[논문]애기장대에서 activation tagging system을 이용한 새로운 고염 스트레스 반응 유전자의 동정

석혜연; 응웬부린; 배형준; 하지민; 김하연; 이선영; 문용환

doi:10.5352/jls.2018.28.9.1030

애기장대에서 activation tagging system을 이용한 새로운 고염 스트레스 반응 유전자의 동정
Identification of Novel Salt Stress-responsive Genes Using the Activation Tagging System in Arabidopsis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.28 no.9 = no.221, 2018년, pp.1030 - 1041

석혜연 (부산대학교 생명시스템학과) , 응웬부린 (부산대학교 생명시스템학과) , 배형준 (부산대학교 생명시스템학과) , 하지민 (부산대학교 생명시스템학과) , 김하연 (부산대학교 생명시스템학과) , 이선영 (부산대학교 생명시스템학과) , 문용환 (부산대학교 생명시스템학과)

초록
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환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하며 작물의 생산량을 감소시키는 주요 원인이다. 식물은 다양한 유전자의 발현 변화를 통해 스트레스에 대한 저항성을 나타낸다. 본 연구에서는 activation tagging system을 이용하여 기존에 밝혀지지 않은 새로운 고염 스트레스 반응 유전자들을 분리하였다. 애기장대의 발아 단계에서 고염 스트레스에 저항성을 보이는 9개의 activation tagging 라인을 선별하였다. 그 중 TAIL-PCR 방법을 이용하여 AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, AT7548, AT7556의 6개 라인에서 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였으며 각 라인에서 T-DNA가 삽입된 주변 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하였는데 AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, AT7556에서 각각 ClpC2/HSP93-III (At3g48870), plant thionin family (At2g20605), anti-muellerian hormone type-2 receptor (At3g50685), vacuolar iron transporter family protein (At4g27870), microtubule-associated protein (At5g16730)이 activation 된 것으로 밝혀졌다. 더불어 AT7548에서는 T-DNA가 삽입된 곳의 양쪽에 위치하는 두 유전자인 Arabinogalactan protein 13 (AGP13) (At4g26320)과 F-box/RNI-like/FBD-like domains-containing protein (At4g26340)이 모두 activation 되었다. Activation 된 7개 유전자는 기존에 고염 스트레스 저항성과 관련된 기능이 알려지지 않은 유전자로 본 연구를 통해 새롭게 고염 스트레스 반응에 대한 기능이 밝혀졌다. 7개의 activation된 유전자 중 ClpC2/HSP93-III, AGP13, F-box/RNI-like/FBD-like domains-containing protein의 3개 유전자는 고염 스트레스에 의해 발현이 증가하였다. 또한 AT7508과 AT7527, AT7544 라인은 발아 단계뿐만 아니라 유식물체 발달 과정에서도 고염 스트레스 저항성을 보여 activation tagging 라인의 선별 결과의 타당성을 뒷받침 하였다. 본 연구의 결과를 통해 activation tagging system이 새로운 스트레스 반응 유전자를 찾아낼 수 있는 유용한 기술임을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Abiotic stresses limit the growth and productivity of plants. Cellular adaptation to abiotic stresses requires coordinated regulation in gene expression directed by complex mechanisms. This study used the activation tagging system to identify novel salt stress-responsive genes. The study selected 9 activation tagging lines that showed salt stress-tolerant phenotypes during their germination stages. Thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR) was used to identify the T-DNA tagging sites on the Arabidopsis genome in selected activation tagging lines, including AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, AT7548, and AT7556. RT-PCR analysis showed that ClpC2/HSP93-III (At3g48870), plant thionin family (At2g20605), anti-muellerian hormone type-2 receptor (At3g50685), vacuolar iron transporter family protein (At4g27870), and microtubule-associated protein (At5g16730) were activated in AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, and AT7556, respectively. Interestingly, in AT7548, both the genes adjacent to the T-DNA insertion site were activated: Arabinogalactan protein 13 (AGP13) (At4g26320) and F-box/RNI-like/FBD-like domains-containing protein (At4g26340). All of the seven genes were newly identified as salt stress-responsive genes from this study. Among them, the expression of ClpC2/HSP93-III, AGP13, F-box/RNI-like/FBD-like domains-containing protein gene, and microtubule-associated protein gene were increased under salt-stress condition. In addition, AT7508, AT7527, and AT7544 were more tolerant to salt stress than wild type at seedling development stage, functionally validating the screening results of the activation tagging lines. Taken together, our results demonstrate that the activation tagging system is useful for identifying novel stress-responsive genes.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

더욱이 이미 동정된 환경 스트레스 반응 유전자들의 40-50% 이상이 아직도 그 기능이 규명되지 않았다[19]. 본 연구에서는 activation tagging system을 이용하여 애기장대의 고염 스트레스 저항성 형질전환체를 선별하고 이들 형질전환체에서 activation 된 유전자를 확인하여 기존에 밝혀지지 않은 새로운 고염 스트레스 반응 유전자들을 분리하고자 하였다.

제안 방법

1차 TAIL-PCR 반응은 애기장대 genomic DNA 1 μl, 0.5 μM LB1과 AD 프라이머, 0.5 mM dNTP, 0.5 unit F-taq DNA polymerase (Solgent, Korea), 2 μl 10× buffer를 포함하는 총 20 μl 반응액에서 수행하였다.
1차와 2차 선별 과정을 통해 선별된 activation tagging 라인들이 발아 단계에서 고염 스트레스에 대한 저항성을 보였으므로(Fig. 2) 이후 실험에서는 선별된 라인들이 유식물 단계에서도 고염 스트레스에 대한 저항성을 보이는지 조사하였다. 이를 위해 선별된 activation tagging 라인 중 AT7508, AT7527, AT7544의 유식물체를 이용하여 고염 스트레스에 대한 반응을 조사하였다.
1차와 2차로 나누어 고염 스트레스 저항성 라인을 선별하였다. 1차 선별에서는 5개 T₁라인 각각의 종자를 50개씩 섞은 mix 라인을 준비하여 200 mM NaCl과 10 μg/l DL-phosphinothricin이 포함된 MS 배지에 발아시켰다.
2차 TAIL-PCR 반응은 1차 TAIL-PCR 반응액 1 μl, 0.5 μM LB2와 AD 프라이머, 0.5 mM dNTP, 1.25 unit F-taq DNA polymerase, 5 μl 10× buffer를 포함하는 총 50 μl 반응액에서 수행하였다.
2차 TAIL-PCR에서 얻은 PCR 산물을 LaboPass^TM Gel Extraction Kit (Cosmogenetech, Korea)로 분리하여 삽입된 T-DNA 주변의 염기서열을 확인하기 위한 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 Cosmogenetech에 의뢰하였다.
Activation tagging system을 이용하여 애기장대의 새로운 고염 스트레스 반응 유전자를 찾기 위해 activation tagging 벡터인 pFGL942 (Fig. 1A)가 도입된 애기장대 형질전환체를 이용하여 고염 스트레스에 저항성을 보이는 activation tagging 라인을 선별하였다[12]. 1차 선별에서 생존율 확인 결과 mix 462, mix 463, mix 465, mix 466, mix 469, mix 470, mix 472를 포함하는 모두 7개의 mix 라인이 높은 생존율을 보여 고염 저항성을 가지는 것으로 확인되었다(Fig.
Homozygous 형질전환체는 10 μg/l DL-phosphinothricin을 포함한 MS 배지에 발아하고 7일 뒤에 생존율과 녹색 자엽을 확인하여 선별하였다.
5 mM dNTP를 포함하는 50 μl 반응액에서 수행하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 45초, 56℃에서 45초, 72℃에서 45초의 PCR 반응을 반복하고, 72℃에서 10분간의 추가 신장 단계를 거쳐 수행하였다. 유전자 발현의 상대량 분석을 위한 표준화에는 GAPc를 사용하였다.
두 번의 선별 과정을 거친 9개 라인 중 6개 라인으로부터 genomic DNA를 분리하여 1차와 2차로 구성된 TAIL-PCR 반응을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물을 추출하여 염기서열 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 위치의 주변 genomic DNA 서열을 얻었고, 이들 서열의 분석을 통해 각 라인들의 genome 상에서 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였다(Fig. 3).
Quantitative RT-PCR은 0.4 μl cDNA, 10 μl 2× Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA), 0.25 μM 유전자-특이적 프라이머를 포함하는 20 μl 반응액으로 Quant Studio 3 real-time PCR system (Applied Biosystems, USA)에서 수행하였으며, QuantStudioTM Design and Analysis software (version 1.4)로 분석하였다.
Semi-quantitative RT-PCR은 1 μl cDNA, 1.25 unit F-taq DNA polymerase, 5 μl 10× buffer, 0.5 μM 유전자-특이적 프라이머, 0.5 mM dNTP를 포함하는 50 μl 반응액에서 수행하였다.
T-DNA가 삽입된 위치의 주변 유전자가 T-DNA의 35S enhancer에 의해 activation 되었다고 생각되어 각 T-DNA가 삽입된 위치의 양쪽에 존재하는 유전자를 대상으로 야생형에서의 발현과 activation tagging 형질전환체에서의 발현을 비교하였다. AT7508에서는 T-DNA가 삽입된 위치의 양쪽에 존재하는 At3g48860과 At3g48870의 발현을 비교하였는데 At3g 48860은 야생형과 AT7508 형질전환체에서 별다른 발현의 차이를 보이지 않은 반면에 At3g48870은 야생형에 비해 AT7508에서 더 높은 발현을 보여 AT7508에서는 삽입된 T-DNA의 35S enhancer에 의해 At3g48870이 activation 됨을 확인하였다(Fig.
고염 스트레스 조건에서 유전자들의 발현 양상을 확인하기 위해 발아 후 10일된 야생형 유식물체를 300 mM NaCl 용액으로 적신 필터 종이 위에 옮겨 0, 1, 2, 4, 8시간 동안 처리한 후 시간별 유전자 발현 양상을 관찰하였다.
5B). 고염 스트레스에 대한 식물의 생리적 반응을 확인하는 지표로 Photosystem II (PS II) 활성을 이용하여 광합성 효율을 분석하였다[5]. 그 결과 PS II 활성을 나타내는 F_v/F_m 수치가 AT7508이 야생형에 비해 높았다(Fig.
고염 스트레스에 저항성을 보이는 것으로 선별된 개별 라인에서 activation 된 유전자를 확인하기 위하여 먼저 각 라인의 genome 상에 35S enhancer를 포함하는 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였다. 두 번의 선별 과정을 거친 9개 라인 중 6개 라인으로부터 genomic DNA를 분리하여 1차와 2차로 구성된 TAIL-PCR 반응을 수행하여 PCR 산물을 얻었다.
광합성 효율(F_v/F_m) 측정은 고염 스트레스를 처리한 유식물체가 놓인 plate를 20분 동안 암처리를 한 뒤 FluorCam FC-800 (Photon Systems Instruments, Czech)을 이용하여 수행하였다. 광합성 효율 측정 및 F_v/F_m 수치 계산은 제조사의 지시 사항에 따라 이루어졌다.
4A). 그리고 AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, AT7548, AT7556의 6개 라인에서 activation 된 7개의 유전자의 발현을 조사하였다.
세대의 형질전환체를 0, 150, 160 mM NaCl이 포함된 MS 배지로 옮겼다. 단일조건에서 계속 배양하고 옮긴 뒤 8-12일째 되는 날에 표현형을 관찰하였으며 광합성 효율과 생체중을 측정하였다.
고염 스트레스에 저항성을 보이는 것으로 선별된 개별 라인에서 activation 된 유전자를 확인하기 위하여 먼저 각 라인의 genome 상에 35S enhancer를 포함하는 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였다. 두 번의 선별 과정을 거친 9개 라인 중 6개 라인으로부터 genomic DNA를 분리하여 1차와 2차로 구성된 TAIL-PCR 반응을 수행하여 PCR 산물을 얻었다. PCR 산물을 추출하여 염기서열 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 위치의 주변 genomic DNA 서열을 얻었고, 이들 서열의 분석을 통해 각 라인들의 genome 상에서 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였다(Fig.
선별된 activation tagging 라인에서 발현이 activation 된 유전자들은 고염 스트레스 저항성에 관여할 것으로 여겨지며, 이들 유전자의 발현은 고염 스트레스에 의해 조절될 가능성이 높다. 따라서 선별된 유전자들의 고염 스트레스 조건에서의 발현을 분석하였다. 발아 후 10일 된 야생형에 300 mM NaCl을 다양한 시간별로 처리한 뒤 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하였다.
이를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 발현을 조사하였다. 먼저 고염 스트레스에 의해 발현이 증가하는 것으로 잘 알려진 RD29A의 발현을 확인하여 고염 스트레스가 제대로 처리되었는지를 확인하였다(Fig. 4A). 그리고 AT7508, AT7512, AT7527, AT7544, AT7548, AT7556의 6개 라인에서 activation 된 7개의 유전자의 발현을 조사하였다.
따라서 선별된 유전자들의 고염 스트레스 조건에서의 발현을 분석하였다. 발아 후 10일 된 야생형에 300 mM NaCl을 다양한 시간별로 처리한 뒤 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하였다. 이를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 발현을 조사하였다.
1차 선별에서는 5개 T₁라인 각각의 종자를 50개씩 섞은 mix 라인을 준비하여 200 mM NaCl과 10 μg/l DL-phosphinothricin이 포함된 MS 배지에 발아시켰다. 발아 후 17일째부터 31일째까지 3일 또는 4일 간격으로 생존율을 확인하여 높은 생존율을 보이는 라인을 선별하였다.
발아 후 2주 된 T₂ 형질전환체들로부터 LaboPass^TM Genomic DNA Isolation Kit (Cosmogenetech, Korea)를 이용하여 genomic DNA를 분리하였다.
식물의 스트레스 반응에 관여하는 다양한 유전자들이 지금까지 밝혀졌으며 이러한 유전자들을 찾는 과정은 다양한 연구 방법들을 통해 이루어져 왔다. 본 연구에서는 activation tagging system을 이용하여 고염 스트레스 저항성 activation tagging 라인을 선별하고, 선별된 라인들의 분석을 통해 고염 스트레스 저항성에서 기능할 것으로 예상되는 다양한 유전자를 분리하였다. 선별된 9개의 activation tagging 라인은 모두 발아 단계에서 고염 스트레스에 대한 높은 저항성을 보였으며 이들 중 AT7508과 AT7527, AT7544는 유식물 단계에서도 야생형보다 높은 고염 스트레스 저항성을 보였다(Fig.
선별된 라인에서 activation 된 유전자들의 정보를 TAIR에서 확인하였다. AT7508에서 activation 된 At3g48870은 Chloroplast-localized paralog (Clp) C2/HSP93-III 단백질을 암호화 하는 유전자로, ClpC2는 엽록체의 스트로마에 주로 위치하며 Clp protease complex의 subunit을 구성하는 것으로 알려져 있다(Table 4).
애기장대(Arabidopsis thaliana)는 Col-0 ecotype을 사용하였다. 애기장대 종자는 70% ethanol에서 1분, 10% Clorox에서 10분간 표면을 소독한 뒤 멸균한 증류수로 4회 이상 세척하고 암상태의 4℃에서 2일 동안 춘화처리를 하였다. 그 후 vitamin B5, 1.
염기서열 분석은 Cosmogenetech에 의뢰하였다. 얻어진 염기서열을 대상으로 NCBI의 BlastN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 분석을 통해 T-DNA가 삽입된 위치를 확인하였고, TAIR (http://www.arabidopsis.org)에서 주변 유전자의 정보를 확인하였다.
역전사 반응은 2 μg 총 RNA, 200 unit Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega, USA), 5 μl 5× buffer, 0.5 μg oligo dT 프라이머, 0.5 mM dNTP를 포함하는 총 25 μl 반응액에서 수행하였다.
4)로 분석하였다. 유전자 발현의 상대량 분석을 위한 표준화에는 GAPc를 사용하였다.
발아 후 10일 된 야생형에 300 mM NaCl을 다양한 시간별로 처리한 뒤 RNA를 분리하여 cDNA를 합성하였다. 이를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 발현을 조사하였다. 먼저 고염 스트레스에 의해 발현이 증가하는 것으로 잘 알려진 RD29A의 발현을 확인하여 고염 스트레스가 제대로 처리되었는지를 확인하였다(Fig.
2) 이후 실험에서는 선별된 라인들이 유식물 단계에서도 고염 스트레스에 대한 저항성을 보이는지 조사하였다. 이를 위해 선별된 activation tagging 라인 중 AT7508, AT7527, AT7544의 유식물체를 이용하여 고염 스트레스에 대한 반응을 조사하였다. 먼저 야생형과 AT7508, AT7527, AT7544를 MS 배지에서 발아시킨 후 5일 뒤에 0, 150, 160 mM NaCl이 포함된 MS 배지로 옮겼다.
형질전환체의 고염 스트레스 반응 분석을 위해 발아 후 5일 된 야생형과 T₂ 세대의 형질전환체를 0, 150, 160 mM NaCl이 포함된 MS 배지로 옮겼다. 단일조건에서 계속 배양하고 옮긴 뒤 8-12일째 되는 날에 표현형을 관찰하였으며 광합성 효율과 생체중을 측정하였다.

대상 데이터

Survival ratio and phenotype were observed from 17 to 31 days after germination (DAG) with 3 or 4 days-interval. Photographs were taken at 31 DAG.
T-DNA 삽입 위치를 확인하기 위하여 1차와 2차로 구성된 thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR) 방법을 사용하였다[13]. T-DNA border-특이적 프라이머(LB)와 8종류의 arbitrary degenerate (AD) 프라이머를 함께 PCR에 사용하였으며 사용한 프라이머의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.
이를 위해 선별된 activation tagging 라인 중 AT7508, AT7527, AT7544의 유식물체를 이용하여 고염 스트레스에 대한 반응을 조사하였다. 먼저 야생형과 AT7508, AT7527, AT7544를 MS 배지에서 발아시킨 후 5일 뒤에 0, 150, 160 mM NaCl이 포함된 MS 배지로 옮겼다. 그 결과 AT7508 유식물체가 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 보였으며 생체 중도 더 무거웠다(Fig.
애기장대 형질전환체는 10 μg/l DL-phosphinothricin (Sigma-Aldrich, USA)을 포함한 MS 배지에 발아하거나 토양에 발아하여 10일, 14일째에 각각 0.2%(v/v) Basta (Bayer Crop Science, Germany)를 뿌려서 선별하였다.
애기장대(Arabidopsis thaliana)는 Col-0 ecotype을 사용하였다. 애기장대 종자는 70% ethanol에서 1분, 10% Clorox에서 10분간 표면을 소독한 뒤 멸균한 증류수로 4회 이상 세척하고 암상태의 4℃에서 2일 동안 춘화처리를 하였다.
총 RNA는 RNAqueous Kit (Life technologies, USA)와 Plant RNA Isolation Aid (Life technologies, USA)를 이용하여 분리하였다. 역전사 반응은 2 μg 총 RNA, 200 unit Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega, USA), 5 μl 5× buffer, 0.
1B, Table 3). 확인된 7개 mix 라인에 포함된 35개의 개별 라인을 대상으로 2차 선별을 수행하였다. 2차 선별 수행 결과 mix 462에서는 activation tagging 라인 7508 (AT7508)이, mix 463에서는 AT7512와 AT7515가, mix 465에서는 AT7522가, mix 466에서는 AT7527이, mix 469에서는 AT7543과 AT7544가, mix 470에서는 AT7548이, mix 472에서는 AT7556이 각각 고염 저항성을 보이는 라인으로 최종 선별되었다(Fig.

이론/모형

T-DNA 삽입 위치를 확인하기 위하여 1차와 2차로 구성된 thermal asymmetric interlaced-PCR (TAIL-PCR) 방법을 사용하였다[13]. T-DNA border-특이적 프라이머(LB)와 8종류의 arbitrary degenerate (AD) 프라이머를 함께 PCR에 사용하였으며 사용한 프라이머의 염기서열은 Table 1에 나타내었다.

성능/효과

1A)가 도입된 애기장대 형질전환체를 이용하여 고염 스트레스에 저항성을 보이는 activation tagging 라인을 선별하였다[12]. 1차 선별에서 생존율 확인 결과 mix 462, mix 463, mix 465, mix 466, mix 469, mix 470, mix 472를 포함하는 모두 7개의 mix 라인이 높은 생존율을 보여 고염 저항성을 가지는 것으로 확인되었다(Fig. 1B, Table 3). 확인된 7개 mix 라인에 포함된 35개의 개별 라인을 대상으로 2차 선별을 수행하였다.
확인된 7개 mix 라인에 포함된 35개의 개별 라인을 대상으로 2차 선별을 수행하였다. 2차 선별 수행 결과 mix 462에서는 activation tagging 라인 7508 (AT7508)이, mix 463에서는 AT7512와 AT7515가, mix 465에서는 AT7522가, mix 466에서는 AT7527이, mix 469에서는 AT7543과 AT7544가, mix 470에서는 AT7548이, mix 472에서는 AT7556이 각각 고염 저항성을 보이는 라인으로 최종 선별되었다(Fig. 2, Table 3). 선별된 라인들은 모두 30% 이상의 생존율을 보였고 발아 후 17일부터 31일까지 꾸준히 높은 고염 스트레스 저항성을 보였다(Fig.
AT7508에서는 3번 염색체의 At3g48860과 At3g48870 사이에 T-DNA가 삽입된 것을 확인했으며 AT7512에서는 2번 염색체 상의 At2g20610의 3‘ UTR에 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다(Fig. 3A, Fig. 3C).
T-DNA가 삽입된 위치의 주변 유전자가 T-DNA의 35S enhancer에 의해 activation 되었다고 생각되어 각 T-DNA가 삽입된 위치의 양쪽에 존재하는 유전자를 대상으로 야생형에서의 발현과 activation tagging 형질전환체에서의 발현을 비교하였다. AT7508에서는 T-DNA가 삽입된 위치의 양쪽에 존재하는 At3g48860과 At3g48870의 발현을 비교하였는데 At3g 48860은 야생형과 AT7508 형질전환체에서 별다른 발현의 차이를 보이지 않은 반면에 At3g48870은 야생형에 비해 AT7508에서 더 높은 발현을 보여 AT7508에서는 삽입된 T-DNA의 35S enhancer에 의해 At3g48870이 activation 됨을 확인하였다(Fig. 3B). AT7512에서는 At2g20605가 야생형에 비해 높은 발현을 보인 반면에 At2g20610은 별다른 차이를 보이지 않아 At2g20605가 activation 된 것을 확인하였다(Fig.
AT7527 유식물체의 고염 반응을 분석한 결과 AT7508과 마찬가지로 고염 스트레스에 대해 야생형 유식물체보다 높은 저항성을 보였으며 생체중도 무거웠다(Fig. 5E, Fig. 5F). 또한 F_v/F_m 수치도 야생형 유식물체에 비해 높은 값을 보여 광합성 효율도 좋았다(Fig.
AT7512에서 activation 된 At2g20605는 식물의 thionin family 단백질을 암호화 하는 것으로 확인되었다 (Table 4). AT7527에서 activation 된 유전자인 At3g50685는 anti-muellerian hormone type-2 receptor를 암호화 하는 유전자로 확인되었다(Table 4). AT7544에서 activation 된 유전자인 At4g27870은 Vacuolar iron transporter (VIT) family 단백질을 암호화 하며 세포 내 Mn 이온의 항상성 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다(Table 4).
AT7544 유식물체 또한 야생형 유식물체에 비해 높은 생체 중과 F_v/F_m 수치를 보여 고염 스트레스에 대해 야생형보다 높은 저항성을 가지는 것을 확인하였다(Fig. 5I, Fig. 5J, Fig. 5K, Fig. 5L).
3F). AT7544의 경우 At4g27860은 야생형과 AT7544에서 별다른 발현의 차이가 나타나지 않은 반면에 At4g27870은 야생형보다 AT7544에서 높은 발현을 보여 At4g27870이 activation 된 유전자임을 알 수 있었다(Fig. 3H). AT7548의 경우 T-DNA가 삽입된 At4g26330의 양쪽에 존재하는 At4g26320과 At4g26340의 발현을 확인한 결과 At4g26320과 At3g26340 모두의 발현이 야생형에 비해 AT7548에서 높은 것으로 나타났다(Fig.
3H). AT7548의 경우 T-DNA가 삽입된 At4g26330의 양쪽에 존재하는 At4g26320과 At4g26340의 발현을 확인한 결과 At4g26320과 At3g26340 모두의 발현이 야생형에 비해 AT7548에서 높은 것으로 나타났다(Fig. 3J). 따라서 35S enhancer가 양쪽에 존재하는 두 유전자를 모두 activation 시킨 것을 확인하였다.
먼저 야생형과 AT7508, AT7527, AT7544를 MS 배지에서 발아시킨 후 5일 뒤에 0, 150, 160 mM NaCl이 포함된 MS 배지로 옮겼다. 그 결과 AT7508 유식물체가 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 보였으며 생체 중도 더 무거웠다(Fig. 5A, Fig. 5B). 고염 스트레스에 대한 식물의 생리적 반응을 확인하는 지표로 Photosystem II (PS II) 활성을 이용하여 광합성 효율을 분석하였다[5].
고염 스트레스에 대한 식물의 생리적 반응을 확인하는 지표로 Photosystem II (PS II) 활성을 이용하여 광합성 효율을 분석하였다[5]. 그 결과 PS II 활성을 나타내는 F_v/F_m 수치가 AT7508이 야생형에 비해 높았다(Fig. 5C, Fig. 5D). 이러한 결과는 AT7508 유식물체가 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 가지고 있음을 나타낸다.
AT7508에서 activation 된 유전자인 ClpC2 (At3g48870)의 경우 기능 소실 돌연변이체가 야생형과 비교하여 별다른 표현형을 보이지 않으며, ClpC1이 중복된 기능을 가지는 것으로 여겨지기 때문에 activation tagging system이 아니었다면 찾아내기 어려웠을 유전자 중 하나였다고 생각된다. 더불어 AT7512와 AT7544에서 activation 된 것으로 확인된 유전자인 At2g20605와 At3g27870은 고염 스트레스 조건에서도 별다른 발현의 변화를 보이지 않았으며 AT7527에서 activation 된 유전자인 At3g50685는 오히려 고염 스트레스에 의해 발현이 감소하는 패턴을 보였다(Fig. 4). 이러한 유전자들 역시 유전자 발현 분석을 통한 연구로는 고염 스트레스 저항성에 관여할 것으로 예측하기 어려웠을 유전자들로, 이러한 결과들은 activation tagging system의 유용성을 보여준다.
4E). 더불어 AT7527에서 activation 된 것으로 확인했던 At3g50685는 고염 스트레스 조건에서 오히려 발현이 감소하는 패턴을 보였다(Fig. 4D).
3J). 따라서 35S enhancer가 양쪽에 존재하는 두 유전자를 모두 activation 시킨 것을 확인하였다. 마지막으로, AT7556에서는 T-DNA가 At5g16740의 내부에 삽입되어, 이 유전자의 양쪽에 존재하는 At5g16730과 At5g16750의 발현을 분석하였는데 At5g16750은 야생형과 AT7556 형질전환체에서 별다른 발현의 차이를 보이지 않은 반면에 At5g16730은 AT7556에서 야생형에 비해 높은 발현을 보였다(Fig.
4H). 따라서 AT7508, AT7548, AT7556의 3개 라인에서 activation 된 4개 유전자 모두가 고염 스트레스에 의해 발현이 증가하였으며 이러한 결과는 이 유전자들이 애기장대의 고염 스트레스 저항성에 관여함을 나타낸다.
3L). 따라서 AT7556에서는 35S enhancer에 의해 At5g16730이 activation 됨을 확인할 수 있었다.
4). 따라서 이들 4개 유전자는 식물이 고염 스트레스에 처했을 때 발현이 증가하여 고염 스트레스에 대한 저항성에 관여할 것으로 생각된다.
이러한 결과는 각 activation tagging 라인의 고염 스트레스에 대한 반응이 발아부터 유식물까지 유기적으로 이어지고 있음을 나타낸다. 또한 AT7508, AT7548, AT7556에서 activation 된 것으로 확인된 4개 유전자인 At3g48870, At4g26320, At4g26340, At5g16730의 발현이 고염 스트레스에 의해 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4). 따라서 이들 4개 유전자는 식물이 고염 스트레스에 처했을 때 발현이 증가하여 고염 스트레스에 대한 저항성에 관여할 것으로 생각된다.
3C). 또한 AT7527에서는 3번 염색체 상의 At3g50670과 At3g50685 사이에, AT7544에서는 4번 염색체의 At4g27860과 At4g27870 사이에 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다(Fig. 3E, Fig. 3G). AT7548에서는 4번 염색체 상의 At4g26330 내부에, AT7556에서는 5번 염색체 상의 At5g16740 내부에 T-DNA가 삽입된 것을 확인하였다(Fig.
5F). 또한 F_v/F_m 수치도 야생형 유식물체에 비해 높은 값을 보여 광합성 효율도 좋았다(Fig. 5G, Fig. 5H). 이러한 결과는 AT7527 유식 물체 또한 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 가지고 있음을 나타낸다.
따라서 35S enhancer가 양쪽에 존재하는 두 유전자를 모두 activation 시킨 것을 확인하였다. 마지막으로, AT7556에서는 T-DNA가 At5g16740의 내부에 삽입되어, 이 유전자의 양쪽에 존재하는 At5g16730과 At5g16750의 발현을 분석하였는데 At5g16750은 야생형과 AT7556 형질전환체에서 별다른 발현의 차이를 보이지 않은 반면에 At5g16730은 AT7556에서 야생형에 비해 높은 발현을 보였다(Fig. 3L). 따라서 AT7556에서는 35S enhancer에 의해 At5g16730이 activation 됨을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 activation tagging system을 이용하여 고염 스트레스 저항성 activation tagging 라인을 선별하고, 선별된 라인들의 분석을 통해 고염 스트레스 저항성에서 기능할 것으로 예상되는 다양한 유전자를 분리하였다. 선별된 9개의 activation tagging 라인은 모두 발아 단계에서 고염 스트레스에 대한 높은 저항성을 보였으며 이들 중 AT7508과 AT7527, AT7544는 유식물 단계에서도 야생형보다 높은 고염 스트레스 저항성을 보였다(Fig. 2, Fig. 5). 이러한 결과는 각 activation tagging 라인의 고염 스트레스에 대한 반응이 발아부터 유식물까지 유기적으로 이어지고 있음을 나타낸다.
2, Table 3). 선별된 라인들은 모두 30% 이상의 생존율을 보였고 발아 후 17일부터 31일까지 꾸준히 높은 고염 스트레스 저항성을 보였다(Fig. 2).
5D). 이러한 결과는 AT7508 유식물체가 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 가지고 있음을 나타낸다.
5H). 이러한 결과는 AT7527 유식 물체 또한 야생형 유식물체에 비해 높은 고염 스트레스 저항성을 가지고 있음을 나타낸다.
AT7556에서 activation 된 At5g16730은 microtubule-associated protein을 암호화 하는 유전자로 mRNA가 세포와 세포 사이를 이동하는 것으로 알려져 있다(Table 4). 이를 통해 다양한 유전자들이 애기장대의 고염 스트레스 반응에서 기능을 할 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

후속연구

이러한 유전자들 역시 유전자 발현 분석을 통한 연구로는 고염 스트레스 저항성에 관여할 것으로 예측하기 어려웠을 유전자들로, 이러한 결과들은 activation tagging system의 유용성을 보여준다. 후속 연구들을 통해 본 연구에서 선별된 유전자의 분자적 기능과 생물학적 기능을 밝힘으로써 고염 스트레스 저항성에서의 역할과 작용 기작을 알아낼 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	스트레스 조건에서 발현이 변하지 않는 경우 Activation tagging system은 어떻게 스트레스 저항성에 관여하는 유전자를 찾아낼 수 있는가?	Activation tagging system은 새로운 스트레스 반응 유전자를 찾아낼 수 있는 또 다른 강력한 기술로, 특정 유전자가 과발현된 기능 획득 형질전환체를 직접적으로 분석할 수 있어서 환경 스트레스 저항성에서 기능을 하는 유전자를 곧바로 밝힐 수 있다[12, 32]. 또한 스트레스 조건에서 발현이 변하지 않는 경우에도 과발현체는 스트레스 저항성에 기여하는 경우, 기능 소실 돌연변이체가 치사 표현형을 보이거나 기능적으로 중복되는 유전자를 가지는 경우에도 표현형 관찰을 통해 스트레스 저항성에 관여하는 유전자들을 찾아낼 수 있다[9, 14].
	Activation tagging system이란 무엇인가?	Activation tagging system은 새로운 스트레스 반응 유전자를 찾아낼 수 있는 또 다른 강력한 기술로, 특정 유전자가 과발현된 기능 획득 형질전환체를 직접적으로 분석할 수 있어서 환경 스트레스 저항성에서 기능을 하는 유전자를 곧바로 밝힐 수 있다[12, 32]. 또한 스트레스 조건에서 발현이 변하지 않는 경우에도 과발현체는 스트레스 저항성에 기여하는 경우, 기능 소실 돌연변이체가 치사 표현형을 보이거나 기능적으로 중복되는 유전자를 가지는 경우에도 표현형 관찰을 통해 스트레스 저항성에 관여하는 유전자들을 찾아낼 수 있다[9, 14].
	식물에 있어서 환경 스트레스는 어떠한 원인이 되는가?	환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하며 작물의 생산량을 감소시키는 주요 원인이다. 식물은 다양한 유전자의 발현 변화를 통해 스트레스에 대한 저항성을 나타낸다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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