[논문]로즈마리(Rosmarinus officinalis L.) 극성별 용매 추출물의 생리활성 검증

이커; 양경희; 궈루; 추이정웨이; 손병구; 강점순; 이용재; 박영훈; 제병일; 최영환

doi:10.5352/jls.2019.29.1.69

[국내논문] 로즈마리(Rosmarinus officinalis L.) 극성별 용매 추출물의 생리활성 검증
Evaluation of the Biological Activity Affected by Extracting Solvents of Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.1 = no.225, 2019년, pp.69 - 75

초록
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로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 식품소재로서 널리 사용되고 있으며 다양한 생리활성이 보고되어 있다. 그러나 극성이 다른 용매 추출물의 상호작용과 생리활성에 관한 연구는 잘 정립되어서 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 로즈마리 분말을 hexane, EtOAc, MeOH 그리고 95%, 70%, 50% 또는 25% EtOH 및 물로 추출한 다음, 각각의 용매 추출물의 항산화, 항비만, 항 ${\alpha}$-glucosidase 활성 및 미백효과 등을 조사하기 위해 수행되었다. 로즈마리 추출물의 항산화 및 tyrosinase 저해 효과는 비교적 극성이 높은 50% EtOH, 25% EtOH 및 증류수 추출물이 가장 효과가 좋았다. 그러나 ${\alpha}$-glucosidase 활성억제는 EtOH의 농도가 높은 50~95%와 MeOH 추출물에서 효과가 가장 좋았다. 지방세포의 분화억제는 70% EtOH로 처리시에 가장 효과가 좋았으며, EtOH의 농도가 70% 보다 증가하거나 감소하였을 경우에는 농도에 비례하여 감소하였다. 본 실험의 결과 최적의 추출용매는 항산화, tyrosinase 저해, ${\alpha}$-glucosidase 활성억제 및 지방세포의 분화 억제 등의 질환에 따라서 차이가 있었다. 이러한 추출용매를 고려하면 추출용매에 따라서 최적의 생리활성 성분의 종류와 함량이 차이가 있고 이로 인하여 생리활성 효과도 달라진 것으로 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) is widely used as a food material. Although various physiological activities of rosemary have been reported, there have been no studies on the physiological activity of solvent extracts with different polarities. Rosemary extracts were obtained by extraction of dried powder using 0%, 25%, 50%, 70%, and 95% ethanol (EtOH) in distilled water, methanol, ethyl acetate, and hexane. As these ratios of EtOH are generally chosen by default and scarcely optimized, we investigated the impact of the composition of EtOH in distilled water on extract-related characteristics, such as DPPH free radical scavenging and ${\alpha}$-glucosidase inhibition, on the differentiation of 3T3-L1 adipocytes and inhibition of tyrosinase. Adipogenesis inhibition was highest at 70% EtOH. DPPH scavenging activity and inhibition of tyrosinase activity were reduced with 50% EtOH in water. However, inhibition of ${\alpha}$-glucosidase activity was higher in 50% EtOH in water. The best solvents in terms of DPPH scavenging activity, inhibition of tyrosinase and ${\alpha}$-glucosidase, and differentiation of adipocytes obtained with different concentrations of EtOH, although a lower similar activities were found with 50% ethanol. Considering the extraction solvents, a ratio of EtOH in water gives different content and constituents of compounds. These differences will give activities inhibition of adipogenesis, tyrosinase, ${\alpha}$-glucosidase activity, and DPPH scavenging activity.

Keyword

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. The process of inducing cell adipogenesis and drug treatment.
표 Table 1. Inhibitory effect of DPPH scavenging in Rosmarinus officinalis L. leaf and stem powder extracts
표 Table 2. Inhibitory effect of α-glucosidase in Rosmarinus officinalis L. leaf and stem powder extracts
그림 Fig. 2. Rosemary extracts inhibited adipogenesis in the 3T3-L1 cell line. The 3T3-L1 cell line was maintained in DMEM containing 10% FBS, 25 mM NaHCO₃ and 25 mM HEPEs (culture medium) and adipogenesis was induced with culture medium including 10 μM rosiglitazone, 10 μg/ml insulin and 1 μM dexamethasone (differentiation medium). All extracts were treated 50 μg/ml throughout the induction period. Cells were stained with oil red O for photography (A), after which the oil red O was dissolved using iso-propanol and the OD value was determined (B). Pictures were taken at 200× (A). Values are presented as the mean ± SD (n=3).
그림 Fig. 3. Inhibitory effect of tyrosinase in Rosmarinus officinalis L. leaf and stem powder extracts. Kojic acid used as positive control is percent at 50 μg/ml. Results are presented as mean ± SD of three independent experiments.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 건조분말 로즈마리를 hexane과 ethyl acetate 및 메탄올과 증류수에 에틸알콜의 농도를 95%, 70%, 50%, 25% 및 0%로 혼합한 용매로서 추출한 다음 DPPH 소거능, α-glucosidase 활성억제, 지방세포 분화억제, tyrosinase 저해 활성을 검증하고, 최적의 추출용매 조건을 확립하고자 하였다.
산화적인 스트레스에 의해서 생체가 불균형 상태로 되거나 ROS를 조절하지 못하면 암, 혈관질환, 당뇨를 비롯한 다양한 질병과 합병증을 유발하게 된다[27]. 이러한 산화기전 억제효과를 확인하기 위해 로즈마리 잎과 줄기 혼합분말의 용매추출물에 대한 DPPH 소거능을 조사하였다. 로즈마리 잎과 줄기 분말을 hexane, EtOAc (ethyl acetate), MeOH (methyl alcohol), 95% EtOH(ethyl alcohol), 70% EtOH, 50% EtOH, 25% EtOH 및 물 추출물에 대하여 DPPH 소거능을 조사한 결과는 Table 1에서 보는 바와 같다.

가설 설정

1)Ascorbic acid is used as positive control.
1)Acarbose used as positive control is percent at 500 μg/ml.

제안 방법

지방분화의 억제는 Zebisch 등[31]의 방법을 변형하여 사용하였다, 3T3-L1 세포배양은 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin이 첨가된 DMEM 배지에 2×105 cells/ml 농도로 48-well plates에 부유시켜 48시간 동안 배양하여 confluent 상태가 되도록 37℃의 CO2 incubator에서 배양하였다.
대조군으로는 α-glucosidase 저해제로 알려진 acarbose (Sigma, St Louis, Missouri, USA)를 사용하였으며, 다음 계산식에 의거하여 활성을 산출하였다.
20 μl의 p-nitrophenyl α-D-glucospy-ranoside (pNPG, 5 mM)을 첨가하여 실온에서 20분 동안 반응 후 50 μl의 탄산나트륨(0.1 M)을 첨가하여 반응을 중단시켜서 substrate인 pNPG로부터 유리되어 나오는 반응 생성물인 p-nitrophenol을 405 nm에서 측정하여 α-glucosidase 활성의 억제정도를 측정하였다.
로즈마리 용매별 물추출물의 α-glucosidase 활성억제능은Angelov 등[4]의 방법을 변형하여, 96 well plate에 각 농도별 추출물 2 μl, 10 μl alpha-glucosidase (1 U/ml), 68 μl phosphate buffer (pH = 6.8, 100 mM)를 혼합하여 37℃에서 15분간 두었다.
Negative control은 10 μl의 50% DMSO 및 증류수를 넣어 측정하였고, positive control은 ascorbic acid를 사용하여 다음 계산식에 의거하여 소거활성을 측정하였다.
DPPH radical 소거활성은 Blois [7]의 방법을 변형하여 측정 하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 0.
Tyrosinase 저해활성은 Yagi 등[30]의 방법을 변형하여 사용하였다, 96-well의 microplate에 118 μl의 PBS (0.1 M, pH6.8), 40 μl의 tyrosinase (31 units/ml), 40 μl의 L-DOPA (2.5mM) 및 로즈마리 각각의 추출물(12.5~200 μg/ml) 2 μl를 첨가한 혼합물을 37℃에서 10분간 반응시킨 후 생성된 DOPAchrome을 분광광도계를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2일간 분화 유도 후 1 μg/ml의 insulin이 함유된 10% FBS-DMEM으로 2일간 배양하였다. 그 후 2일마다 4회 10% FBS-DMEM으로 교체하였다. 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다(Fig.
로즈마리 잎과 줄기의 분말을 ethyl acetate, methanol, 95% EtOH, 70% EtOH, 50%EtOH, 25% EtOH 및 증류수 추출물이 tyrosinase 활성 저해에 미치는 효과를 조사하기 위하여 추출물을 200,100, 50, 25, 12.5 μg/ml의 농도로 처리한 다음 tyrosinase 활성 저해율을 측정하였다(Fig. 3).

대상 데이터

본 실험에 사용 된 3T3-L1 세포주는 KCLB (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)서 구입하였고, 세포 배양에 사용한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS) penicillin/streptomycin, trypsinEDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)와 10% fetal bovine serum (FBS) (웰진, 경상시, 한국)로부터 구입하여 사용하였다.
본 실험에 시료로 사용 된 로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 ㈜옴니허브(영천시. 한국)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용 된 3T3-L1 세포주는 KCLB (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)서 구입하였고, 세포 배양에 사용한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS) penicillin/streptomycin, trypsinEDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)와 10% fetal bovine serum (FBS) (웰진, 경상시, 한국)로부터 구입하여 사용하였다.
Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. DPPH, ascorbic acid, mushroom tyrosinase, kojic acid, glucosidase, acarbose, NaHCO3, HEPEs, insulin, rosiglitazone, dexamethasone, oil red O 등은 SigmaAldrich (Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용 된 3T3-L1 세포주는 KCLB (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)서 구입하였고, 세포 배양에 사용한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal calf serum (FCS), fetal bovine serum (FBS) penicillin/streptomycin, trypsinEDTA는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)와 10% fetal bovine serum (FBS) (웰진, 경상시, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. DPPH (1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), DMSO (dimethyl sulfoxide), Folin-ciocalteau reagent, bovine serum albumin (BSA), insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-methyl xanthine (IBMX), oil red-O reagent, MTT (3-[4,5-methylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetra zolium bromide), potassium persulfate, trizol reagent는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. DPPH, ascorbic acid, mushroom tyrosinase, kojic acid, glucosidase, acarbose, NaHCO3, HEPEs, insulin, rosiglitazone, dexamethasone, oil red O 등은 SigmaAldrich (Sigma, St.

데이터처리

유의성 검정은 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분산분석(ANOVA test)을 실시하고 Duncan의 다중검정(Duncan’s multiple range test)을 통해 95% 신뢰 수준에서 나타내었다.
모든 실험은 3회 반복으로 실시하였으며 결과는 평균에 대한 표준편차 또는 표준오차로 나타내었다. 유의성 검정은 SPSS 12.
3)Means with different superscript letters (a-f) within a column are significantly different at p<0.05 by a Ducan’s multiple range tests (n=3).

이론/모형

지방세포에 대한 로즈마리 추출물의 세포독성은 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 1×104 cells/well의농도로 96 well culture plate에 100 μl의 배지와 함께 24시간 배양한 다음, 로즈마리 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다.
지방전구세포 분화 시에 형성된 지방의 함량은 oil red-O염색법에 의해 측정하였다. 분화 8일 후에 배지를 제거한 뒤 분화된 세포표면을 PBS로 2회 세척한 다음 4% paraformaldehyde (TCI, Tokyo, Japan)로 실온에서 20분 동안 고정하고 PBS로 세척하였다.

성능/효과

로즈마리 용매 추출물의 DPPH radical 소거능 IC50값은 hexane 추출물이 48.94±1.53 μg/ml로서 활성산소 소거 능이 가장 낮았으며, EtOAc 추출물은 31.74±0.51 μg/ml 및 MeOH 추출물은 25.38±0.13 μg/ml으로서 용매의 극성이 증가할수록 효능도 증가하였다.
50%, 25%로 조절한 용매와 물 추출물의 IC50값은 각각 29.24±0.36 μg/ml, 21.53±0.18 μg/ml, 11.73±0.14 μg/ml, 12.40±0.12μg/ml, 12.19±0.25 μg/ml으로서 EtOH의 농도가 50% 이하의고 극성용액 추출물의 IC50값이 13 μg/ml 이하로서 positivecontrol인 비타민 C의 17.01±0.80 μg/ml 보다 낮아 그 효과가 매우 좋았다.
열수 추출물은 10 μg/ml의 농도에서 대조군 대비 40.1%의 억제율을 나타내었고, 에탄올 추출물의 경우 10 μg/ml의 농도에서 대조군 대비 22.4%의 억제율을 나타내어 에탄올 추출물보다 열수 추출물의 지방분화억제 효과가 우수하였다(Fig. 2).
로즈마리 분말을 95%, 70%, 50%, 25% EtOH 증류수 MeOH, EtOAc 및 hexane추출물 50 μg/ml을 처리하여 지방 분화능을 측정한 결과, 70% EtOH추출물은 DMSO 처리군 대비 35.5%로서 억제율이 가장 높았고, 70% EtOH 추출물을 기준으로 하여 EtOH의 농도가 높아지거나 낮을수록 효과는 감소하였다(Fig. 2).
용매의 종류 또는 농도에 따른 추출물의 α-glucosidase 활성억제 효과는 100% MeOH 또는 95%~50% EtOH용매로 추출하였을 때에 가장 좋았다.
IC50 값은 100% MeOH,95% EtOH, 70% EtOH 및 50% EtOH 용매 추출물이 10 μg/ml 이하로서 매우 좋았으며, EtOH 25%과 물 추출물은 25 μg/ml 이상으로서 극성이 너무 높아질 경우에는 효과가 감소하는 경향이었다.
그러나 로즈마리 추출물은 200 μg/ml 이하에서 50% 이상의 억제 효과를 나타내어 IC50값을 구할 수 있었는데, hexane추출물은 125.02±1.36 μg/ml로서 억제효과가 매우 낮았으며, EtOAc 및 MeOH 등으로 용매의 극성이 높을수록 억제효과가 증가되었다.
본 연구에서는 증류수에 에탄올의 농도가 50% 이하일 때에 IC50값이 13 μg/ml 이하로서 positive control인 비타민 C 보다 낮아 DPPH 소거능이 더 높았는데, 이는 에탄올이 50% 이하로 함유된 용매로 추출시에 항산화능이 높은 수용성 성분이 많이 함유되어 있기[3] 때문인 것으로 추측된다.
80 μg/ml 보다 낮아 그 효과가 매우 좋았다. 그러나 EtOH의 농도가 50%에서 95%까지 증가 할수록 IC50값이 증가하여 DPPH radical 소거능은 감소하는 경향이었다.
2). 또한 MeOH 추출물은 효과가 거의 없었고, hexane과 물추출은 약 15%의 억제효과가 있었으며, EtOAc 추출물은 9.4%의 억제율로서 효과가 가장 낮았다. 열수 추출물은 10 μg/ml의 농도에서 대조군 대비 40.
또한 로즈마리의 비만효과를 나타내는 성분은 rosmarinic acid와 carnosic acid이며, 증류수에서 에탄올의 비율이 높을 때에 carnosic acid가 많이 추출되며, 알콜의 비율이 낮을 수록 rosmarinic acid가 적게 추출된다고 하였다[16]. 본 연구에서도 추출 용매의 극성에 따라서 항비만 효과의 차이가 있었는데 이는 용매의 극성에 따라서 rosmarinic acid와 carnosic acid는 물론 다른 생리활성 성분의 용해도의 차이에 기인한 것으로 생각된다.
3). Tyrosinase 활성 저해율은 추출 용매의 종류 및 EtOH의 농도에 따라서 달랐으며, 추출물의 처리농도가 증가할수록 tyrosinase 활성 저해율이 증가하는 경향을 보였고, 특히 50%와 25% ethanol 및 물 추출물이 효과가 좋았으며, methanol, 95%와 70% ethanol 추출물은 중간정도, ethyl acetate 추출물은 억제효과가 현저히 낮았다. Tyrosinase는 피부에 침착되는 색소인 melanin 형성에 있어 중요한 단계를 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있어서 피부 미백과 관련된 연구에서 활성의 주요 판단 근거로 사용되고 있다[11].
Tyrosinase는 피부에 침착되는 색소인 melanin 형성에 있어 중요한 단계를 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있어서 피부 미백과 관련된 연구에서 활성의 주요 판단 근거로 사용되고 있다[11]. 본 연구에서는 로즈마리 분말을 다양한 용매로 추출한 다음 tyrosinase억제 효과를 조사한 결과 50% 이하의 에탄올 추출물이 효과가 좋은 것으로 나타났다.
이상의 결과를 종합하면 로즈마리의 생리활성 성분은 rosmarinic acid, carnosic acid, chlorogenic acid, caffeic acid 및 gallic acid 등이 있으며[8, 16], 생리활성 성분은 추출용매의 극성에 따라서 용해도가 다르기 때문이 함량차이가 있다고 하였다[16]. 본 연구에서도 추출용매의 극성 차이로 인하여 추출되는 생리활성 성분의 종류 및 함량의 차이가 있었을 것이며[16].

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	로즈마리의 주요 성분은 무엇이 있는가?	국내에서는 제주도를 비롯한 남부지역에서 월동이 가능하며 식품의 향신료나 향수의 원료로서 산업적인 이용을 목적으로 생산이 되고 있다. 잎과 줄기 전체에 독특한 향기성분이 함유되어 있는데 주요 성분으로는 α-pinene, apigenin, β-carotene, β-sitosterol, betulinic acid, borneol, rosmanol, rosmarinic acid, 1-8 cineol, carnosol, carnosic acid, tannin, limonene, camphor, camphene 등이 알려져 있다[2]. 이러한 성분들로 인하여 로즈마리 추출물은 항산화[2, 5, 16, 17, 24, 26], 항암[13, 20], AIDS [5], 항균활성[23, 29] 등의 다양한 효과가 보고되고 있다.
	국내에서 로즈마리가 생산되는 곳은 어디이며 생산 목적은 무엇인가?	)는 꿀풀과(Labiatae)의 상록성 다년초로서 식용, 약용, 미용, 향료 및 관상용으로 널리 사용되고 있고, 향기가 오래 지속되고, 머리를 맑게 하여 기억을 새롭게 해 주는 것으로 알려져 있기 때문에 다양한 분야에서 이용되고 있다[22]. 국내에서는 제주도를 비롯한 남부지역에서 월동이 가능하며 식품의 향신료나 향수의 원료로서 산업적인 이용을 목적으로 생산이 되고 있다. 잎과 줄기 전체에 독특한 향기성분이 함유되어 있는데 주요 성분으로는 α-pinene, apigenin, β-carotene, β-sitosterol, betulinic acid, borneol, rosmanol, rosmarinic acid, 1-8 cineol, carnosol, carnosic acid, tannin, limonene, camphor, camphene 등이 알려져 있다[2].
	로즈마리는 어떤 효능이 있는가?	지중해 지역이 원산지인 로즈마리(Rosmarinus officinalis L.)는 꿀풀과(Labiatae)의 상록성 다년초로서 식용, 약용, 미용, 향료 및 관상용으로 널리 사용되고 있고, 향기가 오래 지속되고, 머리를 맑게 하여 기억을 새롭게 해 주는 것으로 알려져 있기 때문에 다양한 분야에서 이용되고 있다[22]. 국내에서는 제주도를 비롯한 남부지역에서 월동이 가능하며 식품의 향신료나 향수의 원료로서 산업적인 이용을 목적으로 생산이 되고 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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