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문제 정의
- 서론에서 언급했다시피 PGPR은 불용성 인산 가용능을 포함한 다양한 식물성장 촉진 활성을 보유하고 있는 것이 농업용 미생물 제제로서 야외에 적용 시 유리하다. 따라서 siderophore를 생성할 수 있는 본 공시균주의 식물성장 촉진 활성을 조사하였다. 공시균주는 불용성 인산을 가용화(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 농작물의 근권 토양에서 siderophore 생산 균주를 분리 및 동정한 후, 분리된 공시균주의 siderophore 생산에 미치는 배지조성의 영향을 조사하였다. 또한 공시균주에 의한 다양한 식물성장 촉진 활성을 조사하여, 환경친화적인 생물학적 제어법 확립에 필요한 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 농작물의 근권 토양에서 siderophore 생산 균주를 분리 및 동정한 후, 분리된 공시균주의 siderophore 생산에 미치는 배지조성의 영향을 조사하였다. 또한 공시균주에 의한 다양한 식물성장 촉진 활성을 조사하여, 환경친화적인 생물학적 제어법 확립에 필요한 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 본 연구에서는 친환경 미생물제제 개발을 목적으로 식물병원성 미생물이 필요로 하는 철의 흡수능을 감소시킬 수 있는 siderophore 생산 미생물을 분리 및 동정한 후, 그 생산 특성과 식물성장 촉진 활성을 조사하였다. 들깨의 근권 토양으로부터 CAS 평판배지에서 집락 주변에 주황색 환을 형성하는 S21 균주를 분리하였으며, 공시균주의 표현형적 특성과 16S rRNA 유전자의 염기서열에 기초하여 동정한 결과, E.
제안 방법
- 056% (pH 7)이었다(Sasirekha and Srividya, 2016). 공시균주의 siderophore 생산에 영향을 미치는 요인을 알아보기 위하여 각종 탄소원, 질소원, 무기염 및 유기산에 따른 siderophore 생산량을 측정하였다. 특별히 언급하지 않는 한, nutrient broth에서 배양한 전배양액 2% (v/v)를 기본배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 24시간동안 배양하였다.
- 특별히 언급하지 않는 한, nutrient broth에서 배양한 전배양액 2% (v/v)를 기본배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 24시간동안 배양하였다. 균체 생육도는 660 nm에서 흡광도를 측정하여 조사하였다.
- , 1994)를 참조하여 예비 동정하였다. 또한 공시균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 후, GenBank database를 이용하여 비슷한 균주들과의 상동성을 비교하고, MEGA software를 이용하여 계통학적 위치를 조사하였다. 이때, 16S rRNA 유전자를 증폭하는데 사용된 primer는 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)와 1492R (TACGGYTACCTTGTTAC GACTT)이었다.
대상 데이터
- 항진균능은 potato dextrose agar 평판배지를 이용한 대치배양법으로 확인하였다. 각종 식물병원성 곰팡이인 Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Phythium ultimum, Phytophthora cactorum를 피검균주로 사용하였다.
- 농작물 근권 토양 시료로부터 녹청색의 CAS 평판배지에서 집락 주변에 주황색 환을 형성하는 27 균주를 분리하였다. 그 중 주황색 환의 직경이 가장 큰 S21 균주를 공시균주로 선정하였다(Fig. 1A). 공시균주는 운동성이 있는 간균(1.
- 농작물 근권 토양 시료로부터 녹청색의 CAS 평판배지에서 집락 주변에 주황색 환을 형성하는 27 균주를 분리하였다. 그 중 주황색 환의 직경이 가장 큰 S21 균주를 공시균주로 선정하였다(Fig.
- 결과적으로 siderophore를 생산하는 미생물 집락의 주변부는 노랑색~주황색으로 변하게 된다. 다양한 농작물 근권 토양을 채집하여 토양 현탁액을 조제 및 계단희석한 후, CAS 평판배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 집락 주위에 생성된 주황색 환의 직경이 큰 균주를 siderophore 생산 미생물로 선정하였다.
이론/모형
- 공시균주의 불용성 인산 가용능은 Nautiyal(1999)의 방법, 암모니아 생성능은 Dey et al.(2004)의 방법, 곰팡이 세포성분 분해효소(chitinase, cellulase, protease, lipase)의 활성은 표준방법(Gerhardt et al., 1981)에 의하여 정성적으로 평가하였다. 또한 식물성장 호르몬인 indoleacetic acid (IAA)와 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC) deaminase의 생성능은 Tang and Bonner(1947)의 방법 및 Penrose and Glick(2003)의 방법에 의하여 정량적으로 분석하였다.
- Siderophore 생산 미생물은 Fe3+에 대한 siderophore의 높은 친화성에 기초하여 개발된 chrome azurol S (CAS) 평판배지 분석법에 의하여 분리하였다(Schwyn and Neilands, 1987). CAS는 Fe3+과 결합하여 복합체를 형성함으로써 녹청색을 나타낸다.
- 공시균주의 형태와 배양적 특성은 Manual for the identification of medical bacteria (Barrow and Felthanm, 1993)에 준하여 조사한 후, Bergey's manual of determinative bacteriology (Holt et al., 1994)를 참조하여 예비 동정하였다.
- , 1981)에 의하여 정성적으로 평가하였다. 또한 식물성장 호르몬인 indoleacetic acid (IAA)와 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC) deaminase의 생성능은 Tang and Bonner(1947)의 방법 및 Penrose and Glick(2003)의 방법에 의하여 정량적으로 분석하였다. 항진균능은 potato dextrose agar 평판배지를 이용한 대치배양법으로 확인하였다.
- 배양액 내 siderophore의 정량분석은 Alexander and Zuberer(1991)의 방법에 준하여 조사하였다. 배양액으로부터 일정량의 시료를 회수하여 10,000 g에서 10분간 원심분리하였다.
- 또한 식물성장 호르몬인 indoleacetic acid (IAA)와 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC) deaminase의 생성능은 Tang and Bonner(1947)의 방법 및 Penrose and Glick(2003)의 방법에 의하여 정량적으로 분석하였다. 항진균능은 potato dextrose agar 평판배지를 이용한 대치배양법으로 확인하였다. 각종 식물병원성 곰팡이인 Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Phythium ultimum, Phytophthora cactorum를 피검균주로 사용하였다.
성능/효과
- Bergey's manual of determinative bacteriology를 참조하여 공시균주를 동정한 결과, Enterobacter속에 포함될 가능성이 가장 높았다.
- 그중 기본배지의 탄소원인 glucose보다 높은 생산량을 나타낸 것은 fructose이었다. Fructose의 농도에 따른 siderophore의 생산량을 조사한 결과, 0-0.5% 범위에서 농도 증가에 비례하여 생산량도 증가하였으며, 그 이상의 농도에서는 일정하였다(Fig. 3). Brevibacillus brevis GZDF3 (Sheng et al.
- amnigenus로 확인되었다. Siderophore 생산을 위해 확립된 배지 조성은 fructose 0.5%, urea 0.1%, K2HPO4 0.5%, succinic acid 0.1%이었으며, 이 조건에서 siderophore 생산량은 기본배지 대비 약 2.5배 증가되었다. 또한 공시균주는 불용성인산 가용능과 세포성분 분해효소 (protease, lipase), 암모니아, IAA 및 ACC deaminase와 같은 식물성장 촉진 활성을 나타내었으며, C.
- 각종 질소원을 0.085%씩 기본배지에 첨가하여 공시 균주에 의한 siderophore 생산량을 측정한 결과, 탄소원과 마찬가지로 질소원 역시 siderophore 생산에 필수적인 인자였으며, 기본배지의 질소원인 urea에서 가장 높은 생산량을 나타내었다(Table 1). 또한 siderophore 생산량은 urea 0.
- 그러나 siderophore가 존재할 경우, 복합체의 Fe3+은 siderophore와 결합하게 되고, 노랑색~주황색의 CAS는 유리된다. 결과적으로 siderophore를 생산하는 미생물 집락의 주변부는 노랑색~주황색으로 변하게 된다. 다양한 농작물 근권 토양을 채집하여 토양 현탁액을 조제 및 계단희석한 후, CAS 평판배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 집락 주위에 생성된 주황색 환의 직경이 큰 균주를 siderophore 생산 미생물로 선정하였다.
- 5%)로 배지에 추가적으로 첨가하여 배양한 결과, 저농도의 acetic acid와 succinic acid가 각각 첨가된 실험구에서 siderophore 생산량이 약간 증가되었으며, citric acid, malic acid 및 oxalic acid는 조사한 모든 농도에서 siderophore 생산을 완전히 저해하였다(Table 2). 결과적으로 유기산의 첨가는 siderophore 생산에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 한편, Sayyed et al.
- 따라서 siderophore를 생성할 수 있는 본 공시균주의 식물성장 촉진 활성을 조사하였다. 공시균주는 불용성 인산을 가용화(Fig. 7A)할 수 있었으며, 식물병원성 곰팡이의 세포성분 분해효소로 protease (Fig. 7B)와 lipase (Fig. 7C)를 생성할 수 있었다. 또한 항진균 휘발성 물질인 암모니아를 생성할 수 있었고(Fig.
- 7E-H). 그러나 본 균주는 cellulase, chitinase를 생성할 수 없었으며, 잿빛곰팡이 병균인 B. cinerea, 모잘록병균인 R. solani의 생육은 저해하지 못했다. 한편, 공시균주는 액체배양에서 8.
- 6에서 보는 바와 같다. 기본배지 및 개선배지에서 각각 36시간 및 24시간까지 대수증식을 하다가 정지기에 돌입하였으며, siderophore 생산량은 균체 생육에 비례하여 증가하다가 36시간에 각각 21% 및 52%를 나타내었다. 따라서 본 실험을 통하여 확립된 개선배지에서는 기본배지 대비 siderophore 생산량이 약 2.
- 기본배지 성분인 K2HPO4의 농도가 siderophore 생산량에 미치는 영향을 조사한 결과, 0.5%까지 농도 증가에 비례하여 생산량이 증가하다가 그 이상의 농도에서는 감소하여 전형적인 inhibition type을 나타내었다 (Fig. 5).
- 본 연구에서는 친환경 미생물제제 개발을 목적으로 식물병원성 미생물이 필요로 하는 철의 흡수능을 감소시킬 수 있는 siderophore 생산 미생물을 분리 및 동정한 후, 그 생산 특성과 식물성장 촉진 활성을 조사하였다. 들깨의 근권 토양으로부터 CAS 평판배지에서 집락 주변에 주황색 환을 형성하는 S21 균주를 분리하였으며, 공시균주의 표현형적 특성과 16S rRNA 유전자의 염기서열에 기초하여 동정한 결과, E. amnigenus로 확인되었다. Siderophore 생산을 위해 확립된 배지 조성은 fructose 0.
- , 2017), Pseudomonas aeruginosa FP6 (Sasirekha and Srividya, 2016)의 경우, siderophore 생산에 최적인 탄소원은 각각 sucrose, glucose, mannitol이며, fructose에서는 생산량이 매우 적었다고 하였다. 따라서 siderophore 생산에 최적인 탄소원은 균주 특이적임을 알 수 있었다.
- 유기산은 siderophore의 생산량에 영향을 미친다는 보고가 있다(Sayyed and Chincholkar, 2010). 따라서 각종 유기산을 저농도(0.1%) 및 고농도(0.5%)로 배지에 추가적으로 첨가하여 배양한 결과, 저농도의 acetic acid와 succinic acid가 각각 첨가된 실험구에서 siderophore 생산량이 약간 증가되었으며, citric acid, malic acid 및 oxalic acid는 조사한 모든 농도에서 siderophore 생산을 완전히 저해하였다(Table 2). 결과적으로 유기산의 첨가는 siderophore 생산에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.
- Bergey's manual of determinative bacteriology를 참조하여 공시균주를 동정한 결과, Enterobacter속에 포함될 가능성이 가장 높았다. 따라서 공시균주를 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 후, GenBank database에 등록된 표준균주와 비교한 결과, Enterobacter amnigenus와 99%의 상동성을 나타내었다. 이미 알려진 Enterobacter 속 균주들과의 계통학적 연관성을 알아보기 위하여 계통수를 작성한 결과, 공시균주는 계통학적으로 E.
- 기본배지 및 개선배지에서 각각 36시간 및 24시간까지 대수증식을 하다가 정지기에 돌입하였으며, siderophore 생산량은 균체 생육에 비례하여 증가하다가 36시간에 각각 21% 및 52%를 나타내었다. 따라서 본 실험을 통하여 확립된 개선배지에서는 기본배지 대비 siderophore 생산량이 약 2.5배 정도 증가되었음을 알 수 있었다. 미생물에 의한 siderophore의 생산은 균체 생육과 비례하는 경우(Yu et al.
- 2). 따라서 이들 결과에 기초하여 공시균주를 E. amnigenus S21로 명명하였다.
- 5배 증가되었다. 또한 공시균주는 불용성인산 가용능과 세포성분 분해효소 (protease, lipase), 암모니아, IAA 및 ACC deaminase와 같은 식물성장 촉진 활성을 나타내었으며, C. gloeosporioides 등 몇몇 식물병원성 곰팡이의 생육도 억제하였다. 이러한 결과는 E.
- 7C)를 생성할 수 있었다. 또한 항진균 휘발성 물질인 암모니아를 생성할 수 있었고(Fig. 7D), 탄저병균인 C. gloeosporioides, 시들음병균인 F. oxysporum, 뿌리썩음병균인 P. ultimum, 역병균인 P. cactorum에 대한 길항능을 가지고 있었다(Fig. 7E-H). 그러나 본 균주는 cellulase, chitinase를 생성할 수 없었으며, 잿빛곰팡이 병균인 B.
- 따라서 공시균주를 정확하게 동정하기 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 후, GenBank database에 등록된 표준균주와 비교한 결과, Enterobacter amnigenus와 99%의 상동성을 나타내었다. 이미 알려진 Enterobacter 속 균주들과의 계통학적 연관성을 알아보기 위하여 계통수를 작성한 결과, 공시균주는 계통학적으로 E. amnigenus와 동일한 그룹에 포함되었다(Fig. 2). 따라서 이들 결과에 기초하여 공시균주를 E.
- 먼저 각종 탄소원을 1%씩 기본배지에 첨가하여 공시 균주에 의한 siderophore 생산량을 측정한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다. 탄소원은 siderophore의 생산에 필수적인 인자임을 알 수 있었으며, lactose와 sorbitol을 제외한 모든 탄소원에서 siderophore가 생산되었다. 그중 기본배지의 탄소원인 glucose보다 높은 생산량을 나타낸 것은 fructose이었다.
- 한편, 공시균주는 액체배양에서 8.3 μ g/mL의 식물성장 호르몬인 IAA를 생성하였으며, ACC의 효소 분해산물로서 77 μg/mL의 α-ketobutyrate를 생성함에 따라 식물 스트레스 물질인 ethylene을 감소시키는 ACC deaminase 활성을 보유하고 있는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 미생물 또는 미생물 대사산물의 상업적 생산을 위하여 생산수율을 높이는 것이 필수적이지만 해결해야 할 문제는 많다. 가장 먼저 연구되어야 할 내용은 대사산물 생산을 위한 배지 조성의 최적화이다. 비록 철이 siderophore 합성을 조절하는 중요한 요인이기는 하지만 탄소원, 질소원, 유기산도 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다(Saha et al.
- 동시에 본 공시균주가 urea를 질소원으로 이용할 수 있는 능력은 토양에 존재하는 과잉의 urea 비료를 감소시킴으로써 알칼리성 토양의 생물정화를 위한 가능성까지 시사한다 (Sayyed and Chincholkar, 2010). 본 실험의 결과는 토양환경의 조건에 따라 공시균주를 적절하게 사용할 경우, 잠재적으로 농작물의 질병 예방과 함께 생산성 향상까지 유도할 수 있음을 나타내며, 이에 관한 후속연구가 필요함을 알 수 있었다.
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