당귀수산, 생강, 커큐민의 대사성 질환과 관련된 일과성 수용체 전압 이온통로조절에 관한 연구 Effects of Dangkwisoo-San, Ginger and Curcumin on Transient Receptor Potential Melastatin 7 Channels원문보기
Objectives: Metabolic syndrome is correlated with increased cardiovascular risk and characterized by several factors, including visceral obesity, hypertension, insulin resistance, and dyslipidemia. Several members of a large family of nonselective cation entry channels, e.g., transient receptor pote...
Objectives: Metabolic syndrome is correlated with increased cardiovascular risk and characterized by several factors, including visceral obesity, hypertension, insulin resistance, and dyslipidemia. Several members of a large family of nonselective cation entry channels, e.g., transient receptor potential (TRP) melastatin 7 (TRPM7) channels have been associated with the development of cardiovascular diseases. The purpose of this study was to investigate the effects of Dangkwisoo-san, ginger and curcumin on TRPM7 channel. Methods: Human embryonic kidney (HEK) 293 cells stably transfected with the TRPM7 expression vectors were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, $5{\mu}g/mL$ blasticidin, and 0.4 mg/mL zeocin in a humidified 20% $O_2$/10% $CO_2$ atmosphere at $37^{\circ}C$. Whole-cell patch clamp recordings were obtained using an Axopatch 700B amplifier and pClamp v.10.4 software, and signals were digitalized at 5 kHz using Digidata 1422A. Results: Dangkwisoo-san extract (100, 200, 300, 400, and $500{\mu}g/mL$) inhibited the outward and inward TRPM7 whole-cell currents at dose dependent manner and the half maximal inhibitory concentration $(IC)_{50}$ of Dangkwisoo-san was $218.3{\mu}g/mL$. Also, ginger extract (100, 200, 300, 400, and $500{\mu}g/mL$) inhibited the outward and inward of TRPM7 whole-cell currents in a dose dependent manner and the $IC_{50}$ of ginger was $877.2{\mu}g/mL$. However, curcumin had no effects on TRPM7 whole-cell currents. Conclusions: These results suggest that both Dangkwisoo-san and ginger have good roles to inhibit the TRPM7 channel, suggesting that Dangkwisoo-san and ginger are considered one of the candidate agents for the treatment of metabolic syndrome such as cardiovascular disease.
Objectives: Metabolic syndrome is correlated with increased cardiovascular risk and characterized by several factors, including visceral obesity, hypertension, insulin resistance, and dyslipidemia. Several members of a large family of nonselective cation entry channels, e.g., transient receptor potential (TRP) melastatin 7 (TRPM7) channels have been associated with the development of cardiovascular diseases. The purpose of this study was to investigate the effects of Dangkwisoo-san, ginger and curcumin on TRPM7 channel. Methods: Human embryonic kidney (HEK) 293 cells stably transfected with the TRPM7 expression vectors were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin, $5{\mu}g/mL$ blasticidin, and 0.4 mg/mL zeocin in a humidified 20% $O_2$/10% $CO_2$ atmosphere at $37^{\circ}C$. Whole-cell patch clamp recordings were obtained using an Axopatch 700B amplifier and pClamp v.10.4 software, and signals were digitalized at 5 kHz using Digidata 1422A. Results: Dangkwisoo-san extract (100, 200, 300, 400, and $500{\mu}g/mL$) inhibited the outward and inward TRPM7 whole-cell currents at dose dependent manner and the half maximal inhibitory concentration $(IC)_{50}$ of Dangkwisoo-san was $218.3{\mu}g/mL$. Also, ginger extract (100, 200, 300, 400, and $500{\mu}g/mL$) inhibited the outward and inward of TRPM7 whole-cell currents in a dose dependent manner and the $IC_{50}$ of ginger was $877.2{\mu}g/mL$. However, curcumin had no effects on TRPM7 whole-cell currents. Conclusions: These results suggest that both Dangkwisoo-san and ginger have good roles to inhibit the TRPM7 channel, suggesting that Dangkwisoo-san and ginger are considered one of the candidate agents for the treatment of metabolic syndrome such as cardiovascular disease.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 한방임상에서 타박손상에 주로 사용되는 당귀수산 (Dangkwisoo-san)20)과 비만에 관여하는 생강21), 당지질 대사장애에 사용되는 커큐민22)에 의한 TRPM7 이온통로에서의 효능을 확인하여 각각의 TRPM7 조절 가능성을 확인하고자 한다.
7배 급증하였다23). 본 연구는 당귀수산과 생강이 TRPM7 통로를 억제시키는기능이 있음을 확인한 연구로 TRPM7의 기능을 억제하여 TRPM7에 의해 조절되는 다양한 대사성질환을 조절할 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 또한 curcumin은 TRPM7조절 기능이 없어 TRPM7을 통한 대사성질환 조절 가능성은 없음을 확인하였다.
제안 방법
10% fetal bovine serum (FBS), 1%penicillin/streptomycin, 5 µg/mL blasticidin, 0.4 mg/mL zeocin을 포함하는 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지를 배양액으로 20% O2, 10% CO2를 포함한 배양기에서 37℃를 유지하면서 배양하였다.
400 msec에 걸쳐 –100 mV로부터 +100 mV까지 전압을 변화시켜가면서 막을 통해 흐르는 전류를 측정하였다.
TRPM7를 통하는 전류의 흐름을 측정하기 위한 전기생리 실험은 Axopatch 200B 증폭기(Axon Instruments, Inc.,Foster City, CA, USA)를 이용하여 전세포 패치클램프를실시하였다. Glass capillary를 이용하여 전극내부에 용액을 채웠을 때 저항이 3-5 메가옴(mega-ohm)에 해당하는 것을 실험에 이용하였다.
이상과 같은 방법으로 기록한 전류에 대한 결과 분석은 같은 회사의 clampit 소프트웨어를 이용하였다. 모든 전기생리학적 실험은 실온에서 시행하였다.
세포가 붙은 plate를 도립현미경 위에 올려놓은 후 막전압 고정법(voltage-clamp method)을 이용하여 전류를 측정하였다. 이상과 같은 방법으로 기록한 전류에 대한 결과 분석은 같은 회사의 clampit 소프트웨어를 이용하였다. 모든 전기생리학적 실험은 실온에서 시행하였다.
대상 데이터
2로 맞춘 후 사용하였다. Bath 용액은 2.8 mM KCl, 145mM NaCl, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose, 1.2 mM MgCl2,10 mM HEPES를 포함한 용액을 NaOH 용액으로 pH 7.4로 맞춘 후 사용하였다.
,Foster City, CA, USA)를 이용하여 전세포 패치클램프를실시하였다. Glass capillary를 이용하여 전극내부에 용액을 채웠을 때 저항이 3-5 메가옴(mega-ohm)에 해당하는 것을 실험에 이용하였다. 세포가 붙은 plate를 도립현미경 위에 올려놓은 후 막전압 고정법(voltage-clamp method)을 이용하여 전류를 측정하였다.
TRPM7을 발현시키기 위해 사용한 human embryonic kidney (HEK) 293 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 10% fetal bovine serum (FBS), 1%penicillin/streptomycin, 5 µg/mL blasticidin, 0.
TRPM7을 클로닝한 플라스미드 DNA는 Dr. Scharenberg AM (Seattle Children's Research Institute, Seattle, WA, USA)로부터 제공받아 사용하였다.
TRPM7을 통한 전류를 측정하기 위한 pipette 용액은 145 mM Csglutamate, 8 mM NaCl, 10 mM 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid (Cs-BAPTA),10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)-CsOH를 포함한 용액에 CsOH를 이용하여 pH7.2로 맞춘 후 사용하였다.
Transient transfection을 위하여, HEK 293세포를 6-well 세포배양 plates에 5×105 세포에 24시간 배양한 후 이용하였다.
당귀수산(Dangkwisoo-san) 60 g을 광명당제약에서 구입하여 한약추출기(Herb Extractor, DW-290; Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, Korea)를 이용하여 물추출물의 형태로 추출하였다. 표층액을 3분 동안 4℃ 온도에서 110 g의 속도로 회전시킨 후에 –80℃에서 증발시킨 후 4.
본 실험에 사용한 TRPM7 유전자는 pCDNA 플라스미드 벡터(plasmid vector)에 클로닝(cloning)한 것을 사용하였다. TRPM7을 클로닝한 플라스미드 DNA는 Dr.
6 g을 얻을 수 있었다. 생강(Sigma-W252108)과 커큐민(Curcumin, Sigma-C7727)은 시그마(Sigma-Aldrich, St. Louis,MO, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 Student’s t-test를 사용하였으며 유의수준 P<0.05를 사용하였다.
이론/모형
Glass capillary를 이용하여 전극내부에 용액을 채웠을 때 저항이 3-5 메가옴(mega-ohm)에 해당하는 것을 실험에 이용하였다. 세포가 붙은 plate를 도립현미경 위에 올려놓은 후 막전압 고정법(voltage-clamp method)을 이용하여 전류를 측정하였다. 이상과 같은 방법으로 기록한 전류에 대한 결과 분석은 같은 회사의 clampit 소프트웨어를 이용하였다.
전류측정은 주로 ramp protocol을 이용하였다. 400 msec에 걸쳐 –100 mV로부터 +100 mV까지 전압을 변화시켜가면서 막을 통해 흐르는 전류를 측정하였다.
성능/효과
6). 따라서 커큐민은 TRPM7 기능 변화에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
본 연구는 당귀수산과 생강이 TRPM7 통로를 억제시키는기능이 있음을 확인한 연구로 TRPM7의 기능을 억제하여 TRPM7에 의해 조절되는 다양한 대사성질환을 조절할 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 또한 curcumin은 TRPM7조절 기능이 없어 TRPM7을 통한 대사성질환 조절 가능성은 없음을 확인하였다.
또한 당귀수산은 위장관 운동성 조절세포인 카할간질세포를 탈분극시켜서 위장관 운동성을 증가시킬 수 있는 가능성을 보여주었다20). 또한 본 연구에서 당귀수산은 TRPM7 통로를 조절하여 관련된 대사성질환 조절 가능성을 보여주었다. 생강은 몸이 냉하고 불안하고 통증이 있는 경우에 사용하며, 구역질 등이 있을 때 가라앉히는 효능이 있는 것으로 알려져 있다34).
후속연구
본 연구를 통해 당귀수산과 생강의 TRPM7 통로 조절 효과가 있음을 확인함으로써 향후 대사성 질환의 새로운 한약제제 조합 및 이온통로 조절을 통한 질환 예방 및 치료 소재발굴에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
그러므로 전해질 불균형을 통한 다양한 질환 발생을 TRPM7 통로 조절을 통해서 억제 또는 예방할 수 있으리라 생각된다8). 이러한 TRPM7에 당귀수산과 생강이 억제 기능을 가지고 있으므로 세포내 마그네슘 농도 조절을 통해서 다양한 TRPM7 관련 질환 발생을 억제 및 예방할 수 있으리라 생각된다. 또한 TRPM7은 reactive oxygen species에 의해서 활성화되어 신경 등에서 세포사멸에 관여하는 것으로 알려지고 있다9,31,32).
또한 항산화 효능이 있어 TRPC5와 transient receptor potential ankyrin 1 통로를 조절하는 것으로 알려져 있다35). 이러한 다양한 기능에 본 연구의 결과인 TRPM7 조절 기능을 첨가하여 앞으로 TRPM7의 새로운 기능이 밝혀질 때마다 당귀수산 및 생강의 새로운 기능을 확인할 수 있으리라 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
TRP 통로의 종류는 무엇이 있는가?
TRP 통로는 비선택성 양이온 통로의 하나로 다양한 생물학적 기능과 관련되어 있다. TRP 통로의 종류로는 classic 타입(transient receptor potential canonical [TRPC]1-TRPC7),vanilloid 타입(TRPV1-TRPV6), melastatin 타입(TRPM1-TRPM8), 그리고 polycystin 관련 타입(TRPP1-TRPP2) 등이 있다24). TRP 통로는 많은 질환 발생과 관련되어 있는데, 특히 심혈관질환과 관련된 경우가 많다25,26).
심혈관계질환이나 고혈압, 당뇨로 진단받는 환자 수와 그 사망률이 급속히 증가하게 된 원인은 무엇인가?
현재 건강검진에서 심혈관계질환이나 고혈압, 당뇨로 진단받은 환자 수와이로 인한 사망률이 급속히 증가하고 있다1). 이러한 변화는 식이나 운동과 같은 생활습관의 악화로 비만인구가 늘 고 혈중 지질농도가 증가하는 것이 주요 원인이다2). 심혈관계 및 뇌혈관질환, 고혈압과 이상지질혈증 등이 전신적 대사이상으로 진행하는 경우가 많으며3), 대사성 질환은 주로 심혈관계에 이상이 있음을 나타내는 경우가 많다.
처음 발견된 TRP 통로는?
비선택성 양이온 통로(non selective cation channel) 중에서 일과성 수용체 전압 통로(transient receptor potential,TRP channel)는 많은 생물학적 기능을 가지고 있음이 밝혀지고 있다. TRP 통로는 90년대 중반에 초파리의 시각계에 존재하는 광수용체(photoreceptor)로 처음 발견되었으며4), 이후 사람을 포함한 고등동물의 세포에도 존재함이 알려지면서 연구가 가속화되고 있다. TRP superfamily에 속하는 TRP 통로들은 현재까지 30여 가지가 알려져 있으며 생리적 기능도 각각 다르지만 종류에 관계없이 두 가지의 유사성을 가지고 있다.
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