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문제 정의
- 하지만, 삽주 육성품종에 대한 논문이 적을 뿐만 아니라 삽주 육성품종에 대한 생리활성에 관한 연구는 아직 보고 된 바가 없다. 따라서, 본 연구에서는 삽주 육성품종들에 대한 항염 및 항산화 활성을 비교함으로써 기능성 작물로서 이용가치가 높은 품종을 선발하고자 하였다.
- 삽주 품종의 peroxynitrite에 대한 소거능 분석을 위해.
제안 방법
- Rhodamine buffer와 diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), dihydrorhodamine 123 (DHR123), 3-morpholinosydnonimine (SIN-1)을 이용하여 reaction buffer를 제조하고, 삽주 추출물과 혼합하여 96-well black plate에 분주한 후 5 분간 반응시키고 분광광도계를 이용하여 microplate reader에서 형광 (excitation: 485 nm, emission: 530 nm)을 측정하였으며 결과는 IC50 (μg/mℓ) 값으로 산출하였다.
- 20 - 250 μg/mℓ 농도의 삽주 품종별 추출물을 2 시간 처리한 후 배지를 제거하고, 순차적 으로 lipopolysaccharide (LPS)를 0.5 μg/mℓ 농도로 24 시간동 안처리하였다.
- 24시간 후 각 well의반응액을50μℓ씩96well transparent plate에 옮겨 담고, 1% sulfanilamide 50 μℓ 와 0.1% N-1-napthyl-ethylenediamine dihydrochloride (NED)50μℓ를 각각 가하여 혼합한 후 520nm 조건에서 흡광도를 측정하였으며 NO 표준물질 (nitrite)의 흡광도로부터 작성된 검량선식에 대해 삽주 추출물 처리군의 흡광도를 적용하여 생성 된 NO의 농도를 계산하였다.
- Atractylenolide I은 UV (260 nm) detector와 Acquity UPLC BET C8 (1.7 μm, 2.1 × 100 μM) 컬럼이 장착된 UPLC (Waters Acquity, Milford, MA, USA)에서 water (A) 와 acetonitrile (B)을 mobile phase로 하여 분석초기에는 A:B 비율을 60:40으로 시작하여 14 분까지, 10:90으로 변 경하고 다시 15 분까지 10 : 90으로 유지시키는 gradient system을 적용하여 분석하였다.
- Atractylenolide III은 UV (214 nm) detector와 Acquity UPLC BET C8 (1.7 μm, 2.1 × 100 μM) 컬럼이 장착된 UPLC (Waters Acquity, Milford, MA, USA)에서 water (A)와 acetonitrile (B)을 mobile phase로 하여 분석초기에는 A : B비율을 60:40으로 시작하여 3분동안 유지한 후 10분 간 0:100으로 변경시키고, 다시 12분 동안 0:100으로 유지되는 gradient system을 적용하였다.
- 삽주 품종 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 분석하기 위해 삽주 샘플과 Na2CO3 용액을 혼합한 다음, 1N Folin-Ciocalteu 용액을 가하여 30 분간 반응시켰다.
- 삽주 품종 추출물의 자유라디칼에 대한 소거능을 확인하기 위해 Lee 등 (2010)의 방법에 따라 에탄올에 1.5 × 10−4 M의 DPPH를 녹인 후 최종농도 20, 40, 100, 250, 500 μg/mℓ이 되도록 DMSO에 녹여 조제한 삽주 추출물을 가해 혼합하였으 며, 3 분 후 분광광도계 (Cary-300, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 517 nm 파장에서 흡광도 를 측정하였다.
- 삽주 품종 추출물의 활성산소 저해능을 분석하기 위해 BV-2 세포주를 5 × 104 cell/well 밀도로 분주, 0.5 μg/mℓ LPS 처리 및 삽주 품종별 추출물의 처리를 진행한 후 10μM DCFDA를 배지에 혼합하여 30 분간 처리하였다.
- 삽주의 주요 활성성분인 atractylenolide I과 atractylenolide III가 각 품종별로 존재하는 함량을 확인하기 위해 정량분석을 실시하였다.
- 삽주의 활성산소에 대한 항산화효과를 확인하기 위해 BV2 세포에서 LPS를 이용하여 ROS 생성정도를 측정하고 LPS가 처리되지 않은 control에 대한 백분율로 나타내었다.
- 여과된 추출액은 감압농축기 (N-1200B, Eyela, Japan)를 이용하여 50°C의 온도조건에서 에탄올을 증발시켜 농축한 다음, 30°C 온도 조건의 동결건조기를 이용해 4일간 건조한 후 최종추출물의 양을 측정하였다 (Table 1).
- 이 반응혼합물을 분광광도계를 이용하여 750 nm 파장의 흡 광도를 측정하였으며 측정한 시료의 흡광도를 표준물질 tannic acid의 흡광도에 의해 얻어진 방정식에 대입하여 총페놀 함량을 계산하였다.
대상 데이터
- 본 연구를 위해 사용된 시약으로 Dulbecco’s minimum essential media (DMEM), fetal bovine serum (FBS)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입 하였고, sodium carbonate는 Kanto Chemical (Tokyo, Japan)에서, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2',7'–dichlorofluorescin diacetate (DCFDA), lipopolysaccharide (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), penicillin & streptomycin (PEST), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), tannic acid, 3-morpholinosydnonimine (SIN-1), dihydrorhodamine 123 (DHR123), sulfanilamide와 N-1-napthyl-ethylenediamine dihydrochloride (NED), Folin-Ciocalteu reagent, atractylenolide I, atractylenolide III은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, phosphate buffer saline (PBS)는 WelGene (Gyeongsan, Korea)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 삽주 (Atractylodes japonica × A. macrocephala, AJM) 7개품종의뿌리는 2016년 10월 21일충북 음성군 국립원예특작과학원 인삼특작부 약용작물시험포장에서 증식된 것을 채취한 것으로서 세척 후 50°C건조기에서 4일간 건조 하여 추출물 조제에 사용하였다.
데이터처리
- *Values are mean ± standard deviation (n = 3) and those with different alphabet within the same component are significantly different at p < 0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).
- *Values are mean±standard deviation (n=3) and those with different alphabet within the same marker are significantly different at p < 0.05 by Duncan’s Multiple Range Test (DMRT).
- Statistical analysis was performed using Student’s t-test (*p < 0.05; **p < 0.01; and ***p < 0.001).
- 실험으로 얻은 결과 (n = 3)의 통계적 유의성은 Student's t-test로 확인하거나, SAS program (version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에서 ANOVA 분석을 실시하여 유의성이 있을 경우 p < 0.05 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)를 실시하였다.
성능/효과
- 측정 결과, 모든 삽주 품종 추출물은 72.8 - 102.5 μg/mℓ 범위의 IC50 농도값을 가졌으며, 상출이 가장 낮은 72.8 μg/mℓ 의 IC50 값을 가져 가장 우수한 ONOO- 소거능을 보였고, 고출이 102.5 μg/mℓ 로 가장 높은 IC 값을 가져 ONOO− 소거능이 50 가장 낮았다.
- 측정 결과,상출에서14.01mg이 측정되어7가지 품종 중 가장 높은 함량을 가진 것으로 나왔으며, 고출이 5.59mg으로 7가지 품종 중 총 페놀 함량이 가장 낮았다.
- 50% 에탄올로 추출하여 얻어진 삽주 (Atractylodes japonica × A. macrocephala, AJM)의 품종별 추출물의 수율을 측정한 결과, 각각의 품종에 따라 13.1%부터 29.7%까지의 수율이 확인되었다 (Table 1).
- 7 종류의 품종 중 상출이 13.1% 로 가장 수율이 낮았고, 다출이 29.7%로 수율이 가장 높게 측정되었으며, 나머지 다섯 종류의 품종들은 15 - 25% 사이의 수율을 보였다.
- BV2 세포에 대해 LPS 처리로 NO 생성을 유발한 결과, LPS단독처리된BV2에서큰폭으로NO가증가한 것을 확인할 수 있었지만, 삽주 품종 추출물을 처리한 실험에서는 모두 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하는 것이 확인되었다 (Fig. 3).
- LPS에 반응한 BV2는 ROS 및 NO 염증매개물질의 분비를 증가시키는데, 삽주 추출물 시료와 LPS를 동시에 처리하였을 때 NO 생성 저해효과를 보였고 특히, 상출, 고출, 다원이 좀 더 우수한 NO생성저해 효과를 보였다.
- MTT assay를 이용하여 BV2 세포 증식에 미치는 삽주 품종 추출물의 영향을 실험한 결과, LPS 단독처리 실험에서 세포증식이 유의미하게 저해되었으나, 삽주 추출물과 LPS가 함께 처리된 실험들은 처리된 모든 농도 (20 - 250 μg/mℓ)에서 LPS 단독 처리군보다 89.2% 이상의 세포증식율을 나타내었다 (Fig. 1.).
- 본 연구에서 삽주 품종별 추출물의 DPPH 소거능을 측정하였을 때, 상출의 DPPH 소거능이 가장 높게 측정되었으며 이 밖에도 다원과 후출은 250 μg/mℓ 까지 농도 의존적으로 증가 하는 경향을 보였다 (Fig. 4.).
- , 2018). 이들 삽주 육성 품종에 관한 연구보고에 의하면 큰꽃삽주와 육성된 품종 간에 외형적인 차이는 컸으나, 육성품종 간에는 차이가 작았으며, 삽주 육성 품종 중에서 상원이 근경이 가장 길었고, 생근 수량에서도 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 지표성분인 atractylenolide I, atractylenolide II 및 atractylenolide III에 대한 정량분석에서 상원을 제외한 대부분의 삽주 육성 품종이 큰꽃삽주보다 높은 함량을 나타내었으며 특히, 다출이 월등히 높았던 것으로 보고되었다 (Jeong et al.
- 특히, 가장 높은 농도인 250 μg/mℓ에서의 ROS 생성 저해는 상출과 다원이 각각 LPS 무처리된 control 대비 89% 및 90.1%로 가장 항산화 효과가 큰 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 이들 삽주 품종을 활용하여 개발된 삽주 육성 품종의 활성산소 관련 활성에 미치는 요인들의 구명을 위해 차후 보다 다각적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 이상의 항염 활성, 항산화 활성 및 주요성분 분석에 관한 실험결과를 종합할 때, 7 개의 삽주 육성품종 가운데 항염, 항산화 효과에 있어 가장 효율적인 추출물을 얻을 수 있는 품종은 상출인 것으로 확인되었으며, 후속 연구를 통해 삽주 육성 품종을 활용한 항염, 항산화 기전 등의 추가연구가 필요하다고 사료되었다.
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