선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- , 2016). 이에 본 연구에서 제주지역에서 분리한 어병세균 내 macrolide계 항생제인 Em에 대해 내성 수준을 확인하고, 내성균주들이 가지는 내성유전자에 대해 분석하고자 하였다.
- 3%로 oxytetracycline에 이어 국내 양식현장에서 많이 사용되고 있는 항생제로 알려져 있다(APQA, 2009). 이에 본 연구에서는 양식넙치에서 분리한 어병세균에서 Em 내성균주를 분리하고, PCR을 통해 Em에 대해 내성을 유발 하는 내성유전자를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- harveyi가 2균주로 확인되었다. 50개의 Vibrio 균주는 본 연구에서 동정을 위해 사용한 primer sets로는 확인되지 않아 V. alginolyticus, V. anguillarum, V. harveyi, V. parahae-molyticus 외 다른 Vibrio 균주로 추정하였다. 또한, 306균주 중 23균주는 본 연구에서 동정을 위해 사용한 선택배지와 primer sets로는 확인할 수 없어 미동정 균주로 분류하였다.
- tarda 39균주, Vibrio sp. 9균주로 총 81균주를 내성균주로 구분하였다. 2016년과 2017년도에 분리한 어병세균 내 내성균주는 각각 47균주(30.
- Em 내성균주는 약제감수성 실험에서 Em에 대해 증식억제대를 형성하지 않는 균으로 구분하였다. 분리균주 별 Em 내성균은 S.
- 각 균종 별 내성균 발생양상은 조사기간이 짧아 규정하기에 어려움이 있으며, 추후 Em 내성균주 발생에 대한 지속적인 모니터링이 실시되어져야 할 것으로 판단된다. Em 내성균주들은 MIC test를 통해 내성수준을 살펴본 후, 균주들이 지니고 있는 내성인자의 유전형을 PCR을 통해 분석하였다. CLSI 판단 기준(>8 μg/mL)에 따라 내성균주를 구분하였을 때, Vibrio sp.
- Em에 대해 내성을 가지는 내성균으로부터 total nucleic acid를 분리한 후, PCR을 통해 Em 내성 유전자를 확인하였다. erm (A), erm (B), erm (C), mef (A) 및 mef (E)의 검출을 위한 PCR 은 이전 Jun (2010)을 참고하여 수행하였으며, S.
- PCR 분석을 위하여 1 µM의 각 primer, 2.5 µM의 각 dNTP, 10x G-Taq Buffer, 2.5 U G-Taq DNA polymerase (Gene Pro Themal Cycler Cosmo) 및 tem-plate DNA를 첨가한 후, distilled water로 PCR 혼합물의 최종 volume이 20 μL가 되도록 하였다.
- 각 균주들의 정확한 균 동정은 Higene™ genemic DNA prep kit (BIO-FACT, Korea)를 사용하여 균주들의 genomic DNA를 추출한 후, Table 1에 제시한 primer sets를 사용하여 PCR을 통해 확인하였다.
- , USA)로 1/2씩 단계희석하였으며, 균 배양액의 농도는 105-106이 되도록 희석하여 준비하였다. 균주들의 MIC 값은 plate를 27℃에서 24시간 배양하여 균의 증식여부에 따른 액체배지의 혼탁도를 확인하여 균이 자라지 않은 최소농도로 결정하였다.
- parahae-molyticus 외 다른 Vibrio 균주로 추정하였다. 또한, 306균주 중 23균주는 본 연구에서 동정을 위해 사용한 선택배지와 primer sets로는 확인할 수 없어 미동정 균주로 분류하였다.
- 분리된 Em 내성균주들은 erm (A), erm (B), erm (C), mef (A) 및 mef (E)를 후보 유전자로 하여 PCR을 통해 존재여부를 살펴보았으며, 각 내성 관련 유전자 검출을 위한 primer 서열은 Table 2에 나타내었다. PCR 분석을 위하여 1 µM의 각 primer, 2.
- 약제감수성 검사 결과에 의하여 Em에 내성을 가지는 것이 확인된 81 내성균들을 대상으로 MIC test를 실시하여 내성수준을 확인하였다. S.
- PCR 반응은 94℃에서 3분간 pre-denaturation 실시한 후, 94℃ 30초 denaturation, 55℃ 30초 annealing, 72℃ 30초 extenstion 반응을 1 cycle로 하여 30 cycles 한 후, 72℃에서 7분간 post-extension 시켰다. 증폭 산물은 1% agarose gel 상에서 전기영동시킨 후, UV 검출기(UVP, USA)에서 band의 크기를 확인하여 내성유전자의 종류를 확인하였다.
- 실험균주는 2016년부터 2017년 제주지역 넙치 양식장의 병어로부터 분리하여 실험에 사용하였다. 채집한 균주들의 동정을 위해 시료의 내부 장기를 증균배지인 tryptic soy agar (TSA, Difco., USA) 및 brain heart infusion agar (BHIA, Dif-co., USA)와 선택배지인 thiosulfate citrate bile salts sucrose(TCBS) agar (Difco., USA), salmonella shigella (SS) agar (MB cell, Korea), glutamate starch phenol-red agar (GSP, Sigma-Aldrich, Korea), blood agar (KOMED, Korea)배지에 도말하고, 27℃에서 18-24시간 배양하여 균의 집락 형성 및 형태를 확인하였다. 분리된 균주는 추가적인 실험에 사용되기 전까지 –70℃에서 보관하였다.
- 항생물질의 최고 농도가 100 μg/mL가 되도록 하여 최종 농도가 0.78 μg/mL가 되도록 mueller hinton broth (MHB, Difco., USA)로 1/2씩 단계희석하였으며, 균 배양액의 농도는 105-106이 되도록 희석하여 준비하였다.
- 항생제 디스크는 모두 Liofilchem®에서 구입하였으며, amoxicillin (10 μg, AML), amoxicillin/cla-vulanic acid (30 μg, AUG), ampicillin (10 μg, AMP), chloramphenicol (10 μg, C), ciprofloxacin (5 μg, CIP), doxycycline (30 μg, DXT), enrofloxacin (5 μg, ENR), erythromycin (15 μg, E), gentamycin (10 μg, CN), kanamycin (30 μg, K), minocycline (30 μg, MN), nalidixic acid (30 μg, NA), neomycin (30 μg, N), norfloxacin (10 μg, NOR), ofloxacin (5 μg, OFX), oxolinic acid (2 μg, OA), oxytetracycline (30 μg, OT), penicillin (10 μg, P), streptomycin (10 μg, S), sulfadiazine (300 μg, SUZ), tetracycline (30 μg, TE)으로 총 21종을 사용하였으며, 배양 후 증식억제대를 확인하여 내성균을 분리하였다.
대상 데이터
- 2016년 3월부터 2017년 10월까지 제주지역 넙치 양식장에서 질병에 감염된 것으로 추정되는 넙치로부터 총 306균주를 분리하여 실험에 사용하였다. 선택배지인 SS, TCBS, GSP, Blood agar를 사용하여 분리균을 구분한 결과, Streptococcus sp.
- tarda 66균주, Vibrio sp. 56균주 및 미동정 균주 23균주 등 총 306균주를 분리하여 실험에 사용하였다. 이전 연쇄구균병은 L.
- 실험균주는 2016년부터 2017년 제주지역 넙치 양식장의 병어로부터 분리하여 실험에 사용하였다. 채집한 균주들의 동정을 위해 시료의 내부 장기를 증균배지인 tryptic soy agar (TSA, Difco.
이론/모형
- Em 내성균 분리 및 균주 내 항생제계열에 따른 내성비율 확인을 위하여, 항생제 감수성 시험을 clinical and laboratory standards institute (CLSI, 2017) 기준에 따라 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다. 분리균의 증균을 위하여 tryptic soy broth (TSB, Difco.
- 항생제 디스크는 모두 Liofilchem®에서 구입하였으며, amoxicillin (10 μg, AML), amoxicillin/cla-vulanic acid (30 μg, AUG), ampicillin (10 μg, AMP), chloramphenicol (10 μg, C), ciprofloxacin (5 μg, CIP), doxycycline (30 μg, DXT), enrofloxacin (5 μg, ENR), erythromycin (15 μg, E), gentamycin (10 μg, CN), kanamycin (30 μg, K), minocycline (30 μg, MN), nalidixic acid (30 μg, NA), neomycin (30 μg, N), norfloxacin (10 μg, NOR), ofloxacin (5 μg, OFX), oxolinic acid (2 μg, OA), oxytetracycline (30 μg, OT), penicillin (10 μg, P), streptomycin (10 μg, S), sulfadiazine (300 μg, SUZ), tetracycline (30 μg, TE)으로 총 21종을 사용하였으며, 배양 후 증식억제대를 확인하여 내성균을 분리하였다. 또한, Em 내성균의 내성수준은 broth dilution method를 적용한 minimum inhibitory concentration (MIC) test를 통해 확인하였고, Lee et al. (2010b)의 방법과 유사하게 실시하여 다음과 같다. 항생물질의 최고 농도가 100 μg/mL가 되도록 하여 최종 농도가 0.
- parauberis 균주에 의한 연쇄구균병이 다발하고 있는 것으로 보인다. 또한, Thompson et al. (2004)은 비브리오병이 60종이 넘는 다양한 비브리오균에 의해 발생되며, 계속해서 새로운 종이 발견되는 추세라 보고하였으며, 본 연구에서는 선택배지인 TCBS 배지 상에서 노란색 또는 초록색 집락을 형성하는 것으로 구분한 후, 이전 Demircan and Candan (2006), Kim et al. (2014), Kim et al. (2015)의 방법을 참고하여 각 균주의 세부적인 동정을 실시하였다. 그 결과, V.
성능/효과
- tarda 10균주, Vibrio sp. 1균주로 총 16균주(16.2%)가 확인되었으며, 성산, 남원, 대정 등의 서귀포시에서 분리된 207균주 중 내성균주는 S. parauberis 28균주, E. tarda 29균주, Vibrio sp. 8균주로 총 65균주(31.
- 9균주로 총 81균주를 내성균주로 구분하였다. 2016년과 2017년도에 분리한 어병세균 내 내성균주는 각각 47균주(30.1%), 32균주(22.4%)로 Em 내성균 발생률이 감소한 것을 확인하였다. 이에 조사기간 내 균종 별 발생비율을 조사한 결과, E.
- tarda 46균주, Vibrio sp. 38균주, 미동정 균주 3균주로 207균주가 분리되었음을 확인하였다.
- tarda 29균주, Vibrio sp. 8균주로 총 65균주(31.4%)가 분리되어 지역에 따른 내성균의 출현에 차이를 보였으며, 내성균주는 양식현장이 밀집되어 있는 서귀포시 지역에 많이 분포하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 조사 시기에 따른 내성균의 비율을 분석하였으며, 2016년도에 분리한 163균주 중 49 내성균주(30.
- iniae가 1균주로 확인되었으며, Lactococcus garvieae는 검출되지 않았다. E. tarda 균주는 선택배지인 SS배지 상에서 검은색 집락이 형성된 66균주를 채집하였으며, 정확한 동정을 위해 실시한 PCR 분석에서도 동일한 결과를 보였다. Vibrioceae의 동정 역시 PCR 분석을 통해 실시되었으며, 56균주의 Vibrio sp.
- 2). Em에 대해 내성을 가지는 E. tarda 39 내성균주 중 5균주(12.8%)에서 erm (B)가 확인되었으며, 그 외 다른 유전자는 발견되지 않았다. 또한, Vibrio sp.
- 56균주, 그리고 종이 확인되지 않은 23균주를 분리하였다. PCR을 통해 연쇄구균병의 원인균을 확인한 결과, S. parauberis가 160균주, S. iniae가 1균주로 확인되었으며, Lactococcus garvieae는 검출되지 않았다. E.
- S. parauberis 33균주 중 2균주가 100 μg/mL이상, 16균주가 50 μg/mL, 10균주는 25 μg/mL그리고 5균주가 12.5 μg/mL이하의 MIC 값을 나타내었다(Fig. 1).
- 균주들에 대하여 macrolide계 항생제 외에도 penicillins, tetracyclines 등을 포함한 다양한 계열의 항생제에 대해 증식억제대를 형성하지 않는 균주를 내성균주로 구분하였으며 각 균주 별 내성경향의 결과는 Table 3에 나타내었다. S. parauberis 균주는 quinolone계(91.9%), sulfonamide계(79.4%), tetracycline계(50%) 항생제 순서로 높은 내성률을 보였으며, E. tarda 균주에서는 penicillin계(80.3%), tetracycline계(75.8%), quinolone계(54.5%), sulfonamide계(45.5%) 항생제가 순서로 높은 내성비율을 나타내어 분리된 대부분의 균주 들이 특정 계열에 국한되지 않고 다양한 계열의 항생제에 대해 내성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, Vibrio sp.
- CLSI 판단 기준(>8 μg/mL)에 따라 내성균주를 구분하였을 때, Vibrio sp. 균주 내 확인된 Em 내성균주는 총 2균주로, 본 연구에서 검출을 시도한 어떠한 gene도 확인되지 않았다. 이전 Luna et al.
- 3%의 내성균이 확인되었으며, Vibrio sp. 균주도 10.2%, 12.5%로 E. tarda 균주와 유사하게 조사기간동안 내성균의 출현이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 S.
- 이전 제주도 내 Vibrio sp. 균주들의 세부적 종을 확인한 결과, V. scophthalmi, V. harveyi, V. anguillarum, Photobacterium damselae 등이 검출되어 본 연구에서 동정을 실시하지 않았던 다양한 종류의 비브리오 균주들이 제주도 내에 분포하고 있음을 확인할 수 있었다(Jo, 2006).
- 그러나, Vibrio sp. 균주에서는 penicillin계 항생제를 제외한 나머지 계열의 항생제에 대해 대체로 낮은 내성률이 관찰되었으며, 실험에 사용된 모든 균주는 chloramphenicol계 항생제에 대해 매우 낮은 내성률을 보였다.
- (2015)의 방법을 참고하여 각 균주의 세부적인 동정을 실시하였다. 그 결과, V. alginolyticus가 4균주, V. harveyi가 2균주로 확인되었다. 이전 제주도 내 Vibrio sp.
- 4%)가 분리되어 지역에 따른 내성균의 출현에 차이를 보였으며, 내성균주는 양식현장이 밀집되어 있는 서귀포시 지역에 많이 분포하고 있음을 알 수 있었다. 또한, 조사 시기에 따른 내성균의 비율을 분석하였으며, 2016년도에 분리한 163균주 중 49 내성균주(30.1%), 2017년도에 분리한 143균주 중 32 내성균주(22.4%)로 Em 내성균의 비율을 확인할 수 있었다.
- tarda, Vibrio sp. 에 비하여, Em에 대해 넓은 범위의 MIC 값을 가질 뿐만 아니라 비교적 높은 내성수준의 값을 가지는 것을 확인하였다.
- 4%)로 Em 내성균 발생률이 감소한 것을 확인하였다. 이에 조사기간 내 균종 별 발생비율을 조사한 결과, E. tarda 균주는 2016년과 2017년에 각각 42.9%, 56.3%의 내성균이 확인되었으며, Vibrio sp. 균주도 10.
- Vibrioceae의 동정 역시 PCR 분석을 통해 실시되었으며, 56균주의 Vibrio sp. 중 V. alginolyticus가 4균주, V. harveyi가 2균주로 확인되었다. 50개의 Vibrio 균주는 본 연구에서 동정을 위해 사용한 primer sets로는 확인되지 않아 V.
후속연구
- 3%)로 감소한 것을 확인하였다. 각 균종 별 내성균 발생양상은 조사기간이 짧아 규정하기에 어려움이 있으며, 추후 Em 내성균주 발생에 대한 지속적인 모니터링이 실시되어져야 할 것으로 판단된다. Em 내성균주들은 MIC test를 통해 내성수준을 살펴본 후, 균주들이 지니고 있는 내성인자의 유전형을 PCR을 통해 분석하였다.
- 이에 본 연구에서도 그람양성균에 대해 msr 유전자의 primer를 제작하여 존재유무를 확인할 필요가 있다고 생각된다. 또한, 비브리오에서는 mef 유전자 외 mph 유전자의 확인이 보고되어 있으며 추후 이에 대한 확인유무도 필요할 것으로 판단된다(Nonaka et al., 2015).
- 국내 양식현장에서는 외국에 비해 비교적 자유롭게 항생제를 투여하고 있기 때문에 기존에 존재한다고 보고되어진 유전자 이외의 새로운 내성결정인자가 발생할 가능성이 높으며, 이를 방지하기 위한 지속적인 연구가 필요하다. 본 연구 결과는 국내 양식넙치에서 분리되는 어병세균 내 다양한 계열의 항생제 내성비율 및 Em 내성유전자 분포에 관한 기초자료로 활용될 수있을 것으로 사료된다.
- (2010a)의 연구에서는 Em 내성유전자 검출을 위해 erm과 mef 유전자 외 msr 유전자를 추가적으로 실험을 실시하였으나 검출 되지 않았으며, erm (B)와 mef (A)가 높은 비율로 확인되었다 보고하였다. 이에 본 연구에서도 그람양성균에 대해 msr 유전자의 primer를 제작하여 존재유무를 확인할 필요가 있다고 생각된다. 또한, 비브리오에서는 mef 유전자 외 mph 유전자의 확인이 보고되어 있으며 추후 이에 대한 확인유무도 필요할 것으로 판단된다(Nonaka et al.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.