선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러나 아직 흑미의 흑모와 관련 있는 melanin 생성에 관한 연구는 진행되지 않아 보다 심층적인 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 흑미 주정 추출물을 이용하여 흑모촉진 효과를 알아보고자 한다.
- 본 실험에서는 BLEE가 항산화에 관여하는 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여 Western blot을 수행하였다. Fig.
- 본 실험에서는 BLEE의 항산화 효과에 대해 조사하였다. 먼저 BLEE의 DPPH radical 소거능을 알아보기 위하여 DPPH radical scavenging assay를 수행하였다.
- 본 실험에서는 in vitro 상에서 melanin 생성 초기단계의 속도를 결정시키는 촉매인 tyrosinase의 활성과 L-DOPA를 melanin합성에 대한 BLEE의 효과를 측정하기 위해 실험을 수행하였다. 첫째로 tyrosinase의 활성을 조사해 본 결과 Fig.
- 본 연구에서는 BLEE가 백모에서 흑모로 전환되는데 관련 되어 있는 melanin 합성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 사람은 연령이 증가함에 따라 노화가 진행되면서 모낭에 있는 melanocyte 수가 감소됨과 동시에 세포활성이 저하되어 결국 melanin 합성의 감소로 흑모가 백모로 전환되게 된다[13].
- cAMP는 전사 인자로 알려진 CREB를 인산화 할 수 있는 PKA를 활성화시키 고 CREB가 인산화 되면 melanin 생성을 촉진하는 tyrosinase 프로모터에서 box 및 E-box 모티프에 결합하는 MITF를 상향 조절하게 된다[8]. 본 연구에서는 위 세 가지의 양성대조군과 천연물인 흑미 주정추출물을 비교하여 흑미가 melanin 생성에 미치는 영향을 알아보고자 한다. 흑미는 anthocyanin류를 포함하고 있으며 항 혈소판 효과와 항 염증 효과가 있는 항산 화제로 심장혈관 위험을 줄일 수 있다고 알려져 있으며, 또한 흑미에 포함된 anthocyanins 성분 중 3-glucoside와 peonidin 3-glucoside는 low density?lipoprotein (LDL)의 산화적 변형을 억제시킨다[6].
제안 방법
- B16F1 세포에 용출 완충용액(50 mM Tris?HCl, pH 7.5, 0.4% Nonidet P-40, 120 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2 , 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 80 μg/ ml leupeptin, 3 mM NaF and 1 mM DTT)을 첨가하여 4℃에서 30분 동안 처리하였다.
- B16F1 세포에서 DOPA자극을 통한 melanin 생성에 대한 BLEE의 효과를 조사하였다. Fig.
- BLEE가 세포 독성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 B16F1세포의 미토콘드리아 환원 효소를 이용하여 MTT assay 를 수행하였다. B16F1세포에 대한 BLEE의 세포독성을 측정한 결과, Fig.
- Brand-Williams [5] 실험방법을 변형하여 BLEE의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Melanin 표준품 (Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. Melanin은 104 세포 당 melanin 생성량을 비교하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. Melanin 표준품 (Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. Melanin은 104 세포 당 melanin 생성량을 비교하였다.
- Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 세척·건조된 흑미를 믹서기로 분쇄하여 분말로 제조 후 주정에 3일간 추출하고 여과하였다. 각 여과된 여액을 감압 농축하여 분말 형태의 흑미 주정추출물을 획득하였다. 제조된 분말형태의 시료들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 시험 농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
- 10 μg의 세포용출액을 10% Tris?HCl gel에서 전기영동후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -1, anti-TRP -2, anti-SOD -2, anti-SOD -3, anti-catalase, anti-beta-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)를사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 기존에 알려진 흑모유발 혹은 melanin 생성 촉진 물질로 알려진 α-MSH, imatinib mesylate, IBMX가 melanin 생성과 관련된 효소 및 항산화 관련 효소발현에 미치는 영향을 조사하였다.
- 다음 실험에서는 BLEE가 melanin 합성에 관여하는 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Western blot을 수행하였다. Fig.
- 다음으로 백발의 조건에서 melanin 촉진실험을 하기 위해 모발의 노화를 유발시키기 위한 조건을 모방하여 백모발생의 주요원인으로 알려져 있는 H2O2 를 250 μM 농도로 24시간 동안 처리하여 B16F1 cell에서 melanin 합성을 감소시킨 후 DOPA자극을 통해 melanin 생성에 대한 BLEE의 효과를 조사하였다.
- 가 반응하면 DCFHDA가 산화되면서 DCF가 생성되며 형광을 띄게 된다. 따라서 형광 측정을 통해 BLEE의 세포내 H2O2 소거능을 측정하였다. Fig.
- 본 실험에서는 BLEE의 항산화 효과에 대해 조사하였다. 먼저 BLEE의 DPPH radical 소거능을 알아보기 위하여 DPPH radical scavenging assay를 수행하였다. Fig.
- 시료 내 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu [16] 방법을 변형하여 Gallic acid를 이용해 표준 물질로 사용하였다. 분광 광도계의 측정 가능한 범위 안에서 시료를 희석하여 사용하였다.
- DMEM 배지에 DCFH-DA를 20 μM 농도로 제조하여 B16F1세포에 처리한 후 37℃에서 20분 방치하여 DCFH-DA를세포 내로 침투시킨다. 여기에 음성대조군인 0.1% vitamin C 와 BLEE를 시험농도로 1시간 동안 처리하였다. PBS로 4번 세척 후 H2O2를 250 μM 농도를 함유한 HBSS 완충용액 100 μl를세포에 처리하였다.
- 최근 연구에서 밝혀진 흑모에서 백모가 되는 기전 으로 melanocyte의 catalase, methionine sulfoxide reductase A 및 B 단백질의 발현이 감소하면서 모낭 주위에 H2O2가 축적되어 mealanin 생성에 필요한 효소인 tyrosinase의 methionine 잔기를 산화시켜 methionine sulfoxide가 생성하여 tyrosinase의 구조가 변경됨으로 인하여 효소활성이 저하되어 melanin 생성이 감소된다고 보고되었다[17]. 이러한 기전을 바탕으로 하여 쥐의 흑색종 세포를 이용하여 백발 유발을 촉진하기 위하여 H2O2를 처리하여 melanin 생성을 감소시켰다. 본 연구에서 H2O2가 melanin 생성을 감소시킨다는 것을 확인하였고 BLEE는 H2O2에 의해 감소된 melanin 생성을 촉진시 키는 것으로 나타났다.
- 세포내에서 H2O2는 DCFH-DA와 반응하여 형광을 띄는 DCF를 생성한다. 이를 S1LFA Synergy Htx multi-mode microplate reader (BioTek, Vermont, USA)를 이용하여 excitation: 488 nm, emission: 530 nm 조건에서 형광정도를 측정하였다.
- 흑미 주정추출물에서 활성산소를 환원시키는 폴리페놀 함량을 측정하였다. Fig.
대상 데이터
- α-MSH, imatinib mesylate, IBMX, MTT reagent와 기타 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. α-MSH, imatinib mesylate, IBMX, MTT reagent와 기타 시약은 Sigma Chemical Co.
- 선행연구에서 melanin 생성을 촉진시키는 물질로는 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH), imatinib mesylate, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)이 알려져 있어 본 연구에서 양성 대조군으로 사용되었다.
- 세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml) / streptomycin (10,000 μg/ml) / amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로부터 구입하였다.
- 여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. 시료의 환원력은 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
- 각 여과된 여액을 감압 농축하여 분말 형태의 흑미 주정추출물을 획득하였다. 제조된 분말형태의 시료들을 dimethyl sulfoxide (DMSO)로 시험 농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
- 흑미는 ‘신농흑찰’품종을 지리산 산청 한약방에서 구입하여 본 연구에 사용되었다.
데이터처리
- Level of significance was identified statistically (* p<0.05, ** p<0.01) using Student’s t test.
- Level of significance was identified statistically (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001) using Student’s t test.
- Level of significance was identified statistically (** p<0.01, *** p<0.001) using Student’s t test.
- 각 시료 농도군에 대한 유의 차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
- 각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- Hansen [3]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 BLEE의 세포 독성을 MTT [3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]를 이용하여 측정하였다.
- Oyaizu [9]의 방법에 따라 측정하였다. BLEE 1 ml에 pH 6.
성능/효과
- C, 0,2% Arbutin 은 공시험군과 비교하여 tyrosinase 활성이 80% 정도 억제되었고 BLEE는 16 μg/ml 농도부터 공시험군에 비하여 증가하 였으며, tyrosinase 활성이 증가하여 64 μg/ml 농도에서는 공시험군보다 tyrosinase 활성이 20% 촉진되었다.
- Catalase 발현수준에 있어서는 α-MSH, imatinib mesylate, IBMX 처리군은 대조군과 비교하여 감소되었다.
- C는 공시험군에 비해 60%의 melanin 생성이 감소 되었지만 BLEE는 16 μg/ml 농도부터 공시험군에 비하여 증가하였으며, 64 μg/ml에서는 공시험군과 비교하여 melanin 생성이 20% 증가되었다.
- Fig. 2A에서 보는 바와 같이 공시험군에 비하여 양성대조군인 0.01% vitamin C (Vit. C)는 DPPH radial을 90%까지 소거하였고, BLEE는 농도가 증가할수록 DPPH radical소거능이 증가하였으며 최고농 도인 64 μg/ml에서는 20%의 DPPH radical 소거능을 나타내 었다.
- Fig. 5에서 공시험군에 비하여 H2O2만 첨가한 대조군의 형광이 180% 증가하였고, 대조군에 비하여 BLEE군은 64 μg/ml에서 형광이 220% 감소되어 BLEE의 농도가 증가함에 따라 세포 내 H2O2를 제거하는 효과가 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
- 다음으로 백발의 조건에서 melanin 촉진실험을 하기 위해 모발의 노화를 유발시키기 위한 조건을 모방하여 백모발생의 주요원인으로 알려져 있는 H2O2 를 250 μM 농도로 24시간 동안 처리하여 B16F1 cell에서 melanin 합성을 감소시킨 후 DOPA자극을 통해 melanin 생성에 대한 BLEE의 효과를 조사하였다. Fig. 6B에서 보는 바와 같이 H2O2를 처리한 대조군은 공시험군에 비하여 melanin 합성이약 38%정도 감소되었다. 그러나 BLEE는 대조군에 비해 농도가 증가함에 따라 8 μg/ml부터 melanin 생성이 증가되었고 최고농도인 64 μg/ml 농도에서는 melanin 합성을 100% 이상 증가시켰다.
- Fig. 8에서 보는 바와 같이 B16F1세포 내에서 melanin 합성에 영향을 미치는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 분석하기 위하여 백발 유발과 관련 있는 환경을 조성하기 위하여 melanin 합성을 감소시키고자 250 μM의 H2O2를 24시간 처리한 대조군은 H2O2를 처리하지 않은 공시험군에 비하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현이 감소되었다.
- Melanocyte에서 melanin생성을 조절하는 MITF 전사인자의 발현은 대조군은 공시험군에 비하여 감소하였고 양성대조군인 6 μM의 α-MSH, 2.5 μM의 imatinib mesylate, 160 μM의 IBMX처리군은 대조군에 비해 MITF의 단백질 발현이 유사하게 나타났다.
- 이전 연구에서도 흑미는 특히 H2O2의 생성을 저하시킨다고 보고되었다. 결론적으로 흑미추출물이 백발예방 및 흑모발생과 관련 있는 melanin 생성을 촉진시키는데 있어서 tyrosinase 활성 촉진과 세포 내 H2O2의 생성을 감소시켜 melanin 생성을 촉진시키는 것으로 나타났다. 그러므로 본 연구에서 개발된 흑미추출물은 흑모촉진과 관련된 제품 개발분야에 하나의 잠재적인 기능성 소재로 응용될 수 있다는 것을 시사하고 있다.
- 본 연구에서 사용된 BLEE는 catalase 의 발현을 증가시켰으나 기대치와는 달리 melanin 생성에 관여하는 효소의 발현에는 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러므로 BLEE의 melanin 생성 촉진효과는 tyrosinase 활성 증가와 catalase의 발현 증가로 인하여 H2O2의 생성을 저하시켜 melanin 생성을 촉진시키는 것으로 나타났다. 이전 연구에서도 흑미는 특히 H2O2의 생성을 저하시킨다고 보고되었다.
- 이전 보고서에서 흑미는 melanin 생성 및 흑모 유발 촉진 가능성을 제기하였다[14]. 본 연구에서 BLEE의 radial 소거능과 환원력 효과를 알아보기 위하여 DPPH radical scavenging assay와 reducing power test를 수행한 결과 BLEE는항산화 효과가 기대치보다 낮아 H2O2의 생성을 직접적으로 감소시키지 않는 것으로 판단된다. 이전에 연구된 결과에 따르면 흑미에서 항산화 활성과 radical 소거능이 나타났다고 보고되었다[2].
- 이러한 기전을 바탕으로 하여 쥐의 흑색종 세포를 이용하여 백발 유발을 촉진하기 위하여 H2O2를 처리하여 melanin 생성을 감소시켰다. 본 연구에서 H2O2가 melanin 생성을 감소시킨다는 것을 확인하였고 BLEE는 H2O2에 의해 감소된 melanin 생성을 촉진시 키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 BLEE가 본 연구에서 발견한 tyrosinase 활성증가에 의하여 백발 예방에 도움을 주거나 흑모 유발촉진의 잠재적인 가능성을 가지고 있다는 것을 시사한다.
- 다음으로 melanin 생성을 촉진한다고 알려진 α-MSH와 IBMX도 마찬가지로 TRP-2의 단백질 발현만 증가시키는 것으로 나타났다 이전 보고에서도 melanin 합성 과정에서TRP-2의 발현의 중요성이 발견되어 본 연구의 결과를 지지해 주고 있다[10]. 본 연구에서 사용된 BLEE는 catalase 의 발현을 증가시켰으나 기대치와는 달리 melanin 생성에 관여하는 효소의 발현에는 영향이 없는 것으로 나타났다. 그러므로 BLEE의 melanin 생성 촉진효과는 tyrosinase 활성 증가와 catalase의 발현 증가로 인하여 H2O2의 생성을 저하시켜 melanin 생성을 촉진시키는 것으로 나타났다.
- 양성대조군으로 사용된 6 μM의 α-MSH, 2.5 μM의 imatinib mesylate, 160 μM의 IBMX 처리군은 대조군에 비하여 tyrosinase와 TRP-1의 발현은 감소되었으나 TRP-2의 단백질 발현은 증가되었다.
- 양성대조군으로 사용된 6 μM의 α-MSH는 대조군에 비하여 SOD-3의 발현이 현저하게 감소되었고, 흑모를 유발시킨다고 알려진 imatinib mesylate을 2.5 μM 처리군과 melanin 합성을 촉진시키는 IBMX를 160 μM 처리군은 대조군에 비하여 항산화 단백질인 SOD-3의 발현에 차이가 없었다.
- 본 연구에서 H2O2가 melanin 생성을 감소시킨다는 것을 확인하였고 BLEE는 H2O2에 의해 감소된 melanin 생성을 촉진시 키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 BLEE가 본 연구에서 발견한 tyrosinase 활성증가에 의하여 백발 예방에 도움을 주거나 흑모 유발촉진의 잠재적인 가능성을 가지고 있다는 것을 시사한다. 이전 보고서에서 흑미는 melanin 생성 및 흑모 유발 촉진 가능성을 제기하였다[14].
- 먼저 백발을 유발시키기 위해서 처리한 H2O2는 catalase의 발현은 증가시켰고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현이 감소되었다. 이러한 결과로부터 melanin 생성에 H2O2가 결정적으로 중요한 역할을 한다는 것을알 수 있었다. 이전 연구에서도 H2O2가 melanin 생성을 감소 시킨다는 보고가 있었다[4].
- 그러나 BLEE처리군은 농도가 증가함에 따라 MITF의 단백질 발현이 감소하는 것을 볼 수 있다. 이상의 결과는 BLEE가 melanin 생성에 관여하는 단백질 발현의 촉진에는 양성적인 효과가 없다는 것을 나타낸다.
- 한편 세포독성이 4 μM의 BLEE 처리군에서는 SOD-3 단백질의 발현이 대조군에 비하여 차이가 없었으나 catalase의 발현은 대조군에 비하여 감소하였다. 이상의 결과는 BLEE가 항산화 효소의 발현 촉진에는 양성적인 효과가 없다는 것을 나타낸다.
후속연구
- 결론적으로 흑미추출물이 백발예방 및 흑모발생과 관련 있는 melanin 생성을 촉진시키는데 있어서 tyrosinase 활성 촉진과 세포 내 H2O2의 생성을 감소시켜 melanin 생성을 촉진시키는 것으로 나타났다. 그러므로 본 연구에서 개발된 흑미추출물은 흑모촉진과 관련된 제품 개발분야에 하나의 잠재적인 기능성 소재로 응용될 수 있다는 것을 시사하고 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.