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문제 정의
- 최근 국민소득 수준의 증가와 삶의 질 향상, 고령화 사회로의 진입에 따라 건강의 유지 및 증진이 무엇보다 중요하다는 사회적 트렌드가 이어지면서 후코이단 및 글리코사미노글리칸과 같은 해조 다당류 소재가 많이 포함되어 있는 해조류 껍질을 이용하여 화장품 소재로서 가능성을 알아보고자 하였다. 특히 대기오염, 핵가족화, 모유 수유의 감소, 교육 수준의 향상, 항생제 사용의 증가로 인한 항원에 대한 노출의 증가, 주거 환경 변화, 공업 발달로 인한 새로운 항원 물질들의 등장 등으로 인해 최근 피부염의 발생률이 증가하고 있다[1-5].
- 해조 다당류에는 콘드로이틴 황산염이 다량 존재하며, 글루탐산, 타우린, 글리신, 바나듐과 같은 많은 유용성분을 함유하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 해조 다당류 성분인 후코이단 및 글루코사미노글리칸 성분을 추출하여 세포 독성, 항염, 항균, 경피 투여 독성 효능을 실험하여 화장품 소재로서의 유효성을 확인하였다.
- 본 연구에서는 해조류껍질 추출물중 해조 다당류 성분추출물의 화장품 소재로서의 유효성을 알아보기 위하여 세포독성, 항균, 항염증 효능을 평가하였다. Skin fibroblast 세포에 해조류껍질중 해조 다당류 성분추출물을 농도별로 처리한 결과 1,000 μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않았으며 S.
제안 방법
- 세포에 해조 다당류 추출물 성분을 50, 100, 200, 400 μg/mL로 처리하고, 24 h 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL1β, TNFa는 Milliplex map cytokine kit (Millipore, USA)을 이용하여 측정하고, PGE2는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Calbiochem, USA)을 이용하여 측정하였다[7].
- 멸균된 filter paper disc (8 mm; Advantec, Japan) 를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 각각 45 μL/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켰고 35℃에서 18-24 h 배양하여 disc 주위의 clear zone 즉 균 성장억제 영역의 직경(mm)을 측정하여 항균력을 평가하였다[9].
- 배양 종료 후 각 well 마다 1 mL의 isoprothiolane (Sigma-Aldrich)을 넣어 보라색 결정체가 완전히 용해될 때까지 혼합하였다. 그 후 570 nm 파장에서 UV-Vis spectrophotometer (UV1800; Shimadzu, Japan)를 사용하여 측정하였다[15].
- 적응 기간 종료 후 이상이 없는 실험 동물을 선별하여 수컷과 암컷 흰 쥐를 각 군당 10 마리씩 평균체중이 일정하게 되도록 무작위로 배치하였다.
- 적응 기간 종료 후 이상이 없는 실험 동물을 선별하여 수컷과 암컷 흰 쥐를 각 군당 10 마리씩 평균체중이 일정하게 되도록 무작위로 배치하였다. 실험군은 대조군(vehicle), 해조 다당류 성분추출물 1% 처치군 (seaweed polysaccharide extract 1%), 해조 다당류 성분추출물5% 처치군 (seaweed polysaccharide extract 5%), 해조 다당류 성분추출물 10% 처치군 (seaweed polysaccharide extract 10%)으로 각 10마리씩 나누어서 사용하였다. 실험 동물의 등 부위를 약 5×2.
- 5 cm2를 미리 제모한 후 해조 다당류 성분 추출물을 30% 에탄올에 적정 처치 용량으로 용해하여 제모한 부위에 1 mL를 고르게 도포하였다. 처치 후 14 일간 매일 관찰하여 일반증상을 기록하였고, 처치 당일의 절식체중과 익일을 포함하여 3 일 간격으로 체중, 음수 및 사료 섭취량을 각각 측정하였다. 또 실험물질투여 후 14 일이 되는 시점에 절식시킨 후 15 일째에 부검하여 주요 장기의 중량을 측정하였고 절식체중에 대한 상대 장기 중량으로 산출하여 비교하였으며, 부검 시 육안적 병리소견 및 이상 병변이 관찰된 장기 및 조직에 대한 조직병리학적으로 분석하였다.
- 처치 후 14 일간 매일 관찰하여 일반증상을 기록하였고, 처치 당일의 절식체중과 익일을 포함하여 3 일 간격으로 체중, 음수 및 사료 섭취량을 각각 측정하였다. 또 실험물질투여 후 14 일이 되는 시점에 절식시킨 후 15 일째에 부검하여 주요 장기의 중량을 측정하였고 절식체중에 대한 상대 장기 중량으로 산출하여 비교하였으며, 부검 시 육안적 병리소견 및 이상 병변이 관찰된 장기 및 조직에 대한 조직병리학적으로 분석하였다. 그 결과로부터 개략의 치사량(10% 치사량)을 산출하였다.
- aureus균은 대표적인 피부 상재균으로서 단독으로 염증을 일으키지는 않지만 피부의 염증이 발생하였을 경우 2차 감염을 일으켜 염증을 악화시키고 여드름에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 해조 다당류 성분 추출물의 항균효과를 알아보기 위해, S. aureus균 배양 후 해조 다당류 성분추출물을 0, 0.01%, 0.1%, 1% 농도로 처리하여 48 h 후에 항균활성을 살펴보았다. 실험 결과, Figure 2에서 나타난 바와 같이 해조 다당류 성분추출물을 처리한 부분에서 생육 저해환이 형성되 었으며, 0.
- 그림 3. 해조 다당류 추출물의 LPS에 의한 Raw 264.7 세포에 대한 항염증 효능 평가.
- 잔사에 증류수 500 mL을 가하여 40℃에서 24 h 동안 추출하고 Buchner 여과장치(Korea material scientific, Korea)를 이용하여 여과지(Whatman®FilterPapersNo.2;GEhealthcareLifeSciences,UK)로 여과 한 후 여과액을 rotary vacuum evaporator (JP/N-1000X; Sunileyela, Korea) 를 사용하여 50℃에서 감압 농축하였다.
- 그 후 100 μL의 그리스 시약 (Griess reagent; 0.5% sulphanilamide (Sigma- Aldrich), 2.5% phosphoric acid (Sigma-Aldrich) 및 0.5% N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NEDHC; SigmaAldrich)을 첨가하였으며 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고 NO의 농도는 아질산염의 표준 곡선으로부터 계산하였다[12].
대상 데이터
- 실험에 사용된 skin fibroblast 세포는 한국세포주 은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB, Korea)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS; GibcoTM, Thermo Fisher- Scientific, USA)가 포함된 Dulbeccos's Modified Eagle's Medium (DMEM; GibcoTM) 배지에서 배양하였다.
- 5주령 SD 흰쥐 암·수컷 50 마리를 (주)코아텍(COATECH, Korea)으로부터 공급받아 1주일간의 실험실 적응 과정을 거친 후 실험에 사용하였다.
- 해조 다당류 성분 추출물의 항염증 반응을 평가하기 위하여 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행에서 구입하여 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium 1640 (GibcoTM)배지에 10% fetal bovine serum (FBS) 를 포함하여 배양하였다. 24 well plates에 세포는 2×105 cells/mL의 밀도로 현탁 하였고, 50-400 μg/mL 농도로 해조 다당류 추출물을 처리하였다.
- 동물 사육실 환경은 온도 23±2 ℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/hr, 조명주기 12 h (07:00–19:00), 조도 150-300 lux로 조절되었다. 사료는 고형 사료로 (주)다물사이언스(Korea)에서 공급하였고 멸균 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 적응 기간 종료 후 이상이 없는 실험 동물을 선별하여 수컷과 암컷 흰 쥐를 각 군당 10 마리씩 평균체중이 일정하게 되도록 무작위로 배치하였다.
데이터처리
- 실험결과는 () Version 22.0 (IBM, USA)의 unpaired Student's t-test를 이용하여 통계처리 하였으며, 그 값은 평균±표준편차(mean±standard deviation)로 표기하였다.
이론/모형
- 해조 다당류 성분의 항균 효과를 평가하기 위하여 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Korea)에서 분양 받은 S. aureus (KCTC 1621) 를 계대 배양하여 사용하였으며 항균력 측정은 paper disc법을 사용하였다. 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이를 취해서 액체 배지 10 mL에서 18-24 h 배양하여 활성화시켰다.
성능/효과
- 또한 피부 내에서 염증성 사이토카인이 발현되면 피부각질형성세포의 증식 속도를 급격히 감소시키고 진피층의 기질형성을 억제함으로써 피부가 손상되었을 때 치유 속도를 저하시키며 아토피성 피부염, 건선과 같은 피부질환을 유발한다고 보고되어 있다[6-8]. 피부질환을 유발시키는 것으로 보고된 미생물은 여드름 균인 Propionibacterium acnes (P. acnes) 과 비듬과 모낭염의 원인균인 Malassezia furfur (M. furfur)가 대표적이며, 황색포도상구균 S. aureus은 피부 배양 검사 시 흔히 검출되는 균으로써, 아토피 피부염과 밀접한 연관이 있는 것으로 알려졌다. S.
- 실험 결과, Figure 2에서 나타난 바와 같이 해조 다당류 성분추출물을 처리한 부분에서 생육 저해환이 형성되 었으며, 0.01%, 0.1%, 1%의 농도로 처리하였을 때 각각 1.32±0.54 cm, 1.44±0.68 cm, 1.52±0.34 cm의 생육 저해 환이 형성되어 추출물의 농도에 비례하여 효능이 증가 하는 것을 확인할 수 있었다(Table 1).
- 해조류 껍질중 해조 다당류 성분추출물을 10-1,000 μg/mL 농도로 skin fibroblast 세포에 처리한 군과 아무것도 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 비교하였을 때 생존율은 각각 100.0±0.9%, 98.3±2.3%, 96.6±3.4%, 94.3±2.9%, 91.1±3.3%, 90.2±4.7% 그리고 87.3±3.5%로 모든 농도에서 유의적인 세포독성을 나타내지 않았다(Figure 1).
- 또 실험물질투여 후 14 일이 되는 시점에 절식시킨 후 15 일째에 부검하여 주요 장기의 중량을 측정하였고 절식체중에 대한 상대 장기 중량으로 산출하여 비교하였으며, 부검 시 육안적 병리소견 및 이상 병변이 관찰된 장기 및 조직에 대한 조직병리학적으로 분석하였다. 그 결과로부터 개략의 치사량(10% 치사량)을 산출하였다.
- 해조 다당류 성분추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 항염증 효능을 평가한 결과,1 μg/mL 농도의 LPS로 염증반응을 유발시킨 배양액 내 NO의 함량은 11.7±1.1 μM로 정상군 (3.0±1.0)에 비해 증가되었다.
- 그러나, 해조 다당류 성분추출물을 50, 100, 200, 400 μg/mL로 처리한 실험군의 배양액 내 NO 의 함량은 각각 11.6±1.5, 11.7±1.1, 10.7±1.9, 9.5±1.7 μM 로 나타났고, 특히 해조 다당류 성분추출물 농도 400 μ g/mL로 처리한 실험군은 LPS를 단독 처리한 대조군에 비해 유의하게 감소함을 확인할 수 있었다(Figure 3).
- 해조 다당류 성분추출물 이 RAW 264.7세포에 대한 항염증 효능을 평가한 결과, 1 μg/mL 농도의 LPS로 염증반응을 유발시킨 배양액 내 IL1b의 함량은 173.3±23.9 pg/mL로 정상군에 비해 유의하게 증가되었다.
- LPS로 염증반응을 유발시킨 배양액 내 TNFa의 함량은 469.4±49.4 pg/mL로 정상군에 비해 증가되었고, 해조 다당류 성분추출물을 200, 400 μg/mL로 처리한 실험군은 LPS를 단독 처리한 대조군에 비해 유의한 감소가 나타났다(Figure 4B).
- Inflammation-related cytokines, such as IL 1β, TNFα and PGE2 were significantly decreased, Significance: *P<0.05, ** p<0.01 compared with LPS treated RAW 264.7 cells in the absence of seaweed polysaccharide;*P<0.05 compared with LPS non-treated RAW 264.7 cells in the absence of seaweed polysaccharide.
- PGE2의 함량은 대조군(4363.8±102.3 pg/mL)에 비해 해조 다당류 성분추출물을 50, 100, 200, 400 μg/mL로 하였을 때, 각각 4243.6±136.7 pg/mL, 4018.6±119.8 pg/mL, 3993.4±140.6 pg/mL, 3677.6±257.8 pg/mL으로 LPS를 단독 처리한 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소되었으며, 특히 해조 다당류 성분추출물 농도가 400 μg/mL로 처리한 실험군은 유의한 감소를 나타내었다(Figure 4C).
- 해조류껍질 추출물중 해조 다당류 성분추출물을 흰 쥐의 등에 도포한 후 14 일 동안 관찰한 결과, 모든 동물에서 이상 증상은 보이지 않았으며 체중변화에 있어 수컷 흰쥐의 경우 약 153 g에서 시작하여 실험 종료 14 일에 268 g으로 꾸준히 증가되었고 암컷 흰쥐의 경우도 약 138 g에서 시작하여 실험 종료 14 일에 242 g으로 증가되었다.평균적으로 한 마리 당 0.
- 16 g/g으로 유지되었다. 물 섭취량 또한 특이점이 보이지 않았으며, 평균적으로 한 마리 당 0.24 mL/g으로 유지되었다(Table 2).
- 해조류껍질 추출물중 해조 다당류 성분추출물 도포 14 일 후 실험 동물을 부검한 결과, 모든 동물에서 장기의 특이적인 이상 소견이 관찰되지 않았다. 간, 신장, 비장, 폐, 심장을 포함한 장기 무게는 수컷과 암컷 모두 대조군과 비교하였을 때 차이를 보이고 있지 않았고 결과적으로 해조 다당류 성분 추출물이 신체 내부에 영향을 미치지 않는 것으로 판단하였다.
- 해조류껍질 추출물중 해조 다당류 성분추출물 도포 14 일 후 실험 동물을 부검한 결과, 모든 동물에서 장기의 특이적인 이상 소견이 관찰되지 않았다. 간, 신장, 비장, 폐, 심장을 포함한 장기 무게는 수컷과 암컷 모두 대조군과 비교하였을 때 차이를 보이고 있지 않았고 결과적으로 해조 다당류 성분 추출물이 신체 내부에 영향을 미치지 않는 것으로 판단하였다.
- Skin fibroblast 세포에 해조류껍질중 해조 다당류 성분추출물을 농도별로 처리한 결과 1,000 μg/mL까지 세포독성이 나타나지 않았으며 S. aureus균 배양 후 해조 다당류 성분추출물을 0.01%, 0.1%, 1%의 농도로 처리한 결과, 농도의존적인 항균활성을 나타내었다.
- PGE2생성량 또한 해조 다당류성 분추출물 400 μg/mL 농도 처리군에서 유의하게 감소하여 해조 다당류 성분추출물의 뛰어난 항염증 효능을 확인할 수 있었다.
- 그리고 IL1β 생성량은 해조 다당류 성분으로 처리하였을 때 감소하는 경향을 나타내었고, TNFa 생성량은 해조 다당류 추출물 200, 400 μg/mL 농도 처리군에서 유의한 감소를 나타내었다.
- 또한 RAW 264.7 세포에 LPS를 가하여 염증반응을 유발한 후 NO 생성량 및 IL1β, TNFa, PGE2와 같은 염증성 사이토카인 생성량을 살펴본 결과, LPS를 처리하였을 때 11.7±1.1 μM로 증가한 NO 생성량이 해조류껍질중 해조 다당류 성분추출물 400 μg/mL농도 처리군에서 9.5±1.7 μM로 유의하게 감소함을 확인하였다.
- 이상의 결과로 사망 동물은 물론 일반 증상, 체중변화, 부검 및 육안소견 그리고 장기의 무게에 있어서 어떠한 이상 소견도 발견되지 않음으로써 개략의 치사량을 산출할 수 없었으며, 흰 쥐에서 해조류껍질 추출물중 해조 다당류 성분추출물의 단회해조 다당류 성분추출물의 단회 경피 처치는 10% 농도까지 특이적인 부작용이 없는 것으로 사료된다 (Table 3).
- PGE2생성량 또한 해조 다당류성 분추출물 400 μg/mL 농도 처리군에서 유의하게 감소하여 해조 다당류 성분추출물의 뛰어난 항염증 효능을 확인할 수 있었다. 그리고 해조 다당류 성분추출물을 흰 쥐의 등에 도포한 후 14 일 동안 관찰한 결과, 모든 동 물에서 이상 증상은 보이지 않았으며 체중 및 장기 변화에서도 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 실험에서 해조류껍질중 해조 다당류 성분추출물은 세포독성 및 경피 투여 독성을 나타내지 않았고 S.
후속연구
- 그리고 해조 다당류 성분추출물을 흰 쥐의 등에 도포한 후 14 일 동안 관찰한 결과, 모든 동 물에서 이상 증상은 보이지 않았으며 체중 및 장기 변화에서도 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 실험에서 해조류껍질중 해조 다당류 성분추출물은 세포독성 및 경피 투여 독성을 나타내지 않았고 S. aureus 균을 효과적으로 억제하였으며 NO 및 염증성 사이토카인의 생성량을 감소시켜 항균 및 항염증 화장품으로서의 활용가능성이 높다고 사료된다. 그러나 염증 차단 기전을 분명히 하기 위하여 cyclooxygenase 2 (COX2) 발현 억제 효능, iNOS 발현 억제 효능 등을 살펴 보지 못한 점, P.
- aureus 균을 효과적으로 억제하였으며 NO 및 염증성 사이토카인의 생성량을 감소시켜 항균 및 항염증 화장품으로서의 활용가능성이 높다고 사료된다. 그러나 염증 차단 기전을 분명히 하기 위하여 cyclooxygenase 2 (COX2) 발현 억제 효능, iNOS 발현 억제 효능 등을 살펴 보지 못한 점, P. acnes, M. furfur 등 다양한 균에 대한 항균실험을 하지 못한 점은 본 연구의 한계점으로 남는다. 따라 서 향후 연구에서는 다양한 균을 대상으로 한 해조류 껍질중 해조 다당류 성분추출물의 항균실험과 염증 기전에 따른 실험뿐 아니라 동물 실험을 통한 심도 깊은 연구를 진행하고자 한다.
- furfur 등 다양한 균에 대한 항균실험을 하지 못한 점은 본 연구의 한계점으로 남는다. 따라 서 향후 연구에서는 다양한 균을 대상으로 한 해조류 껍질중 해조 다당류 성분추출물의 항균실험과 염증 기전에 따른 실험뿐 아니라 동물 실험을 통한 심도 깊은 연구를 진행하고자 한다.
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