는 종기가 생기는 원인, 각종 종기의 종류, 종기의 치료법이 있다. 그 외에도 염증 억제와 관련된 효능을 찾아볼 수 있는데 본 연구에서는 오미자 씨앗오일이 LPS에 의해 자극된 Raw 264.7 macrophase에서 활성화되는 염증관련 인자들의 생성량을 확인함으로 오미자 씨앗오일의 항염증 효능효과를 확인하였다. 대식세포는 cytokine, TNF-α, LPS와 같은 자극 물질에 의해 염증반응의 전사인사인 NF- κB를 활성화시키고 그 결과, 발현된 iNOS, COX-2에 의해 과량의 NO와 PGE2가 생성되어 염증이 유발된다10, 11).
- 본 연구에서는 오미자 씨앗오일(SSO)의 항염증 활성을 조사하기 위하여 LPS 자극에 의해 유도된 Raw264.7의 염증반응에서 SSO의 염증매개인자와 염증매개 효소와의 작용기전을 확인 하였다. 이상의 실험결과 SSO가 세포독성이 경미하면서 염증과 관련된 인자인 NO, IL-1β, PGE2의 생성 억제와 iNOS, COX-2 단백질 억제능의 결과가 유의성이 있음을 시사하였다.
- 오미자에 대한 연구는 해독작용, 항균작용, 항산화작용 등이 보고되고 있으며, 최근 오미자 씨에서 추출된 유지의 성분에서 항산화효능 등, 일부 연구가 진행되어 긍정적인 결과가 도출되었으나, 아직 시작단계에 불과하다. 본 연구에서는 오미자씨앗 오일의 항염증 효과를 검토하기 위하여 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에 오미자씨앗 오일을 처리하여 염증매개 물질인 NO, PGE2, IL-1β의 생성 및 염증매개 효소인 iNOS 및 COX-2의 발현을 조사하여 효능과 유의성을 검토하였다.
제안 방법
- 1차항체를 희석하여 2시간 동안 반응한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 membrane을 HRP가 중합된 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 60분 동안 반응시켰다. 3회 washing 한 뒤 Davinch-k western imaging system 기기를 이용하여 분석하였다.
- NO 생성량은 96 well plate에 세포 배양 상등액과 Griess reagent를 1:1로 혼합하여 넣고 10분 동안 반응 시킨 후 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 96 well plate 세포 배양 상등액 내의 PGE2, cytokine(IL-1β)의 생성량은 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량해 분석하였다.
- LPS로 자극된 RAW 264.7 cell에서 오미자 씨앗오일의 NO 생성 억제능을 측정하기위해 RAW 264.7 세포(2×105 cells/mL)를 6 well plate에 seeding 하고 24시간 뒤, 오미자 씨앗오일을 0∼500 µg/mL의 농도가 되도록 세포배양배지로 희석하여 200µg 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator 에서 24시간 염증 반응을 유도하였다. 대조군은 시료와 동량의 DMEM을 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
- 7 세포(2×105 cells/mL)를 96 well plate에 seeding 하고 24시간 뒤, 오미자 씨앗오일을 0∼500 µg/mL 의 농도가 되도록 세포배양배지로 희석하여 20µg 첨가한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 염증 반응을 유도하였다. 대조군은 시료와 동량의 DMEM을 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 무혈청 배지로 교체한 후 MTT(5mg/mL) 용액 20µg를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO : Ethanol (1 : 1) 150µg를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 대조군은 시료와 동량의 DMEM을 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 무혈청 배지로 교체한 후 MTT(5mg/mL) 용액 20µg를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO : Ethanol (1 : 1) 150µg를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 대조군에 대한 흡광도의 차를 백분율로 표시하여 비교분석하였다.
- 본 실험에서는 LPS로 자극된 Raw 264.7 대식세포에서 오미자 씨앗오일의 세포독성 및 항염증 효과를 확인하였으며, 실험을 통하여 분석한 결과 아래와 같은 결론을 얻었다.
- 무혈청 배지로 교체한 후 MTT(5mg/mL) 용액 20µg를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO : Ethanol (1 : 1) 150µg를 가하여 실온에서 30분간 반응 시킨 뒤 ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율 측정은 대조군에 대한 흡광도의 차를 백분율로 표시하여 비교분석하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA) 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD Bioscience (Sanjose, CA, USA) COX-2 Cayman (Ann Arbor, MI, USA), β-actin (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit Ig-G horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였으며, PGE2 측정을 위한 ELISA kit는 (R&D systems Inc., Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였으며, 그 외 각종 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 오미자(五味子)는 경북 문경에서 2014년 9월∼10월 채취한 오미자 열매에서 과육을 제거하고 씨앗 부분을 냉풍 건조하여 냉 압착오일추출기를 이용하여 추출한 후슬러지를 제거하여 실험재료로 사용하였다.
- 염증반응을 실험하기 위하여 사용한 세포주는 macrophage인 Raw 264.7(KCLB No 40071)를 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체배지는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin 250, 0.
- 7(KCLB No 40071)를 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체배지는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin 250, 0.4% trypan blue staine Gibco (New York, USA)에서 구입하여 사용하였다. sodium nitrite, griess reagent, lipopolysaccharide, NP-40, protease inhibitor, RIPA buffer 등은 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차(SD)를 구하여 신뢰수준 95%(*p<0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- iNOS와 COX-2의 세포 내 발현은 Western blot을 이용하여 측정하였다. 세포를 1X PBS로 2회 세척 후 RIPA buffer (serine protease, protease and phosphatase inhibitor cocktail; Genedepot USA) 100µg로 4℃에서 10분간 cell lysis 하고 4℃ 12,000rpm에서 15분간 원심 분리 하였다.
- 세포 생존율 측정은 Camichael8)의 방법에 따라 측정하였다. RAW 264.
성능/효과
- 1. SSO의 샘플처리 농도에 따른 macrophage cells 생존율을 확인한 결과 SSO 0∼500 µg/mL에서 96.9% 이상의 세포 생존률을 확인하였다. 이 결과는 오미자 씨앗 오일의 세포독성이 현저히 낮음을 확인할 수 있는 결과이다.
- 2. SSO의 NO 생성 억제능을 확인한 결과, 500 µg/mL에서 70.3%의 억제능을 확인 하였으며, 50 µg/mL, 10 µg/mL 농도에서 각 37.6%, 26.5%와 같이 농도의 존적임을 확인할 수 있다.
- 3. SSO의 IL-1β 생성 억제능을 확인한 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 각 49.88%, 48.8%의 IL-1β 억제능을 확인할 수 있다.
- 4. SSO의 PGE2의 생성 억제능를 확인한 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL농도에서 각 73.1%, 70.5%의 PGE2 억제능을 확인할 수 있다.
- 5. SSO의 iNOS 단백질 발현 억제능 측정 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 45.3%, 31.6% 처럼 현저하게 억제됨을 확인 하였다.
- 6. SSO의 COX-2 단백질 발현 억제효과 측정 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 89.6%, 81.8%의 우수한 억제능을 확인 하였다.
- 정유 성분은 주성분이 terpene류 로서 특히 monoterpene과 sesquiterpene이 90% 이상을 차지하는데 오미자에서는 caryophyllene, calarene, cubebene, acoradiene과 β-himachalene 등 성분의 함유량이 높다.7) 지방산은 불포화 지방산인 linoleicacid, oleicacid와 포화지방산인 palmiticacid의 함량이 많으며, 불포화지방산이 포화지방산보다 3배 이상 많아 지방산 조성이 우수하다. 오미자에 대한 연구는 해독작용, 항균작용, 항산화작용 등이 보고되고 있으며, 최근 오미자 씨에서 추출된 유지의 성분에서 항산화효능 등, 일부 연구가 진행되어 긍정적인 결과가 도출되었으나, 아직 시작단계에 불과하다.
- 이를 통해 오미자 씨앗오일이 LPS에 의해 유도되는 산화질소와 관련된 iNOS의 유전자 단백질의 발현량을 감소시켜 세포 내의 산화질소의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다. COX-2 단백질발현량을 확인한 결과, iNOS와 마찬가지로 LPS만 단독으로 처리한 군에서 그 발현량이 급증한 것을 확인하였다. 그러나 오미자 씨앗오일을 처리하였을 때, 농도인 500 µg/mL, 100 µg/mL를 처리한 실험 군에서만 COX-2 단백질의 발현 량이 89.
- 있다. LPS로 유도된 Raw 264.7 Cells에 오미자 씨앗 오일 농도별 (1, 5, 10, 50, 100, 500 µg/mL) 처리하여 상등액속에 있는 NO의 양을 측정한 결과, 500 µg/mL에서 70.3%의 NO 저해활성을 확인 하였으며, 50 µg/mL, 10 µg/mL 농도에서 각 37.6%, 26.5% NO 저해활성과 같이 농도 의존적임을 확인 할 수 있다(Fig. 2).
- SSO의 COX-2 protein 발현 억제효과 측정 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 89.6%, 81.8%의 생합성 효소 발현 억제 능을 확인 하였다. Fig.
- COX-2 단백질발현량을 확인한 결과, iNOS와 마찬가지로 LPS만 단독으로 처리한 군에서 그 발현량이 급증한 것을 확인하였다. 그러나 오미자 씨앗오일을 처리하였을 때, 농도인 500 µg/mL, 100 µg/mL를 처리한 실험 군에서만 COX-2 단백질의 발현 량이 89.6%, 81.8% 농도 의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. COX-2는 핵 내로 이동하여 전사인자로써 작용하는 NF-κB의 활성에 의해 합성이 이루어지는 것으로 알려져 있다13, 14).
- COX-2는 핵 내로 이동하여 전사인자로써 작용하는 NF-κB의 활성에 의해 합성이 이루어지는 것으로 알려져 있다13, 14). 그리고 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현량을 500 µg/mL의 농도에서 49.88%, 48.8%감소시켰으며 시료의 처리 농도에 따라 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 오미자 씨앗오일은 염증매개인자를 합성하는 효소인 iNOS, COX-2의 단밸질의 발현을 억제하고, NO, IL-1β, PGE2와 같은 염증질환의 주요 매개물의 생성을 억제하여 항염증 활성을 유도하는 것으로 사료되었다.
- 본 연구를 통하여 오미자 씨앗오일은 염증매개인자를 합성하는 효소인 iNOS, COX-2의 단밸질의 발현을 억제하고, NO, IL-1β, PGE2와 같은 염증질환의 주요 매개물의 생성을 억제하여 항염증 활성을 유도하는 것으로 사료되었다. 또한 오미자 씨앗오일에서 COX-2단백질과 PGE2 생성억제와의 관계 및 iNOS 단백질과 NO 생성억제와의 관계에 에 유의성이 있음을 확인 하였다.
- 8%감소시켰으며 시료의 처리 농도에 따라 농도 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 오미자 씨앗오일은 염증매개인자를 합성하는 효소인 iNOS, COX-2의 단밸질의 발현을 억제하고, NO, IL-1β, PGE2와 같은 염증질환의 주요 매개물의 생성을 억제하여 항염증 활성을 유도하는 것으로 사료되었다. 또한 오미자 씨앗오일에서 COX-2단백질과 PGE2 생성억제와의 관계 및 iNOS 단백질과 NO 생성억제와의 관계에 에 유의성이 있음을 확인 하였다.
- 1). 시료를 첨가하지 않고 DMEM을 동일 농도로 처리한 대조군과 비교 했을 때 생존률의 차이는 10% 미만 이였다. 이 결과는 오미자 씨앗 오일의 세포독성이 현저히 낮음을 확인할 수 있는 결과이다.
- 염증반응의 지표인 산화질소를 생성하는 효소인 iNOS의 유전자 발현에 대하여 연구를 진행한 결과 iNOS 단백질은 LPS만 단독으로 처리한 군에서 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 발현 량이 증가한 것을 확인하였다. 여기에 오미자 씨앗오일을 농도별로 처리하였을 때, 그 발현 량이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 오미자 씨앗오일이 LPS에 의해 유도되는 산화질소와 관련된 iNOS의 유전자 단백질의 발현량을 감소시켜 세포 내의 산화질소의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다.
- COX-2는 arachidinic acid를 PGs로 전환하는 효소이며, 염증매개 물질인 프로스타글란딘(prostaglandin)을 합성하는 효소이다12). 염증반응의 지표인 산화질소를 생성하는 효소인 iNOS의 유전자 발현에 대하여 연구를 진행한 결과 iNOS 단백질은 LPS만 단독으로 처리한 군에서 아무것도 처리하지 않은 군에 비해 발현 량이 증가한 것을 확인하였다. 여기에 오미자 씨앗오일을 농도별로 처리하였을 때, 그 발현 량이 감소함을 확인하였다.
- -1 β와 COX-2등에 의해 생성된다. 오미자 씨앗 오일에서 PGE2 의 생성억제 효과를 확인한 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 각 73.1%, 70.5%의 PGE2 저해능을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- 오미자 씨앗 오일의 샘플처리 농도에 따른 Raw 26.47 cell의 세포 생존율을 MTT법에 의해 확인한 결과 SSO는 1∼500 µg/mL의 농도까지 95% 이상의 생존률을 확인하였다 (Fig. 1). 시료를 첨가하지 않고 DMEM을 동일 농도로 처리한 대조군과 비교 했을 때 생존률의 차이는 10% 미만 이였다.
- 외부자극이나 pro-inflammatory cytokine 등에 의해 자극을 받게 되면 다량의 NO를 생산하는 iNOS 단백질 발현에 대한 SSO의 억제효과를 Western blot에 의해 측정한 결과, 500 µg/mL, 100 µg/mL 농도에서 45.3%, 31.6% 와 같이 처리된 SSO의 농도 의존적으로 40% 이상 현저하게 억제됨을 확인 하였다. Fig.
- 시료를 첨가하지 않고 DMEM을 동일 농도로 처리한 대조군과 비교 했을 때 생존률의 차이는 10% 미만 이였다. 이 결과는 오미자 씨앗 오일의 세포독성이 현저히 낮음을 확인할 수 있는 결과이다. 이후 실험은 96.
- 여기에 오미자 씨앗오일을 농도별로 처리하였을 때, 그 발현 량이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 오미자 씨앗오일이 LPS에 의해 유도되는 산화질소와 관련된 iNOS의 유전자 단백질의 발현량을 감소시켜 세포 내의 산화질소의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다. COX-2 단백질발현량을 확인한 결과, iNOS와 마찬가지로 LPS만 단독으로 처리한 군에서 그 발현량이 급증한 것을 확인하였다.
- 7의 염증반응에서 SSO의 염증매개인자와 염증매개 효소와의 작용기전을 확인 하였다. 이상의 실험결과 SSO가 세포독성이 경미하면서 염증과 관련된 인자인 NO, IL-1β, PGE2의 생성 억제와 iNOS, COX-2 단백질 억제능의 결과가 유의성이 있음을 시사하였다.
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