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문제 정의
- 본 논문에서는 옥돔의 장내세균의 다양성에 관하여 연구를 하였다. 1차 적으로 평판배지상 colony의 모양, 색깔 등 형태학적 특징을 육안으로 구분하여 옥돔의 장내로부터 분리된 colony의 수는 다음과 같이 나타났다(Table 1).
- 본 연구에서는 옥돔 장내에 서식하는 장내세균군집의 다양성에 대하여 연구하였다. 이러한 연구는 최근 꾸준히 양식시도가 이루어지고 있는 옥돔의 상품성 가치를 위한 원활한 성장, 먹이, 질병예방 등 다양한 연구방면에 있어 필요한 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.
- 장내미생물은 매우 광범위하고 배양조건이 까다롭기 때문에 분리에 한계가 있지만 본 연구에서는 옥돔에서 분리된 장내세균군의 일부분이라도 유전적 자원의 다양성 확보 차원에서 의의를 두고 기초자료로 활용되길 바라며 본 실험을 진행하였다. 그 결과, 연구를 통해 얻은 장내세균군 중 일부 속은 프로바이오틱 균주로서의 효과 및 항균기능에 대하여 보고된바 있으며[1, 3, 20, 30], 또한 기존 어류 장내세균군 연구에서 비교적 보고가 적었던 Cyclobacteriaceae, Deinococcaceae 가 분리 됨으로써 앞으로 옥돔의 장내세균으로부터 신균주의 가능성과 기능 및 여러 가능성에 대하여 추가적인 연구가 이뤄져야할 것이다.
제안 방법
- 추출된 균주의 16S rDNA유전자 증폭을 위해 primer는 27 Forward primer (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492 Reverse primer (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 초기 변성 4분, 94℃에서 변성 1분간 수행하였고, 55℃에서 1분간 결합단계를 지나, 72℃에서 합성 1분으로 총 30회 반복하였으며, 72℃에서 5분간 최종 합성을 수행하여 PCR (US/MYGein32, MJ RESEARCH, USA)을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.
- net/)의 database를 이용하여 염기서열의 quality를 비교한 후각 균주마다 가장 근연속 또는 종으로 나타나는 서열을 확인 하였다. 결정된 염기서열과 database에서 확인한 표준 미생물 염기서열을 ClustalW software로 multiple alignment를 수행 하고 Mega 6.0 software 프로그램을 이용하여 Alignment 수행 후 Neighbor joining phylogenetic tree를 작성하였다.
- 5% Sodium chloride를 첨가하였고, 다른 영양성분의 증식배지 Tryptic Soy Agar, 해양미생물 전용배지 Marine Agar, 빈영양세균 증식배지인 R2A Agar (BHIA, TSA, MA, R2A, Difco, USA)에평판 도말법을 이용하여 25℃에서 7일간 Incubator (JSGI-100T, JSR, Korea)에서 일반 배양을, CO2 Incubator (MC5-15AC, Sanyo, Japan)에서 혐기배양하였다. 그 뒤 배지상에 나타나는 균의 크기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰하여 순수분리 하였으며, 옥돔의 장내 균체수는 CFU/g- 1 단위로 환산하였다. 각각 분리된 균주의 균체를 24%(v/v) glycerol에현탁 한 뒤, -85℃에 보관하였다.
- 그 뒤 homogenizer로 균질화하여 잘 현탁되도록 voltexing 해준 뒤 1 g을 넣고 10 -1 ~10 -5 배로 단계희석 하였다. 그 뒤 일반 증식배지로 사용되는 Brain Heart Infusion Agar에 해산어인 옥돔을 고려하여, 1.5% Sodium chloride를 첨가하였고, 다른 영양성분의 증식배지 Tryptic Soy Agar, 해양미생물 전용배지 Marine Agar, 빈영양세균 증식배지인 R2A Agar (BHIA, TSA, MA, R2A, Difco, USA)에평판 도말법을 이용하여 25℃에서 7일간 Incubator (JSGI-100T, JSR, Korea)에서 일반 배양을, CO2 Incubator (MC5-15AC, Sanyo, Japan)에서 혐기배양하였다. 그 뒤 배지상에 나타나는 균의 크기, 모양, 색깔 등 형태학적 모습을 관찰하여 순수분리 하였으며, 옥돔의 장내 균체수는 CFU/g- 1 단위로 환산하였다.
- 증폭된 16S rDNA는 ㈜제노텍(Daejeon, Korea)에 분석의뢰하였다. 도출된 염기서열은 미국 국립생물정보센터 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search program에서 Genbank database와 Ezbiocloud (https://www.ezbiocloud.net/)의 database를 이용하여 염기서열의 quality를 비교한 후각 균주마다 가장 근연속 또는 종으로 나타나는 서열을 확인 하였다. 결정된 염기서열과 database에서 확인한 표준 미생물 염기서열을 ClustalW software로 multiple alignment를 수행 하고 Mega 6.
- 옥돔으로부터 장내세균의 분리를 위해 내장을 척출하여 내용물을 제거한 후 멸균된 증류수에 세척한 뒤 멸균된 0.85% 생리식염수에 현탁하였다. 그 뒤 homogenizer로 균질화하여 잘 현탁되도록 voltexing 해준 뒤 1 g을 넣고 10 -1 ~10 -5 배로 단계희석 하였다.
- 옥돔의 내장으로부터 분리된 균주의 분자생물학적 동정을 위해 Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, USA)를 사용하여 protocol에 따라 수행하여 DNA를 추출하였다. 추출된 균주의 16S rDNA유전자 증폭을 위해 primer는 27 Forward primer (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492 Reverse primer (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다.
- 증폭된 16S rDNA는 ㈜제노텍(Daejeon, Korea)에 분석의뢰하였다. 도출된 염기서열은 미국 국립생물정보센터 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search program에서 Genbank database와 Ezbiocloud (https://www.
- 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose가 첨가된 Gel에 0.5 μg/ml ethidium bromide (EtBr)로 염색한 후 전기영동하여 band를 확인하였다.
- 추출된 균주의 16S rDNA유전자 증폭을 위해 primer는 27 Forward primer (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492 Reverse primer (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 시료어는 제주특별자치도 서귀포시 대정읍 태흥리 인근 연안에서 연안연승어획 방법으로 채집된 옥돔 5마리를 사용하였다. 채집한 옥돔은 바로 4℃에 보관 운송하였다.
- 본 연구에 사용된 옥돔은 평균체장 24.5±1.0 cm, 평균체중 230±10 g의 어체를 사용하였다.
성능/효과
- 1.5% BHIA배지에서는 4.8×10 6 CFU/g- 1 으로 가장 높은 colony 수를 나타냈고, 그 외 MA 3.8×10 6 CFU/g- 1 , TSA 4.8×10 5 CFU/g- 1 및 R2A 1.6×10 4 CFU/g- 1 로 나타났다.
- Proteobacteria문은 95-100%의 상동성을 나타내었다. Alphaproteobacteria 그룹은 Rhodobacteraceae 87.5%, Erythrobacteraceae 12.5%로 구성되었으며, 총 2과로 8속 8종으로 분리되었다. Gamma-proteobacteria 그룹은 97-100%의 상동성을 나타 내었으며, Moraxellaceae 76%, Shewanellae 8%, Halomondacea, Enterobacteriaceae이 각각 6%, Vibrionaceae 2%, Hahellaceae, Pseudomonadceae이 각각 1%로 구성되었으며, 총 7과로 27속 27종이 분리되었다.
- Bacteroide문 분류군은 97-99%의 상동성을 나타냈으며, Cyclobacteriaceae 60%, Flavobacteriaceae 40%로 나타났다. 총 2과로 3속 3종으로 분리되었다.
- 총 2과로 3속 3종으로 분리되었다. Deinococcus-themus문 분류군은 유사도가 98%로 나타났으며 단독 Deinococcaceae 1과 1속 1종의 균주가 분리되었다. Deinococcaceae 속은 저온, 건조 및 방사 선에 내성을 갖고있는 균주로 다양한 환경에 분포하나, 어류의 장내유래 분리 연구결과는 거의 희박하다[26].
- 5%로 구성되었으며, 총 2과로 8속 8종으로 분리되었다. Gamma-proteobacteria 그룹은 97-100%의 상동성을 나타 내었으며, Moraxellaceae 76%, Shewanellae 8%, Halomondacea, Enterobacteriaceae이 각각 6%, Vibrionaceae 2%, Hahellaceae, Pseudomonadceae이 각각 1%로 구성되었으며, 총 7과로 27속 27종이 분리되었다. 그 중 Moraxellaceae 속의 Psychrobacter 종이 가장 높은 우점도를 나타냈으며 잉어류, 연어류, 대구 및넙치의 장의 주요 우점균 결과와 일치한다[7, 9, 10, 17].
- Proteobacteria (Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria)가 50%로 가장 우점도가 높았고, Actinobaceria 24%, Firmicutes 16%, Bacteroides 6% 및 Deinococcus-thermus 4%로 각각 나타났다.
- 주요 우점 과로 Microbacteriaceae 54%, Intrasporangiaceae 16%, Dietziaceae 13%, Dermabacteraceae 5%, Dermacoccaceae, Nocardioidaceae, Brevibacteriaceae, Propionobacteriaceae이 각각 3%로 나타났으며, 총 8과 11속 17종이 분리되었다. 그 중 Microbacteriaceae과의 Arthrobacter 속이 8균주로 가장 높은 우점도를 나타냈다. 해양퇴적층 또는 수중에 널리 퍼져있으며, 대다수의 해양생물로부터 기본적으로 분리되는 균군 중 하나이다[8, 11, 12, 27, 28].
- 다른 두 배양 조건 모두 일반 증식배지인 1.5% BHIA에서 가장 많은 colony 개수가 나타났다. 이런 결과는 이전 연구결과 넙치, 볼락, 송어 등 어류로부터 독립영양세균인 Pseudomonas, Achromobacter 등 MA배지에서 많은 colony 개수가 관찰된 사례와는 다르다[9, 11-14].
- 또한 이번 옥돔에서 분리된 그 외 균주 중 환경유해성 내성 균주, 수중세균, 방선균, 유산균 등을 다양한 균을 확인 할 수있었으며, 이와 같은 결과는 환경과 배양조건에 따라 옥돔의 장내 세균군이 다양하게 분포하는 것을 나타낸다.
- 2×10 3 CFU/g- 1 로 나타났다. 배양 환경 조성의 차이에서 colony 개수는 호기배양이 더 높게 나타났으나, 혐기배양에는 비교적 다양한 균주가 배양되는 차이를 보였다.
- 6×10 4 CFU/g- 1 로 나타났다. 배지마다 colony 개수 차이는 있었으나 균 종류가 크게 다르지 않고 유사성이 높았다.
- Proteobacteria 중 대부분의 해산어는 Moraxellaceae, 담수어는 Aeromonadaceae가 비중이 높게 나타났다[11-13, 15, 17, 21, 22, 24, 29, 31, 32]. 본 연구결과 옥돔에서도 주요 우점 문이 Proteobacteria로 동일하게 나타났다. 같은 도미과인 자리돔의 경우 Gamma-proteobacteria 문이 가장 큰 비중을 차지하였으며, Moraxellaceae, Rhodobacteraceae, Vibrionaceae, Hahellaceae, Shewanellaceae 등 대부분의 과가 옥돔과 유사하게 나타났다[24].
- 옥돔의 장내로부터 순수분리된 147 colony의 16S rDNA Sequence을 바탕으로 NBLAST program, Ezbiocloud를 분석 하여 도출한 결과 크게 5문 58속 73종으로 나타났다(Table 2). 가장 근연속 또는 종으로 나타난 서열을 다음과 같이 계통수로 나타내었다(Fig.
- 이는 종속영양세균인 장내세균의 특성을 나타내는 결과로 사료된다. 이로써, 옥돔의 장내세균의 분리 및 다양성 연구에 있어 배지의 구성성분이 어느정도 영향을 미치는 것으로 사료 되며, 최적의 배지는 1.5% Sodium chloride가 첨가된 BHIA로나타났다.
- Actinobateria 문 분류군은 96-100%의 상동성을 나타냈다. 주요 우점 과로 Microbacteriaceae 54%, Intrasporangiaceae 16%, Dietziaceae 13%, Dermabacteraceae 5%, Dermacoccaceae, Nocardioidaceae, Brevibacteriaceae, Propionobacteriaceae이 각각 3%로 나타났으며, 총 8과 11속 17종이 분리되었다. 그 중 Microbacteriaceae과의 Arthrobacter 속이 8균주로 가장 높은 우점도를 나타냈다.
- Firmicutes문 분류군은 95-99%의 상동성을 나타냈다. 주요 우점과로 Bacillaceae 44%, Staphylcoccaceae 24%, Planococcaceae 16%, Streptococcaceae 8%, Paenibacillaceae, Clostridiaceae이각각 4%로 나타났으며, 총 6과로 8속 17종이 분리되었다. 그중 Bacillus 속이 가장 높은 우점도를 나타냈으며, B.
- Bacteroide문 분류군은 97-99%의 상동성을 나타냈으며, Cyclobacteriaceae 60%, Flavobacteriaceae 40%로 나타났다. 총 2과로 3속 3종으로 분리되었다. Deinococcus-themus문 분류군은 유사도가 98%로 나타났으며 단독 Deinococcaceae 1과 1속 1종의 균주가 분리되었다.
- 이런 결과는 이전 연구결과 넙치, 볼락, 송어 등 어류로부터 독립영양세균인 Pseudomonas, Achromobacter 등 MA배지에서 많은 colony 개수가 관찰된 사례와는 다르다[9, 11-14]. 해양미생물 증식에 최적화된 주요성분이 무기염으로 이루어진 MA보다 다양한 영양분이 필요한 장내환경에 따라 Glucose, Peptone, Animals tissue 등고영양분이 많은 1.5% BHIA가 더 많은 colony 계수를 나타냈다. 이는 종속영양세균인 장내세균의 특성을 나타내는 결과로 사료된다.
- Hahellaceae과의 Halomonas 종은 주로 먹이가 갑각류인 성어의 내장에서 분리된다[27]. 혐기배양 조건 하 분리 및 분석된 염기 서열은 Citriobacter, Endozoicomonas, Shewanella 종으로 나타났다. 모두 통성혐기성균으로 넙치, 고등어 내장에서 분리되었으며, 프로바이오틱 균주로의 가능성도 보고되었다[30].
후속연구
- 장내미생물은 매우 광범위하고 배양조건이 까다롭기 때문에 분리에 한계가 있지만 본 연구에서는 옥돔에서 분리된 장내세균군의 일부분이라도 유전적 자원의 다양성 확보 차원에서 의의를 두고 기초자료로 활용되길 바라며 본 실험을 진행하였다. 그 결과, 연구를 통해 얻은 장내세균군 중 일부 속은 프로바이오틱 균주로서의 효과 및 항균기능에 대하여 보고된바 있으며[1, 3, 20, 30], 또한 기존 어류 장내세균군 연구에서 비교적 보고가 적었던 Cyclobacteriaceae, Deinococcaceae 가 분리 됨으로써 앞으로 옥돔의 장내세균으로부터 신균주의 가능성과 기능 및 여러 가능성에 대하여 추가적인 연구가 이뤄져야할 것이다.
- 본 연구에서는 옥돔 장내에 서식하는 장내세균군집의 다양성에 대하여 연구하였다. 이러한 연구는 최근 꾸준히 양식시도가 이루어지고 있는 옥돔의 상품성 가치를 위한 원활한 성장, 먹이, 질병예방 등 다양한 연구방면에 있어 필요한 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.
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