[논문]출아효모에서 재조합 neoagarobiose hydrolyase의 생산을 위한 최적 발현시스템

정혜원; 김연희

doi:10.4014/mbl.1906.06008

초록
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본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae를 이용해서 neoagarobiose hydrolase (NABH)를 효율적으로 생산하기 위한 NABH558 유전자 발현시스템을 구축하였다. ADH1 promoter와 GAL10 promoter 하류에 NABH558 유전자를 가진 pAMFα-NABH plasmid와 pGMFα-NABH plasmid는 S. cerevisiae 2805 균주에 형질전환되었다. 2805/pAMFα-NABH 균주는 YPD (2% dextrose) 배지에서 가장 높은 NABH 효소 활성(0.069 unit/ml/DCW)을 보였고, 2805/pGMFα-NABH 균주의 경우는 배지의 조성과 상관없이 비슷한 수준의 NABH 활성(0.02-0.027 unit/ml/DCW)을 보였다. RT-PCR을 통한 NABH558 유전자의 transcription level은 NABH 활성 증가에 따라 비슷한 수준으로 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한 재조합균주에서 생산된 NABH는 agarose를 galactose와 AHG로 분해하였다. 따라서 NABH558 유전자의 발현에는 ADH1 promoter를 사용하는 것이 더 효율적이며 GAL10 promoter와 비교해서 최대 3배정도 높은 활성의 재조합 NABH를 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the NABH558 gene expression system was constructed to efficiently produce neoagarobiose hydrolase (NABH) in Saccharomyces cerevisiae strain. The ADH1 and GAL10 promoters of the pAMFα-NABH and pGMFα-NABH plasmids were examined to determine the suitable promoter for the NA...

In this study, the NABH558 gene expression system was constructed to efficiently produce neoagarobiose hydrolase (NABH) in Saccharomyces cerevisiae strain. The ADH1 and GAL10 promoters of the pAMFα-NABH and pGMFα-NABH plasmids were examined to determine the suitable promoter for the NABH558 gene expression, respectively. The effect of promoter and carbon sources on NABH558 gene expression was investigated by transforming each plasmid into the S. cerevisiae 2805 strain. The NABH activity in the 2805/pAMFα-NABH strain was 0.069 unit/ml/DCW in YPD medium, whereas that in the 2805/pGMFα-NABH strain was similar (0.02-0.027 unit/ml/DCW) irrespective of the medium composition. The higher NABH activity in the YPD medium was due to the increased NABH558 gene transcription. NABH produced in the recombinant strains could degrade agarose to galactose and AHG. This indicated that ADH1 promoter was a more optimal promoter for the expression of NABH558 gene than the GAL10 promoter. The NABH activity induced by the ADH1 promoter was about 3-fold higher than that induced by the GAL10 promoter.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 한천 바이오매스로부터 효율적으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 agarose를 최종 발효당인 galactose로 변환하는 NABH 효소의 최적 생산조건이 요구되며, NABH의 활성증가를 위한 발현율 증가가 필요하게 된다. 따라서 본 연구에서는 β-agarase와는 달리 유전자의 발현율과 생산성이 낮은 NABH 효소의 발현율 증가를 위한 최적의 발현 시스템 및 배양조건을 확립하여 해조류 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산에 적합한 생산조건을 최적화하고자 하였다. ;

제안 방법

세포 내에 잔존하는 NABH 효소활성을 조사하기 위한 세포 파쇄는 Y-PER (Yeast Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific)를 사용하여 효소액을 회수하였으며[18], 모든 실험값은 3회 독립적으로 수행된 실험에서 평균값을 제시하였다. 각각의 형질전환체에서 NABH558 유전자의 발현율을 비교하기 위한 RT-PCR 분석을 위해 각 형질전환체의 total RNA로부터 cDNA를 합성하였고, NABHF/NABH-R primer와 ACT1-F/ACT1-R primer (Table 1)를사용하여 NABH558 유전자와 ACT1 유전자(internal control)를 각각 증폭하였다[6, 19]. 각각의 band intensity는 scion image program을 이용하여 측정 분석하였다.
NABH558 유전자의 과발현이 유도배지의 조성 및 탄소원에 의해 차이가 난다는 것을 확인하였고, 이러한 활성의 증가가 NABH558 유전자의 transcription level의 증가에 의한 것인지 단백질의 번역 후 변형(translational modification)으로 인한 활성 증가의 영향인지 확인해보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 YPDG 배지에서 유도한 경우, 2805/pGMFα-NABH 균주에 비해 2805/pAMFα-NABH 균주에서 발현된 NABH558 유전자의 transcription level이 약 2.

대상 데이터

본 연구에는 Saccharomyces cerevisiae 2805 (MATαpep4::HIS4 prb1-1.6R can1 GAL2 his3-200 ura3-52) 균주[12]를 효모숙주세포로 이용하였고, NABH 효소의 생산을 위해 Gayadomonas joobiniege G7 균주 유래의 NABH558(AHG558) 유전자[13]를 이용하였다. NABH558 유전자의 발현을 위해 galactose 유도성 promoter인 GAL10 promoter와 구성적 promoter인 ADH1 promoter를 이용하였으며,GAL10 promoter와 mating factor alpha (MFα) 분비서열(MFα s.
6R can1 GAL2 his3-200 ura3-52) 균주[12]를 효모숙주세포로 이용하였고, NABH 효소의 생산을 위해 Gayadomonas joobiniege G7 균주 유래의 NABH558(AHG558) 유전자[13]를 이용하였다. NABH558 유전자의 발현을 위해 galactose 유도성 promoter인 GAL10 promoter와 구성적 promoter인 ADH1 promoter를 이용하였으며,GAL10 promoter와 mating factor alpha (MFα) 분비서열(MFα s.s) [11, 14, 15] 및 NABH558 유전자를 가지는 pGMFα-NABH plasmid [6]를 사용하였다. 또한 ADH1promoter를 가지는 pAMFα-NABH plasmid를 구축하기 위해, pGMFα-NABH plasmid를 주형으로 pAMFa-F와tNABH-R primer (Table 1)를 사용하여 MFαs.

이론/모형

Plasmid stability는 배양액을 적당히 희석하여 YPD 평판배지에 도말한 후 자란 약 100개의 colony를 YNBCAD 선별배지로 toothpicking한 다음 형성된 colony 수의 비 (백분율)로 측정하였다. NABH 효소활성의 차이를 정량적으로 비교하기 위해 DNS assay법[6]을 통해 NABH 효소의 활성을 측정하였고, 효소의 활성은 0.2% agarose를 이용하여 40℃에서 1분당 1 µmole의 galactose를 생산하는 효소의 양을 1 unit으로 정의하였다. 세포 내에 잔존하는 NABH 효소활성을 조사하기 위한 세포 파쇄는 Y-PER (Yeast Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific)를 사용하여 효소액을 회수하였으며[18], 모든 실험값은 3회 독립적으로 수행된 실험에서 평균값을 제시하였다.
각각의 band intensity는 scion image program을 이용하여 측정 분석하였다. 또한 NABH 효소에 의한 agarose 분해산물은 thin layer chromatography (TLC)를 이용하여 분석하였다[6].

성능/효과

이상의 결과로부터 한천바이오매스를 발효당(galactose)으로 최종 당화하기 위한 NABH 효소의 활성증가 및 분비생산을 위해 ADH1 promoter와 MFα 분비서열이 적합함을 확인하였으며, 배지조성 및 탄소원의 최적화에 따라 NABH 효소활성을 조절할 수 있었다.

후속연구

cerevisiae를 이용한 EXGA 유전자(β-1,3-glucanase를 코드)의 발현에서 55−66% 정도의 안정성을 보이는 plasmid를 다른 효모 숙주세포에 도입함으로써 76%까지 plasmid stability를 증가시킨 보고[15]에 따라 pAMFα-NABH plasmid를 이용한 최적의 숙주세포의 선정에 의해 plasmid stability를 좀 더 안정하게 유지시킬 수 있을 것이라 생각된다. 그리고 효모염색체내로 NABH558 유전자의 직접적인 도입(integration)을 통해서 도입한 plasmid를 안정하게 유지시킨다면 좀 더 높은 효소 활성을 얻을 수 있을 것이라 기대한다[14].

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	바이오연료의 생산에 관한 연구개발 및 생산량이 급증하는 이유은?	화석연료의 고갈 및 지구온난화에 따른 친환경 바이오연료(바이오에탄올)의 공급이 시급해짐에 따라 바이오연료의 생산에 관한 연구개발 및 생산량이 급증하고 있다[1]. 따라서 단위면적당 높은 생산성과 고농도의 탄수화물, 난분해성 리그닌의 함량이 적은 해조류 바이오매스를 이용한 바이오에탄올의 생산이 대안으로 부각되고 있다[2, 3].
	바이오에탄올의 생산을 위해서 agarose의 선택적 당화 및 효소학적 공정에는 무엇이 필요한가?	한천을 이용한 바이오에탄올의 생산을 위해서는 agarose를 발효당(galactose)으로 당화(saccharification)하는 공정이 필수적이며, 이를 위해서는 agarose의 선택적 당화 및 발효부산물이 환경에 미치는 영향이 적은 효소학적인 공정[6]이 바람직하다고 할 수 있다. 한천 바이오매스의 효소학적 당화를 위해서는 agarose의 α-1,3 결합을 절단하여 agarooligosaccharide를 생산하는 α-agarase [7]와 β-1,4결합을 절단하여 neoagarooligosaccharide를 생산하는 β-agarase가 필요하다[8]. 또한 β-agarase에 의한 생성물 중neoagarobiose (L-3,6-anhydrogalactosyl-α-1,3-D-galactose)는 neoagarobiose hydrolase (NABH)에 의해 더 가수분해되어 최종적으로 D-galactose와 AHG로 분해된다(Fig.
	galactan은 무엇인가?	해조류는 상대적으로 glucan의 함량이 낮아 해조류 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 glucan 외의 다른 탄수화물(다당)의 선택이 필요하게 되는데, Yanagisawa 등은 glucan 대신에 galactan을 사용하여 한천(agar weed)으로부터 55 g/l의 에탄올 생산을 보고하였다[4]. 한천을 구성하고 있는 galactan은 agarose와 agaropectin으로 이루어져 있으며, 3,6-anhydro-Lgalactose (AHG)와 D-galactose의 α-1,3 결합과 β-1,4 글라이코시드 결합으로 연결되어 있는 중합체(polymer)이다[5]. 한천을 이용한 바이오에탄올의 생산을 위해서는 agarose를 발효당(galactose)으로 당화(saccharification)하는 공정이 필수적이며, 이를 위해서는 agarose의 선택적 당화 및 발효부산물이 환경에 미치는 영향이 적은 효소학적인 공정[6]이 바람직하다고 할 수 있다.

참고문헌 (19)

Naik SN, Goud VV, Rout PK, Dalai AK. 2010. Production of first and second generation biofuels: a comprehensive review. Renew Sustainable Energy Rev. 14: 578-597.

상세보기
John RP, Anisha GS, Nampoothiri KM, Pandey M. 2011. Micro and macroalgal biomass: a renewable source for bioethanol. Bioresour. Technol. 102: 186-193.

상세보기
Lee SM, Kim JH, Cho HY, Joo H, Lee JH. 2009. Production of bio-ethanol from brown algae by physicochemical hydrolysis. J. Korean Ind. Eng. Chem. 20: 517-521.
Yanagisawa M, Kawai S, Murata K. 2013. Strategies for the production of high concentrations of bioethanol from seaweeds: production of high concentrations of bioethanol from seaweeds. Bioengineered 4: 224-235.

상세보기
Duckworth M, Yaphe W. 1971. The structure of agar. I. Fractionation of a complex mixture of polysaccharides. Carbohydr. Res. 16: 189-197.

상세보기
Lee JS, Hong SK, Lee CR, Nam SW, Jeon SJ, Kim YH. 2019. Production of ethanol (agaro-bioethanol) from agarose by unified enzymatic saccharification and fermentation in recombinant yeast. J. Microbiol. Biotechol. 29: 625-632.

원문보기 상세보기
Potin P, Richard C, Rochas C, Kloareg B. 1993. Purification and characterization of the ${\alpha}$ -agarase from Alteromonas agarlyticus (Cataldi) comb. nov., strain GJ1B. Eur. J. Biochem. 214: 599-607.

상세보기
Kirimura K, Masuda N, Iwasaki Y, Nakagawa H, Kobayashi R, Usami S. 1999. Purification and characterization of a novel ${\beta}$ -agarase from an alkalophilic bacterium, Alteromonas sp. E-1. J. Biosci. Bioeng. 87: 436-441.

상세보기
Ha SC, Lee S, Lee J, Kim HT, Ko HJ, Kim KH, et al. 2011. Crystal structure of a key enzyme in the agarolytic pathway, ${\alpha}$ -neoagarobiose hydrolase from Saccharophagus degradans 2-40. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412: 238-244.

상세보기
Lee S, Lee JY, Ha SC, Jung J, Shin DH, Kim KH, et al. 2009. Crystallization and preliminary X-ray analysis of neoagarobiose hydrolase from Saccharophagus degradans 2-40. Acta. Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 65: 1299-1301.

상세보기
Seok JH, Kim HS, Hatada Y, Nam SW, Kim YH. 2012. Construction of an expression system for the secretory production of recombinant ${\alpha}$ -agarase in yeast. Biotechnol. Lett. 34: 1041-1049.

상세보기
Park HS, Kim HC, Shin DH, Kim JK, Nam SW. 2005. Expression of Thermomonoepora fusca exoglucanase in Saccharomyces cerevisiae and its application to cellulose hydrolysis. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 33: 267-273.
Asghar S, Lee CR, Chi WJ, Kang DK, Hong SK. 2019.Molecular cloning and characterization of a novel cold-adapted alkaline 1,3- ${\alpha}$ -3,6-anhydro-L-galactosidase, Ahg558, from Gayadomonas joobiniege G7. Appl. Biochem. Biotechnol. 188: 1077-1095.

상세보기
Choi HJ, Kim YH. 2018. Simultaneous and sequential integration by cre/loxP site-specific recombination in Saccharomyces cerevisiae. J. Microbiol. Biotechnol. 28: 826-830.

원문보기 상세보기
Kim MJ, Nam SW, Tamono K, Machida M, Kim SK, Kim YH. 2011. Optimization for production of exo- ${\beta}$ -1,3-glucanase (laminarinase) from Aspergillus oryzae in Saccharomyces cerevisiae. Korean Soc. Biotech. Bioeng. J. 26: 427-432.
Latchinian-Sadek L, Thomas DY. 1993. Expression, purification, and characterization of the yeast KEX1 gene product, a polypeptide precursor processing carboxypeptidase. J. Biol. Chem. 268: 534-540.

상세보기
Jo JH, Oh SY, Lee HS, Park YC, Seo JH. 2015. Dual utilization of NADPH and NADH cofactors enhances xylitol production in engineered Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. J. 10: 1935-1943.

상세보기
Jung HM, Kim JW, Kim YH. 2016. Secretory expression system of xylose reductase (GRE3) for optimal production of xylitol. J. Life Sci. 26: 1376-1382.

원문보기 상세보기
Hummon AB, Lim SR, Difilippantonio MJ, Ried T. 2007. Isolation and solubilization of proteins after TRIZOL extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques 42: 467-472.

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