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문제 정의
- 본 실험에서 사용된 벌개미취 열수 및 에탄올 추출물에서 이들 생리활성물질의 함유량을 분석하기 위한 실험을 수행하였다. Luna C-18 (2) (4.
- 본 연구에서는 지금까지 알려진 벌개미취 추출물의 생리활성 외에 벌개미취 잎 추출물의 당뇨 및 그 합병증 치료에 직접적인 도움이 될 수 있는 효능을 평가하기 위하여 벌개미취잎의 열수 추출물과 에탄올 추출물의 유효성분 함량을 분석하고 α-glucosidase 저해 효능 및 항산화 활성을 측정하였다.
제안 방법
- Luna C-18 (2) (4.6 ㎜ × 250, 5.0 ㎛) 컬럼을 사용하였고, 컬럼 온도 35℃, UV 검출기 파장 325 ㎚ 및 0.1% 개미산-물과 아세토니트릴 혼합 용매의 기울기 조건에서 지표성분들의 분리도가 우수하였다.
- Luna C-18 (2) analytical column (4.6 × 250 ㎜, 5.0 ㎛, Phenomenex, Torrance, CA, USA)이 HPLC 분석에 사용되었으며 컬럼 온도는 35℃로 설정하였고 UV 검출기파장은 325 ㎚로 설정하였으며, 시료주입은 시료자동주입기를 이용하여 5 ㎕를 주입하였다.
- 각각의 검량선용 표준용액을 컬럼에 주입하고 HPLC 분석을 실시하여 크로마토그램을 얻었고, 이 peak data를 도식화하여 정량분석을 위한 각각의 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선의 상관계수 (r2)를 구하여 직선성을 판단하였다.
- 각각의 벌개미취 추출물 100 ㎎을 10 ㎖ volumetric flask에 넣고 50% 메탄올을 사용하여 표선까지 맞춘 후 5 분간 초음파 추출하였다. 제조한 검액 중 1 ㎖ 을 취하여 0.
- 개발된 HPLC 분석법으로 4 종의 벌개미취 추출물 속 2종의 화합물에 대한 피크면적을 구하고, 각 표준품의 검량선에 피크면적을 대입하여 2 개의 주요 성분에 대한 함량을 구하였다 (Table 3). 4 종의 벌개미취 추출물에서 chlorogenic acid와 3,5-di-O-caffeoylquinic acid가 각각 2.
- 그 다음 4 mM의 4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside(pNPG)를 50 ㎕ 가한 후 25 분 후 Synergy HT (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 α-glucosidase 억제 활성을 나타내었다.
- 61로 높아졌다. 또한 효소와 물질간에 친화력을 나타내는 경쟁적 저해 해리상수 (competitive inhibition constant)인 Kic와 무경쟁적 저해 해리상수 (uncompetitive inhibition constant)인 Kiu값을 계산하였다.
- 반응속도는 α-glucosidase에 의한 pNPG의 생성물인 pnitrophenol의 몰 흡광도를 이용하여 각 시간당 흡광도를 pnitrophenol의 농도로 환산하여 계산하였다.
- 반응이 끝난 후 spectrophotometer (SpectraMax M2, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. TAC는 trolox (abcam)의 표준곡선을 작성한 후 시료의 흡광도를 대입하여 환산하였다.
- 벌개미취 열수 추출물과 30, 50, 80% 에탄올 추출물에 대한 혈당강하 활성을 평가하기 위하여 α-glucosidase 억제 효능을 측정하였다 (Fig. 2).
- 벌개미취 추출물의 α-glucosidase 억제 방식을 결정하기 위하여 DMSO에 녹인 추출물을 0.1 M PIPES 버퍼에 희석하여 다양한 농도 (열수: 4, 10, 20 ㎎/㎖; 80% 에탄올: 0.4, 2,4 ㎎/㎖)로 준비하였다.
- 벌개미취 추출물의 α-glucosidase 억제 활성을 측정하기 위하여 DMSO에 녹인 AKEs를 0.1 M PIPES 버퍼에 희석하여 다양한 농도 (0.4 - 40 ㎎/㎖)로 준비하였다.
- 상온에서 건조한 벌개미취 잎에 정제수 및 에탄올 (30, 50, 80% 에탄올)을 각각 넣고 추출하였다. 각 추출물은 여과 및 농축을 거친 후 건조하여 최종적으로 4 종류의 추출물 (hot water, 30, 50, 80% 에탄올 추출물, 고형분 수율: 21%, 25%, 26%, 32.
- 앞서 α-glucosidase 저해 활성을 보인 벌개미취 열수 추출물과 에탄올 추출물 중 가장 낮은 IC50값을 보인 80% 에탄올 추출물을 선정하여 α-glucosidase 저해 방식을 결정하였다.
- 각각의 벌개미취 추출물 100 ㎎을 10 ㎖ volumetric flask에 넣고 50% 메탄올을 사용하여 표선까지 맞춘 후 5 분간 초음파 추출하였다. 제조한 검액 중 1 ㎖ 을 취하여 0.45 ㎛ Whatman PVDF syringe filter로 여과한 후 HPLC 분석에 사용하였다.
- 준비한 시료를 여러 농도(0.125 -2 mM)의 기질 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNPG) 50 ㎕와 섞은 후 25 ㎕ α-glucosidase (200 mU/㎖)를 넣고 2분 간격으로 20 분 동안 405 ㎚에서 Synergy HT (BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 1M PIPES buffer는 DYNEBIO(Sungnam, Korea)에서 구입해서 사용하였다.
- 3,5-di-Ocaffeoylquinic acid (3,5-diCQA, ≥98%)는 ChemFaces(Wuhan, China)로부터 구입하였으며, HPLC 분석을 위한 이동상 용매 아세토니트릴과 물 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) 그리고 개미산 (Merck, Darmstadt, Germany)은 모두 HPLC급을 사용하였다.
- Acarbose, aminoguanidine hydrochloride, α-glucosidase from saccharomyces cerevisiae, chlorogenic acid (≥98%), 4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
- HPLC 분석에는 Agilent 1200 analytical HPLC system(Santa Clara, CA, USA)이 사용되었으며, ChemStation software (Agilent, Santa Clara, CA, USA)가 장비 운용 및 분석 결과 처리에 사용되었다.
- 국내산 벌개미취 (Aster koraiensis Nakai)는 2016년 가을에 채집된 벌개미취 종자 (대림원예종묘, 경기도 과천시)를 늘참 영농조합 (충청남도 논산시)에서 무농약으로 재배 후 수확한 것으로 사용하였다.
- 벌개미취 표준품 (chlorogenic acid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid) 2 종은 1 ㎎/㎖의 농도로 메탄올에 용해시킨 후 단계적으로 희석하여 각각 1.25 - 100 ㎍/㎖의 농도 범위에서 검량선용 표준용액을 제조하였다.
- 본 실험에 사용된 추출물은 ㈜한국신약 으로부터 제공받은 것으로, 추출 방법은 다음과 같다.
- 값은 GraphPad Prism 7 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA) 을 이용하여 계산하였다. 양성 대조군으로는 acarbose를 사용하였다.
- 이동상은 0.1% 개미산-물 (A)과 아세토니트릴 (B) 혼합 용액을 사용하여 처음 25 분 동안 90 : 10 (v/v)에서 86 : 14 (v/v)으로 기울기 용리 조건을 사용하였고 25 분에서 60 분까지는 86 : 14 (v/v)에서 75 : 25 (v/v)으로 기울기 용리 조건을 사용하였다. 유속은 1.
- 추출에 사용된 에탄올 (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea)은 특급 용매를 사용하였다.
데이터처리
- 수행한 실험조건에서 50%의 α-glucosidase 효소 저해 활성을 보이는 농도인 IC50값은 GraphPad Prism 7 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA) 을 이용하여 계산하였다.
- 실험결과는 평균 ± 표준편차 (Mean ± SD)로 나타내었으며, 유의성 검정을 위하여 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 사용하였다.
- 유의적 차이가 있는 경우 (p < 0.05) one-way ANOVA (Tukey’s multiple comparison test)를 실시하였다.
이론/모형
- Lineweaver-Burk 식 (Eq. 2) 을 이용하여 효소 억제 방식을 결정하였다.
- 벌개미취 추출물의 TAC는 TAC assay kit (Abcam, Cambridge, CA, USA)의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 우선 다양한 농도의 추출물을 protein mask와 1:1의 비율로 섞은 후 3 차 증류수에 1/10로 희석하여 96 well-plate에 시료 100 ㎕를 준비한 후, 준비한 시료에 100 ㎕ 의 Cu2+ working solution을 섞은 다음 상온에서 90 분간 교반 시켰다.
- 이를 위하여 우선 다양한 농도의 기질과 벌개미취 추출물을 이용하여 α-glucosidase 효소활성을 측정한 다음 MichaelisMenten 식과 Lineweaver- Burk 식을 이용하여 Vmax와 Km 값을 구하였다 (Fig. 3).
성능/효과
- 2 종의 표준품을 1.25 - 100 ㎍/㎖의 농도범위에서 검량선을작성한 결과, 검량선 상관 계수 (r2) 값이 모두 0.999이상으로 양호한 직선성을 나타내었으며, 검출한계와 정량한계는 0.23 -0.36 ㎍/㎖와 0.70 - 1.09 ㎍/㎖로 나타났다 (Fig. 5).
- 개발된 HPLC 분석법으로 4 종의 벌개미취 추출물 속 2종의 화합물에 대한 피크면적을 구하고, 각 표준품의 검량선에 피크면적을 대입하여 2 개의 주요 성분에 대한 함량을 구하였다 (Table 3). 4 종의 벌개미취 추출물에서 chlorogenic acid와 3,5-di-O-caffeoylquinic acid가 각각 2.76 - 7.68 및 2.04 - 10.45 ㎎/g의 함량 수치를 나타내었으며, 추출 시 에탄올의 함량이 높아질수록 두 성분의 함량이 증가하는 경향을 보였다.
- 80% 에탄올 추출물의 경우 가장 낮은 IC50 값을 보여 추출물 중 가장 우수한 α-glucosidase 저해능을 가진 것으로 판단되나 50% 에탄올 추출물과 비교 시 유의미한 차이는 나타나지 않았다.
- 80% 에탄올 추출물의 경우는 pNPG만 넣어주었을 때 Vmax는 1.56 μM/min, Km은 0.23 mM 로 나타났으나 추출물 0.1, 0.5, 1 ㎎/㎖을 같이 넣었을 때는 Vmax의 경우 1.59, 1.33, 1.2 μM/min으로 낮아지는 경향을 보였고, Km은 0.34, 0.43, 0.61로 높아졌다.
- 상온에서 건조한 벌개미취 잎에 정제수 및 에탄올 (30, 50, 80% 에탄올)을 각각 넣고 추출하였다. 각 추출물은 여과 및 농축을 거친 후 건조하여 최종적으로 4 종류의 추출물 (hot water, 30, 50, 80% 에탄올 추출물, 고형분 수율: 21%, 25%, 26%, 32.5%)을 얻었다.
- 검액에서 분석대상 피크의 retention time과 UV 흡수 파장을 표준품과 비교하여 확인하였으며, HPLC 크로마토그램 상에서 두 성분은 각각 10.8 및 45.3 분에 검출되었다 (Fig. 4).
- 기존에 벌개미취의 유효성분으로 제시된 chlorogenic acid와 3,5-di-O-caffeoylquinic acid의 함량은 추출용매의 에탄올 비율이 높아짐에 따라 증가하나 30% 에탄올 추출물의 경우 50, 80% 에탄올 추출물에 비해 두 유효성분의 함량이 현저히 적은데도 불구하고 항산화능을 측정한 결과에서 비슷한 EC50 값을 보인 것을 보아 분석이 이루어지지 않은 생리활성 성분들이 이에 영향을 미쳤을 가능성을 생각해볼 수 있다.
- 벌개미취 추출물을 처리하지 않은 그룹에 비하여 열수 추출물과 에탄올 추출물 모두 유의적으로 α-glucosidase 활성을 저해하는 것을 확인 하였다.
- 벌개미취 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 벌개미취 열수 추출물을 0.1 - 5 ㎎/㎖ 처리 하였을 때, trolox 농도환산 5.86 ± 0.12 - 104.87 ± 0.16 mM에 해당하는 항산화능을 보였고 30% 에탄올 추출물은 같은 농도에서 trolox 농도 환산 10.67 ± 0.19 - 104.35 ± 0.48 mM, 50% 에탄올 추출물은 trolox 농도 환산 10.96 ± 0.08 - 105.95 ± 0.39 mM, 80% 에탄올 추출물은 trolox 농도 환산 13.69 ± 0.09 - 105.5 ± 0.96 mM의 항산화 활성을 보여 벌개미취 추출물의 강한 산화스트레스 저해 활성을 알 수 있었다.
- 벌개미취의 추출물의 항산화능 측정 결과와 마찬가지로 추출 시 용매의 에탄올 함량이 높을수록 α-glucosidase 저해능이 커지는 경향이 나타났다.
- 본 연구를 통하여 얻은 결과로부터 벌개미취 잎의 열수 및 에탄올 추출물이 우수한 항산화능을 갖으며 혼합형 저해 방식으로 α-glucosidase의 활성을 저해하는 것을 확인하였다.
- 열수 추출물은 Kic 0.9, Kiu 6.2, 80% 에탄올 추출물은 Kic 0.5, Kiu 2.7로 두 가지 추출물 모두 Kic≠Kiu의 결과를 보여 혼합형 저해제임을 알 수 있었다.
- 추출 시 용매의 에탄올 함량이 증가할수록 EC50 값이 낮아지는 경향을 보였으며 그중 80% 에탄올 추출물이 제일 낮은 EC50값으로 가장 우수한 항산화능을 나타내었으나 다른 에탄올 추출물과 비교할 때 유의미한 차이는 나타나지 않았다. 이 결과로부터 에탄올에 의해 phenolic 물질이나 flavonoids와 같은 항산화능을 갖는 유효물질의 용출이 증가하나 에탄올의 비율에 비례하지는 않는 것을 알 수 있다.
- 이 측정값은 α-glucosidase의 저해제로 잘 알려져 있는 양성 대조군인 acarbose와 유사한 수준으로 추출물인 것을 감안할때 매우 우수한 α-glucosidase 저해능을 지닌 것으로 사료된다.
- 이러한 결과로부터 본 연구에서 사용한 벌개미취 잎의 열수 추출물과 30, 50, 80% 에탄올 추출물 역시 항산화능을 지닐 것으로 예상하여 그 효능을 확인하였다 (Fig. 1).
- 로 Table 1에 나타내었다. 추출 시 용매의 에탄올 함량이 증가할수록 EC50 값이 낮아지는 경향을 보였으며 그중 80% 에탄올 추출물이 제일 낮은 EC50값으로 가장 우수한 항산화능을 나타내었으나 다른 에탄올 추출물과 비교할 때 유의미한 차이는 나타나지 않았다. 이 결과로부터 에탄올에 의해 phenolic 물질이나 flavonoids와 같은 항산화능을 갖는 유효물질의 용출이 증가하나 에탄올의 비율에 비례하지는 않는 것을 알 수 있다.
후속연구
- α-glucosidase 저해능은 두 가지 유효성분의 함량에 비례하는 경향을 나타내어 직접적인 영향을 미치는 것으로 판단된다. 이러한 결과로 부터 앞서 제시된 유효성분을 포함한 생리활성 물질의 적절한 분리 및 동정이 이루어져야 할 필요가 있을 것으로 사료된다.
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