[논문]고려엉겅퀴 주정 추출물을 함유하는 임상시험제품의 항비만 활성 평가

조봉연; 최선일; 최승현; 심완섭; 라문진; 김선영; 강일준; 한경찬; 이옥환

doi:10.13103/jfhs.2018.33.5.389

고려엉겅퀴 주정 추출물을 함유하는 임상시험제품의 항비만 활성 평가
Anti-obesity Activities of Cirsium setidens Nakai Ethanolic Extract 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.33 no.5, 2018년, pp.389 - 398

조봉연 (강원대학교 식품생명공학과) , 최선일 (강원대학교 식품생명공학과) , 최승현 (강원대학교 식품생명공학과) , 심완섭 (강원대학교 식품생명공학과) , (강원대학교 식품생명공학과) , 라문진 (홍천메디칼허브연구소) , 김선영 (홍천메디칼허브연구소) , 강일준 (한림대학교 식품영양학과) , 한경찬 ((주)하티) , 이옥환 (강원대학교 식품생명공학과)

초록
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본 연구는 고려엉겅퀴 주정추출물을 가지고 제작된 임상시험용제품(CNTM)이 3T3-L1 지방세포 및 고지방식이로 유도된 비만 쥐에 미치는 항비만 효능 관찰을 통하여 체지방 개선 기능성식품을 개발하기위하여 인체적용시험 시료를 제작한 후, 인체적용시험전에 그 효력이 유지됨을 확인하기위해 수행되었다. 본 연구에 사용된 시료 CNTM은 $80{\sim}320{\mu}g/mL$ 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, 지방 축적억제 효능 및 지방세포 분화, 지질대사 관련 유전인자들을 유의적으로 변화시키는 것으로 확인되었다. 또한 동물실험에서 CNTM 처리에 의하여 체중의 감소를 확인하였으며 혈중지질 성분 가운데 HDL-C/TC의 비율은 유의적으로 증가하며 LDL-cholesterol (LDL-C)과 non-esterified fatty acid (NEFA)의 비율은 유의적으로 감소하여 혈중 유리지방산 농도를 감소시키며 혈중 콜레스테롤 상승을 억제시키고 혈당을 감소시키는 효과가 있는 것으로 평가되었다. 따라서 고려엉겅퀴 주정추출물이 함유된 인체적용시험시료(CNTM)는 체지방 개선에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to evaluate anti-obesity activity of Cirsium setidens Nakai test material (CNTM) in 3T3-L1 adipocytes and obese C57BL/6J mice fed with a high-fat diet using various obesity-related in vitro experiments. During adipocyte differentiation, CNTM significantly inhibited lipid accumulation and ROS production compared to controls. To evaluate whether CNTM could exert glycerol release effects on mature 3T3-L1 adipocytes, we treated cells with various concentrations of CNTM for 1 h. Treatment of mature adipocytes with $160-320{\mu}g/mL$ of CNTM increased the release of glycerol, but not in a significant dose-dependent manner. Anti-adipogenic and anti-lipogenic effects of CNTM seemed to be mediated by the inhibition of $PPAR{\gamma}$ and $C/EBP{\alpha}$. Moreover, CNTM stimulated fatty acid oxidation in an AMPK-dependent manner. CNTM-treated groups of C57BL/6J mice showed reduced body weights and adipose tissue weight with improving serum lipid profiles and adiponectin protein expression in obese C57BL/6J mice fed with a high-fat diet. These results suggest that CNTM might have anti-obesity effect on adipogenesis and lipid metabolism in vitro and in vivo. This presents the possibility of developing a treatment for obesity using nontoxic natural resources.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 고려엉겅퀴 주정추출물의 항비만 효과를 기반으로 한 건강기능식품을 개발하기 위하여 인체적용시험용 시료(CNTM, test material of Cirsium setidens Nakai)를 제작하였으며, 본 시료의 인체적용시험 전 비임상효력을 확인하기 위하여 항비만 효과를 평가하고자 하 였다. 또한, 본 인체적용시험 시료의 항비만 효과를 비만 유도 동물모델에서 평가하여 인체적용시험 전의 효력을 확인하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 고려엉겅퀴 주정추출물의 항비만 효과를 기반으로 한 건강기능식품을 개발하기 위하여 인체적용시험용 시료(CNTM, test material of Cirsium setidens Nakai)를 제작하였으며, 본 시료의 인체적용시험 전 비임상효력을 확인하기 위하여 항비만 효과를 평가하고자 하 였다. 또한, 본 인체적용시험 시료의 항비만 효과를 비만 유도 동물모델에서 평가하여 인체적용시험 전의 효력을 확인하고자 하였다.
Ursolic acid를 primary rat adipocyte에 처리하여 glycerol의 방출 정도를 측정한 Li 등²³⁾의 연구결과에 따르면 glycerol의 방출기작은 cAMP-dependent PKA pathway 통하여 조절됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서 지방세포로부터 발생한 glycerol 방출정도는 CNTM 처리에 의해 cAMP-dependent PKA 작용기전을 조절함으로써 나타난 결과로 판단되었다.
동결 건조한 고려엉겅퀴 주정추출물을 감압 농축하여 동결건조 시킨 뒤 얻은 추출물 분말에 부형제를 첨가하여 임상 시험제품(CNTM)을 제작하였다. 본 임상시험제품에 대한 인체적용시험 전에 세포와 동물실험 모델에서 효능이 유지되는지 여부를 평가하기 위하여 본 임상시험제품을 다시 분말화 하여 본 시험을 진행하였다.

제안 방법

3T3-L1 지방세포 분화 후 방출된 glycerol의 양은 lipolysis assay kit (Biovision, Milpitas, CA, USA)를 이용하여 측정 하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포를 lipolysis wash buffer 를 이용하여 2회 세척한 뒤 lipolysis assay buffer에 시료를 첨가하여 1시간 동안 반응 시키고 96 well plate에 배양액 50 μL과 0~10 nM 농도의 glycerol 표준물질 50 μL 그리고 glycerol reagent 50 μL을 넣고 1시간동안 반응시킨 뒤 570 nm에서 측정하고 glycerol 표준물질의 흡광도를 바탕으로 표준검량곡선을 작성한 뒤 배양액 내 glycerol 의 방출정도를 계산하였다.
분화 6일차가 되었을 때 1 mL의 XTT reagent와 20 μL PMS reagent (Nmethylphenazonium methyl sulfate)를 혼합하여 working solution을 준비하여 놓고, pipet을 이용하여 96-well medium 부피의 20% 되는 양 만큼 취하고 각각의 well에 조심스 럽게 첨가하여 plate를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. 4시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후, microplate reader (Spectramax i3, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산 하였다.
96-well plate의 각 well에 혈청 시료와 표준 시료를 5 μL씩 분주한 후, Color Reagent Solution A를 200 μL씩 분주하고 37℃에서 5분 동안 반응시킨 다음 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, Color Reagent Solution B를 100 μL씩 분주한 다음 37℃ 에서 5분 동안 반응시킨 후 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 표준 시료의 흡광도와 비교하여 계산하였다.
실험동물은 무작위로 정상식이군(ND; n = 10), 고지방식이군(HFD; n = 10), 고지방식이에 Cirsium setidens Nakai Tablet Material (CNTM)을 주정추출물 함량이 100 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 160; n = 10), 고지방식이에 CNTM을 주정추출물 함량이 200 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 320; n = 10)으로 총 4군으로 나누어 실험을 진행하였다. CNTM은 균질화하여 증류수 에 녹여 사용하였으며 총 8주간의 경구투여를 실시하였다. 실험기간 동안 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 주 1회 식수섭취량, 식이섭취량을 산출하였다.
CNTM의 지방 생성 및 분해와 관련된 단백질 발현과의 연관성을 확인하기 위해 western blot을 이용하여 AMPKα, ACC, CPT-1, adiponectin의 발현량을 측정하였으며 그 결과는 Fig. 3과 같다.
CNTM이 갖는 지방축적억제능이 지방세포 형성 억제 작용기전과 어떤 연관성이 있는지 확인하기 위하여 CNTM 처리를 통하여 adipogenesis에 관여하는 주요 핵심 유전인 자인 C/EBPα와 PPARγ의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다.
CNTM이 지방세포분화를 억제할 뿐만 아니라 생성된 지방의 제거에도 효과적으로 반응을 하는지 판단하기위해 지방세포 내 중성지방 제거능을 lipolysis assay kit를 통하분석하였다. 그 결과는 Fig.
혈중 지질 농도 및 간독성을 조사한 결과는 Table 3과 같다. 간독성을 조사하기 위해 AST와 ALT를 측정하였으며 혈액의 지질 농도를 조사하기 위해 GLU, TG, TC, HDLC, LDL-C, NEFA를 측정하였다. 임상시험용 시료 투여군 의 AST, ALT의 수치는 HFD군과 비교 시 유의적인 차이를 나타내지 않아 8주간의 경구투여가 독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.
본 연구에 사용한 고려엉겅퀴 주정추출물과 임상 시험용 제품(CNTM)의 제조는 각각 ㈜하티(Hongcheon, Korea), ㈜팜크로스(Chuncheon, Korea)에서 진행하였으며 이를 제 공받아 사용하였다. 고려엉겅퀴 주정추출물의 제조는 건조된 고려엉겅퀴 10 kg에 40% 주정에탄올(w/w, 시료의 25 배)을 사용하여 70℃에서 2시간 가압 순환추출을 진행하였고, 이를 감압농축한 뒤 동결건조기를 이용하여 고려엉겅퀴 주정 추출물(CSE)을 제작하였다. 고려엉겅퀴 주정추 출물내 pectolinarin의 함량은 53.
단백질을 2×, 5× sample buffer와 혼합 후 95℃에서 5분간 열을 가하였고, 100 V로 90분 동안 10% SDS-PAGE를 이용하여 size 별로 분리하였다.
동결 건조한 고려엉겅퀴 주정추출물을 감압 농축하여 동결건조 시킨 뒤 얻은 추출물 분말에 부형제를 첨가하여 임상 시험제품(CNTM)을 제작하였다.
따라서 본 연구에서는 CNTM을 160 및 320 μg/mL 의 농도로 지방전구세포에 처리하여 지방세포 분화억제 및 ROS 생성 저감 효능 등의 항비만 활성을 평가하였다.
사육이 끝난 실험동물은 12시간 절식시킨 후 2,2,2-tribromoethanol (Sigma-Aldrich)와 2-methyl-2-buthanol (SigmaAldrich)에 의해 마취시켜 혈액을 채취하였으며 12,000 g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 분석 전까지 혈청은 -70^o C에 보관하였으며 혈청에서 간 기능의 지표인 aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT)의 분석과 지질함량의 지표인 Glucose (GLU), trigly-ceride (TG), total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C)의 함량을 Automated Clinical Chemistry Analyzer (FUJI DRI-CHEM NX500i; Fujifilm, Japan)를 사용하여 분석하였다.
분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정 하고자 각각의 시료를 처리하여 24-well에서 6일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% formalin 용액 500 μL을 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거 하였다.
분화과정에 따른 지방세포 내 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well에 배양 및 분화된 3T3-L1 세 포의 배양액을 제거한 후 멸균된 PBS (phosphate buffer saline, pH 7.4)를 이용하여 2회 세척하고 0.2% NBT 용액 200 μL을 첨가하여 CO2 incubator안에서 90분간 반응시킨 뒤 KOH solution (DMSO:1N KOH = 7:3)을 이용하여 dark blue formazan을 모두 용출시킨 후 동량의 증류수를 첨가하여 잘 섞어준 후 microplate reader 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
분화된 3T3-L1 지방세포를 lipolysis wash buffer 를 이용하여 2회 세척한 뒤 lipolysis assay buffer에 시료를 첨가하여 1시간 동안 반응 시키고 96 well plate에 배양액 50 μL과 0~10 nM 농도의 glycerol 표준물질 50 μL 그리고 glycerol reagent 50 μL을 넣고 1시간동안 반응시킨 뒤 570 nm에서 측정하고 glycerol 표준물질의 흡광도를 바탕으로 표준검량곡선을 작성한 뒤 배양액 내 glycerol 의 방출정도를 계산하였다.
CNTM은 균질화하여 증류수 에 녹여 사용하였으며 총 8주간의 경구투여를 실시하였다. 실험기간 동안 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 주 1회 식수섭취량, 식이섭취량을 산출하였다. 실험동물의 무게는 주 1회 측정하였다.
D12450B)를 공급하였다. 실험동물은 무작위로 정상식이군(ND; n = 10), 고지방식이군(HFD; n = 10), 고지방식이에 Cirsium setidens Nakai Tablet Material (CNTM)을 주정추출물 함량이 100 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 160; n = 10), 고지방식이에 CNTM을 주정추출물 함량이 200 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 320; n = 10)으로 총 4군으로 나누어 실험을 진행하였다. CNTM은 균질화하여 증류수 에 녹여 사용하였으며 총 8주간의 경구투여를 실시하였다.
실험기간 동안 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 주 1회 식수섭취량, 식이섭취량을 산출하였다. 실험동물의 무게는 주 1회 측정하였다.
이로부터 2일 후에, 지방세포 분화유도 물질(1 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 10% FBS 및 10% P/S를 함유한 DMEM으로 전구지방세포를 지방세포로 분화 유도하였다.
이로부터 2일 후에, 지방세포 분화유도 물질(1 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS (10%) 및 P/S (10%)를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도 하였다.
임상시험용 시료가 adipogenesis의 adipocyte specific genes이며 lipogenesis를 억제하고 lipolysis를 촉진하는 주요한 바이오 마커인 adiponectin의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 부고환 지방조직으로부터 단백질을 추출하여 western blot을 통해 분석하였다(Fig. 4). Adiponetin의 발현 정도는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 감소하였으며 임상시험용 시료(CNTM)를 처리함에 따라 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
5주령의 수컷 C57BL/6J mice를 ㈜중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 정상식이군을 제외한 모든 군은 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 고지방식이(HFD; 60% kcal fat; Research Diet, Inc., No. D12492)를 공급하여 2주간 비만 유도를 하였으며 정상식이군은 총 칼로리의 10%가 지방인 일반식이(ND; 10% kcal fat; Research Diet, Inc., No. D12450B)를 공급하였다. 실험동물은 무작위로 정상식이군(ND; n = 10), 고지방식이군(HFD; n = 10), 고지방식이에 Cirsium setidens Nakai Tablet Material (CNTM)을 주정추출물 함량이 100 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 160; n = 10), 고지방식이에 CNTM을 주정추출물 함량이 200 mg/kg/day 농도가 되도록 투여한 군(HFD+CNTM 320; n = 10)으로 총 4군으로 나누어 실험을 진행하였다.
지방세포 분화(Day 0)시 DMEM에 고려엉겅퀴 주정추출물의 농도가 100, 200 μg/ mL 농도로 처리되도록 CNTM 시료를 각각 160 그리고 320 μg/mL로 처리하였고, 이때 CNTM의 효과를 관찰하기 위하여 negative control에는 아무것도 처리하지 않았다.
지방세포 분화(day 0)시 각각의 시료를 80, 160 및 320 μg/mL 농도로 처리하였다.
지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 1 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리하였다.

대상 데이터

3T3-L1 세포배양 및 분화에 사용된 시약으로 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였으며 N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O (ORO), isopropanol 은 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부 터 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), bovine serum (BS), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
3T3-L1 지방세포의 분화 과정 중, 임상시험용 제품에 의한 지방세포 분화를 관찰하기 위해 사용된 마우스 유래 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 전지방세포를 실험목적에 따라 24-well plate 에 각각 5 × 10⁶ cell 농도로 seeding한 후, 10% BS 및 1% P/S를 함유한 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때 까지 배양하였다.
5주령의 수컷 C57BL/6J mice를 ㈜중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일 동안 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 정상식이군을 제외한 모든 군은 비만 유도를 위하여 총 칼로리의 60%가 지방인 고지방식이(HFD; 60% kcal fat; Research Diet, Inc.
본 연구에 사용한 고려엉겅퀴 주정추출물과 임상 시험용 제품(CNTM)의 제조는 각각 ㈜하티(Hongcheon, Korea), ㈜팜크로스(Chuncheon, Korea)에서 진행하였으며 이를 제 공받아 사용하였다. 고려엉겅퀴 주정추출물의 제조는 건조된 고려엉겅퀴 10 kg에 40% 주정에탄올(w/w, 시료의 25 배)을 사용하여 70℃에서 2시간 가압 순환추출을 진행하였고, 이를 감압농축한 뒤 동결건조기를 이용하여 고려엉겅퀴 주정 추출물(CSE)을 제작하였다.
35 mg/g으로 분석되었다19). 임상 시험용 제품의 제조는 고려엉겅퀴 주정추출물 62.5% 와 부형제(결정셀룰로오스, 이산화규소, 스테아린산마그네슘 등) 37.5%를 혼합하여 800 mg tablet 제형의 본 시험시료를 제작하였으며 이를 다시 분말화하여 본 실험에 사용하였다. 3T3-L1 세포배양 및 분화에 사용된 시약으로 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하여 사용하였으며 N-acetyl-L-cysteine (NAC), insulin, dexamethasone (DEX), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O (ORO), isopropanol 은 Sigma (Sigma-Aldrich Co.

데이터처리

Values with different superscripts indicate statistically significant differences among groups at p < 0.05 by one-way ANOVA.
유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan's multiple range test)으로 유의성은 p < 0.05 수준에서 검정하였다.
항비만 활성 결과 값의 통계처리는 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하였으며 Duncan의 다중범위 검정법(Duncan's multiple range test)으로 유의성은 p < 0.

이론/모형

3T3-L1 지방세포에 대한 CNTM 시료의 세포 독성평가 는 Kim 등²⁰⁾의 방법에 따라 XTT {2,3-bis(2-methoxy-4- nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay Kit WelGene, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 2 × 10⁶ cell 농도로 96-well plate에 seeding하고 BS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다.
혈청 중 유리지방산(NEFA: non-esterified fatty acid) 농도는 ACS-ACOD법을 활용한 NEFA-HR(2) reagent (Wako, Osaka, Japan)를 사용하여 분석하였다. 96-well plate의 각 well에 혈청 시료와 표준 시료를 5 μL씩 분주한 후, Color Reagent Solution A를 200 μL씩 분주하고 37℃에서 5분 동안 반응시킨 다음 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하고, Color Reagent Solution B를 100 μL씩 분주한 다음 37℃ 에서 5분 동안 반응시킨 후 550 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 표준 시료의 흡광도와 비교하여 계산하였다.

성능/효과

고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND) 에 비하여 체중이 유의하게 증가되어 고지방식이로 인한 비만이 유도되었음을 알 수 있으며 고지방식이군과 비교 시 임상시험용 시료(CNTM)를 처리함에 따라 체중 증가량이 유의적으로 감소하였다. 8주 동안의 식이 섭취량 또한 각 군별로 유의한 차이가 없었으며 칼로리 섭취량은 일반 식이를 공급한 정상식이군을 제외한 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 식이 효율의 경우에도 고 지방식이군이 정상식이군 보다 유의하게 높았으나, 임상 시험용 시료를 처리함에 따라 유의하게 낮은 결과를 보였다.
4). Adiponetin의 발현 정도는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 감소하였으며 임상시험용 시료(CNTM)를 처리함에 따라 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 임상시험용 시료가 지방세포 분화를 억제하여 지방산 합성을 억제하고 분해를 촉진하여 체지방감소에 효과가 있을 것이라 사료되었다.
CNTM을 농도별로 처리한 후 pAMPKα, p-ACC, CPT-1, adiponectin 발현을 측정한 결과 대조군과 비교하였을 때 유의성 있는 변화를 나타내었다.
CNTM을 처리하지 않은 대조군에 비하여 CNTM 160, 320 μg/mL 농도에서 지방축적 억제정도는 각각 22, 34%로 CNTM 처리 시 농도 유의적으로 지방축적량의 감소치를 나타내었다.
임상시험용 시료 투여군 의 AST, ALT의 수치는 HFD군과 비교 시 유의적인 차이를 나타내지 않아 8주간의 경구투여가 독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. HDL-cholesterol (HDLC)은 HFD군과 임상시험용 시료 투여군 간의 유의한 차이를 나타내지 않았으나 total cholesterol (TC)은 HFD군에 비해 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 감소하여 HDLC/TC에 대한 비율은 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 증가하였다. LDL-cholesterol (LDL-C)은 HFD군에 비하여 HFD+CNTM160군, 특히 HFD+CNTM320군에서 유의적으로 감소하였으며 glucose (GLU)에서도 HFD군에 비해 임상시험용 시료를 처리함에 따라 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
HDL-cholesterol (HDLC)은 HFD군과 임상시험용 시료 투여군 간의 유의한 차이를 나타내지 않았으나 total cholesterol (TC)은 HFD군에 비해 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 감소하여 HDLC/TC에 대한 비율은 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 증가하였다. LDL-cholesterol (LDL-C)은 HFD군에 비하여 HFD+CNTM160군, 특히 HFD+CNTM320군에서 유의적으로 감소하였으며 glucose (GLU)에서도 HFD군에 비해 임상시험용 시료를 처리함에 따라 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, non-esterified fatty acid (NEFA) 의 수치에서도 HFD군에 비해 임상시험용 시료를 처리함에 따라 유의적으로 감소하였으며 이는 임상시험용 시료가 혈중 유리지방산 농도를 감소시키며 혈중 콜레스테롤 상승을 억제시키고 혈당을 감소시키는 효과가 있는 것으로 사료되었다.
각 군의 간과 신장, 비장, 부고환 지방 그리고 내장 지 방조직의 상대무게는 각 기관의 무게(g)에 100을 곱한 후, 마우스의 체중으로 나눈 값으로 Table 2에 나타난 바와 같다. 간과 비장조직의 상대 무게는 고지방식이군(HFD)과 비교 시 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 감소하였으며 신장 조직의 상대무게는 정상식이군(ND)을 제외하 고는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 부고환지방조직과 내장지방조직의 상대무게는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 증가하였으며 HFD+CNTM160 특히, HFD+ CNTM320군에서 유의적으로 감소하였다.
고려엉겅퀴 주정추출물의 농도를 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 처리하기위해 CNTM을 80, 160 및 320 μg/mL의 농도로 처리한 결과 위 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 현미경상에서 morphology의 변화도 관찰되지 않았다.
Initial body weight에는 그룹별로 유의한 차이를 나타내지 않았으나 final body weight에는 그룹별 유의한 차이를 나타냈다. 고지방식이군(HFD)이 정상식이군(ND) 에 비하여 체중이 유의하게 증가되어 고지방식이로 인한 비만이 유도되었음을 알 수 있으며 고지방식이군과 비교 시 임상시험용 시료(CNTM)를 처리함에 따라 체중 증가량이 유의적으로 감소하였다. 8주 동안의 식이 섭취량 또한 각 군별로 유의한 차이가 없었으며 칼로리 섭취량은 일반 식이를 공급한 정상식이군을 제외한 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CNTM이 지방세포분화를 억제할 뿐만 아니라 생성된 지방의 제거에도 효과적으로 반응을 하는지 판단하기위해 지방세포 내 중성지방 제거능을 lipolysis assay kit를 통하분석하였다. 그 결과는 Fig. 1(D)과 같이 MDI로 분화시킨 지방세포에 CNTM을 처리한 결과 세포 내 축적되어 있던 중성지방의 분해로 인하여 배지로 방출된 glycerol의 양이 증가된 것으로 나타났으나 CNTM 처리에 따른 glycerol 방출정도는 농도 유의적으로 효과를 보이지 않았다. Ursolic acid를 primary rat adipocyte에 처리하여 glycerol의 방출 정도를 측정한 Li 등²³⁾의 연구결과에 따르면 glycerol의 방출기작은 cAMP-dependent PKA pathway 통하여 조절됨을 보고한 바 있다.
대조군에 비하여 CNTM 160, 320 μg/mL 처리농도에서 ROS 생성량은 각각 17, 22% 정도 감소하는 것으로 나타났다.
대조군에서 두 인자의 단백질 발현을 확인한 결과 유의적으로 증가되었으며 C/EBPα의 경우 CNTM 160, 320 μg/mL 처리농도에서 단백질발현은 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었으며, PPARγ의 경우에는 CNTM 160, 320 μg/mL 처리농도에서 농도 유의적으로 단백질 발현이 감소되었다.
부고환지방조직과 내장지방조직의 상대무게는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 증가하였으며 HFD+CNTM160 특히, HFD+ CNTM320군에서 유의적으로 감소하였다. 따라서 임상시 험제품을 처리한 군에서의 부고환지방조직 및 내장지방조직의 축적량이 고지방식이군에 비해 유의적으로 감소한 것으로 나타나 임상시험제품이 장기 내부에 지방이 축적되는 것을 억제하는 효과가 있을 것이라 사료되었다.
LDL-cholesterol (LDL-C)은 HFD군에 비하여 HFD+CNTM160군, 특히 HFD+CNTM320군에서 유의적으로 감소하였으며 glucose (GLU)에서도 HFD군에 비해 임상시험용 시료를 처리함에 따라 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 또한, non-esterified fatty acid (NEFA) 의 수치에서도 HFD군에 비해 임상시험용 시료를 처리함에 따라 유의적으로 감소하였으며 이는 임상시험용 시료가 혈중 유리지방산 농도를 감소시키며 혈중 콜레스테롤 상승을 억제시키고 혈당을 감소시키는 효과가 있는 것으로 사료되었다.
간과 비장조직의 상대 무게는 고지방식이군(HFD)과 비교 시 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 감소하였으며 신장 조직의 상대무게는 정상식이군(ND)을 제외하 고는 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 부고환지방조직과 내장지방조직의 상대무게는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 증가하였으며 HFD+CNTM160 특히, HFD+ CNTM320군에서 유의적으로 감소하였다. 따라서 임상시 험제품을 처리한 군에서의 부고환지방조직 및 내장지방조직의 축적량이 고지방식이군에 비해 유의적으로 감소한 것으로 나타나 임상시험제품이 장기 내부에 지방이 축적되는 것을 억제하는 효과가 있을 것이라 사료되었다.
8주 동안의 식이 섭취량 또한 각 군별로 유의한 차이가 없었으며 칼로리 섭취량은 일반 식이를 공급한 정상식이군을 제외한 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 식이 효율의 경우에도 고 지방식이군이 정상식이군 보다 유의하게 높았으나, 임상 시험용 시료를 처리함에 따라 유의하게 낮은 결과를 보였다..
이러한 결과를 바탕으로 CNTM이 갖는 지방축적 억제능이 adipogenesis 에 관여하는 핵심인자의 단백질 발현 저해를 통해 나타나며 특히 C/EBPα, PPARγ 발현 조절을 통해 나타날 수 있다는 가능성을 확인하였다.
활성화된 AMPK는 SREBP-1c, PPARγ 및 FAS와 같은 지방세포화 인자 및 지질합성에 관계된 유전자의 발현을 억제함으로써 지방 합성을 억제시키고 ACC의 인산화를 통한 비활성화와 CPT-1의 활성화 를 통해 미토콘드리아 내막으로 지방산 이동을 증가시켜 β-oxidation을 촉진시킨다고 알려져 있다^24,28,29). 이러한 연구 결과를 바탕으로 CNTM의 처리는 adiponectin의 발현을 조절 및 AMPK 활성화를 통해 에너지 항상성 유지 및 지방 대사 조절에 관여하는 것으로 사료되었다.
Adiponetin의 발현 정도는 ND군에 비해 HFD군에서 유의적으로 감소하였으며 임상시험용 시료(CNTM)를 처리함에 따라 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 임상시험용 시료가 지방세포 분화를 억제하여 지방산 합성을 억제하고 분해를 촉진하여 체지방감소에 효과가 있을 것이라 사료되었다.
간독성을 조사하기 위해 AST와 ALT를 측정하였으며 혈액의 지질 농도를 조사하기 위해 GLU, TG, TC, HDLC, LDL-C, NEFA를 측정하였다. 임상시험용 시료 투여군 의 AST, ALT의 수치는 HFD군과 비교 시 유의적인 차이를 나타내지 않아 8주간의 경구투여가 독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. HDL-cholesterol (HDLC)은 HFD군과 임상시험용 시료 투여군 간의 유의한 차이를 나타내지 않았으나 total cholesterol (TC)은 HFD군에 비해 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 감소하여 HDLC/TC에 대한 비율은 임상시험제품 투여 군에서 유의적으로 증가하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	비만관련치료제의 부작용은 무엇인가?	비만은 신체 에너지 섭취와 소비의 불균형으로 인해 체지방이 과잉 축적되어 발생되는 현상으로 심혈관계 질환, 제 2형 당뇨, 고혈압, 고지혈증 등 만성 질환의 발생 가능 성을 증가시키는 주요 요인 중 하나로 볼 수 있다1). 비만을 치료하기 위해서 다양한 비만관련치료제가 출시되고 있으나 지방 변, 두통, 메스꺼움 등의 부작용이 발생한다고 보고된 바 있다2,3). 따라서 비만치료에 있어 부작용은 적지만 우수한 효과를 기대할 수 있는 천연물을 활용한 항 비만 소재 개발이 요구되는 실정이다4,5).
	Adipogenesis 후기에 발현되는 인자와 그 특징은 무엇인가?	Adipogenesis라고 불리는 지방세포형성과정은 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정이며 초기, 중기, 후기의 각 단계별로 중요한 분화 조절 전사인자들이 관여한다고 알려져 있으며, 이 중 C/EBPβ 와 δ는 지방전구세포가 분화유도물질 등의 분화 인자에 노출되었을 때 분화 초기에 가장 먼저 작용하는 전사 인자로 C/EBPβ는 Dexamethasone (DEX)에, C/EBPδ는 3-isobutyl1-methylxanthine (IBMX)에 의해 활성이 유도되는 것으로 알려져 있다8,9). 그와 반면에 C/EBPα와 PPARγ는 분화 후기에 발현되어 지방세포에 특이적인 유전자의 발현을 활성화시킴으로써 분화를 더욱 촉진시켜 분화 과정을 완성 시키며 지방세포로의 분화를 위해 인슐린 감수성에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다10,11). 따라서 지방 세포 분화에 관여하는 주요 전사인자들의 발현 조절 유무는 지방 축적 억제능 및 그 작용 기전을 판단하는 주요지표 중 하나라고 볼 수 있다.
	고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 무엇인가?	따라서 지방 세포 분화에 관여하는 주요 전사인자들의 발현 조절 유무는 지방 축적 억제능 및 그 작용 기전을 판단하는 주요지표 중 하나라고 볼 수 있다. 국화과(Asteraceae)에 속하는 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai)는 다년생의 초본으로 항산화 성분인 페놀성 화합물을 비롯하여 지표성분으로서 pectolinarin과 비배당체 형태인 pectolinarigenin이 함유 되어있다고 알려져 있다12). Yoo 등13)은 D-galactosamine으로 유도된 간 손상 모델에서 고려엉겅퀴 추출물 혹은 pectolinarin의 투여에 따라 농도 유의적으로 간 손상 지표인 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 농도가 유의적으로 감소함을 보고한 바 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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