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제안 방법
- 72시간동안 12시간 간격으로 시료 100 g 가량을 수집하였고,수집된 시료는 수분, 수분활성도, pH 및 곰팡이 수 측정과 효소 활성 평가를 위한 조효소 추출에 사용되었다. 조효소 추출방법은 다음과 같다.
- pH, 온도 및 NaCl 농도가 코지의 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, 앞선 결과에서 가장 효소활성이 높았던 것으로 나타난 0.5% 김 첨가, 배양 48시간 조건에서 코지를 제조하였고, 조효소 분리 후 다양한 pH, 온도 및 NaCl 농도에서 amylase 활성변화를 측정하였다(Fig. 3). 그 결과, pH 3-9, 온도 15-55℃ 반응조건에서 나타난 amylase 활성은 온도보다 pH에 더 큰 영향을 받는 것처럼 보였고, 주어진 모든 pH 조건에서 온도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 경향을 보였다.
- NaCl의 농도는 반응액의 최종농도 기준으로 NaCl을 첨가하여 조절하였다. pH와 온도에 따른 효소활성 변화를 측정하기위해 반응시간(1시간)과 NaCl 농도(0%)를 고정하였고, NaCl 농도에 따른 효소 활성 변화를 측정하기위해 반응시간(1시간)과 반응온도(35℃)를 고정하였다. 나머지 조건은 앞서 언급한 amylase와 protease 활성 측정 방법과 동일하다.
- 효소활성에 영향을 미치는 요인은 다양하지만, 코지의 산업적 적용범위 고려시 가장 크게 영향을 미칠 것으로 예상되는 pH,온도 및 NaCl 농도를 요인으로 결정하였다. 각 요인의 구간은 pH 3, 5, 7, 9, 온도 15, 25, 35, 45, 55℃, NaCl 농도 0, 2.5, 5,7.5, 10%로 설정하였다. pH의 조정을 위해 다음의 완충용액들을 제조하여 반응액으로 사용하였다.
- 그 후 4 mL의 탈이온수를 가한 뒤 실온에서 약 15분간 식혔고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 maltose의 양은 0.2% maltose를 표준용액으로 사용하여 적절하게 희석한 뒤 위와 동일하게 발색반응 시험을 진행하였고, 측정된 흡광도 값을 이용하여 standard curve를 작성한 후 시료 값을 대입하여 계산하였다. Amylase 활성은 1 g의 코지가 분당 1 mg의 maltose를 생성하는 것을 1 unit (U)으로 나타내었다.
- 상징액 200 μL에 o-phthalaldehyde reagent 3 mL를 가하고 약 30초간 혼합함과 동시 정확히 1분 30초 뒤 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 아미노산량은 0.05% serine을 표준물질로 standard curve를 작성하여 계산하였다. Protease 활성은 1 g의 코지가 분당 serine 1 μg을 유리하는 것을 1 U으로 나타내었다.
- 수분함량은 상압가열건조법(AOAC, 2005)으로 측정하였다. 수분활성도 측정을 위해, 시료는 수집 후 즉시 일회용 측정용기에 5 g을 칭량하여 커버를 닫고 20℃에서 약 1시간가량 정치시켰고, 수분활성도 측정기(HP23-AW-A, Rotronic, Switzerland)를 사용하여 수분활성도를 측정하였다.
- 곰팡이 수는 표준평판법(Park and Oh, 1995)으로 측정하였다. 시료 20 g과 멸균된 희석수 0.1% peptone water 180 mL를 멸균시료백에 담고 균질(260 rpm, 5분)하였고, 균질된 시료액을 동일한 희석수를 사용하여 십진법으로 적절하게 희석하였다. 희석된 시료액 1 mL는 potato dextrose agar(Difco; Becton Dckinson, Spark, MD, USA)에 도말하였고,28℃에서 72시간 배양한 뒤 생성된 colony 수(15-150)를 계수하여 log CFU/g으로 나타내었다.
- 쌀코지는 Jun et al. (2016)의 방법을 응용하여 제조하였다. 즉,원료미(1 kg)를 충분히 수세하고 16시간 동안 실온에서 침지 불림하였고, 40분동안 물 빼기 후 3종의 해조류 분말 각각을 불리기전 쌀 중량 대비 0.
- 5% 첨가시 가장 높게 나타났다(data not shown). 이 결과를 바탕으로 본 연구에서는 각 해조류 첨가농도를 0.5%로 동일하게 설정하였고, 종균 접종 후 배양하는 동안 각 코지의 수분함량 및 수분활성도에 대한 경시적인 변화를 Table 1로 나타내었다. 배양시간이 경과함에 따라 수분함량 및 수분활성도는 모든 구에서 수직적으로 감소되었고, 수분함량의 경우 다시마 첨가구가, 수분활성도의 경우 파래 첨가구가 각각 다른 구들에 비해 빠르게 감소되는 것처럼 보였다.
- 이에 본 연구에서는 대표적 식용 해조류인 김(Pyropia yezoensis), 다시마(Saccharina japonica), 파래(Enteromorpha sp.) 각각을 쌀코지 제조시 첨가하여 제조과정 중 amylase 및 protease 활성변화를 조사하였고, 효소활성이 가장 우수하다 판단된 해조류 첨가 코지로부터 얻어진 조효소액의 pH, 온도, NaCl 농도에 따른 amylase 및 protease 활성 변화를 시험하였다. 본 연구 결과는 새로운 형태의 효소제를 개발하거나 이것을 응용하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
- luchuensis 포자 분말을 3회로 나누어 골고루 접종하였다. 접종된 쌀은 발효기를 사용하여 일정한 상대습도(85%)와 온도(30℃)를 유지하여 72시간동안 배양하여 제조하였다.
- (2016)의 방법을 응용하여 제조하였다. 즉,원료미(1 kg)를 충분히 수세하고 16시간 동안 실온에서 침지 불림하였고, 40분동안 물 빼기 후 3종의 해조류 분말 각각을 불리기전 쌀 중량 대비 0.5% (w/w)가 되도록 첨가하고 골고루 섞어주었다. 대조구는 해조류를 첨가하지 않은 것을 말한다.
- 코지 시료내 amylase 활성은 Bechman et al. (2012)이 제안한 3,5-dinitrosalicylic acid 법을 약간 변형하여 측정하였다. 0.
- 대조구는 해조류를 첨가하지 않은 것을 말한다. 해조류 첨가 후 고압멸균기 105℃에서 40분간 증기로 익혀 고두밥을 만들었고, UV살균처리된 클린벤치에 만들어진 고두밥을 넓게 펼쳐 실온이 될 때까지 식혔으며, 여기에 원료 쌀 무게 대비 0.2%에 해당하는 종균 A. luchuensis 포자 분말을 3회로 나누어 골고루 접종하였다. 접종된 쌀은 발효기를 사용하여 일정한 상대습도(85%)와 온도(30℃)를 유지하여 72시간동안 배양하여 제조하였다.
- 효소활성에 영향을 미치는 요인은 다양하지만, 코지의 산업적 적용범위 고려시 가장 크게 영향을 미칠 것으로 예상되는 pH,온도 및 NaCl 농도를 요인으로 결정하였다. 각 요인의 구간은 pH 3, 5, 7, 9, 온도 15, 25, 35, 45, 55℃, NaCl 농도 0, 2.
대상 데이터
- 종균으로 사용된 Aspergillus luchuensis는 포자 분말로 된 것을 ㈜충무발효(Ulsan, Republic of Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 김과 다시마는 건조된 상태로 강릉시 중앙시장에서 구입하였고, 코지제조에 사용하기전 가정용 블랜더로 분쇄 후 40 mesh채에 내려 사용하였다. 파래는 온라인몰을 통하여 분말로 된 것을 구입하여 사용하였다.
- 쌀은 2016년 그해 재배된 것을 강릉시 사천농협으로부터 구입하여 사용하였다. 종균으로 사용된 Aspergillus luchuensis는 포자 분말로 된 것을 ㈜충무발효(Ulsan, Republic of Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
- 쌀은 2016년 그해 재배된 것을 강릉시 사천농협으로부터 구입하여 사용하였다. 종균으로 사용된 Aspergillus luchuensis는 포자 분말로 된 것을 ㈜충무발효(Ulsan, Republic of Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 김과 다시마는 건조된 상태로 강릉시 중앙시장에서 구입하였고, 코지제조에 사용하기전 가정용 블랜더로 분쇄 후 40 mesh채에 내려 사용하였다.
- 김과 다시마는 건조된 상태로 강릉시 중앙시장에서 구입하였고, 코지제조에 사용하기전 가정용 블랜더로 분쇄 후 40 mesh채에 내려 사용하였다. 파래는 온라인몰을 통하여 분말로 된 것을 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, 평균값들 사이 유의적 차이는 IBM SPSS statistics program (Version 23;IBM Co., Amork, NY, USA)을 사용하여 one-way ANOVA 방법에 따라 유의수준 95%에서 Tukey’s test에 의해 검정하였다.
이론/모형
- Protease 활성은 o-phthalaldehyde 법(Shakerian et al., 2014)을 응용하여 측정하였다. 0.
- pH 측정을 위해, 시료 5 g과 탈이온수 45 mL를 합한 후 약 1분간 균질하였고, 원심분리(7,000 g, 15분)하여 얻은 상등액을 pH meter (CH/Seven Easy-s20K, Mettler Toledo, Switzerland)로 측정하였다. 곰팡이 수는 표준평판법(Park and Oh, 1995)으로 측정하였다. 시료 20 g과 멸균된 희석수 0.
- 수분함량은 상압가열건조법(AOAC, 2005)으로 측정하였다. 수분활성도 측정을 위해, 시료는 수집 후 즉시 일회용 측정용기에 5 g을 칭량하여 커버를 닫고 20℃에서 약 1시간가량 정치시켰고, 수분활성도 측정기(HP23-AW-A, Rotronic, Switzerland)를 사용하여 수분활성도를 측정하였다.
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