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문제 정의
- 이렇게 현재 유통되는 대표적 탈모 치료 약물이 많은 부작용을 가지고 있어 부작용이 적은 천연소재의 개발이 필요한 실정이다. 따라서 천연생약추물을 이용한 경피 도포용 발모 촉진제를 개발하기 위하여 상기 연구에서는 탈모에 효과가 있는 경피도포용 약물인 minoxidil과 발모효과가 있는 천연생약 추출물을 실험용 쥐를 이용하여 효과를 비교확인 하였다.
- 따라서, 뛰어난 발모 효과를 보이면서 부작용 우려가 적은 천연물 소재의 탈모 치료제 개발이 필요하다7). 상기 연구에서는 탈모에 효과가 있는 경피도포용 약물인 minoxidil과 발모효과가 있는 천연생약 추출물을 실험용 쥐를 이용하여 효과를 비교 확인하고, 이를 경피 도포용 발모 촉진제로 제조하여 새로운 탈모치료제의 가능성을 확인하고자 한다.
가설 설정
- A: Histological changes of hair follicles in the dorsal skin ofC57BL/6N mice (H&E, x40), after 4 weeks.
- B: Histological changes of hair follicles in the dorsal skin of C57BL/6N mice (H&E, x40), after 8 weeks.
제안 방법
- 1% TXN을 도포하여 탈모를 유발한 C57b1/6N 생쥐에 AhnTonic을 도포하여 발모에 미치는 영향을 알아본 결과 1% TXN 대조군과 MXD 실험군과 비교하여 다음과 같은 유의한 결론을 얻었다. 생장기 모발 성장치를 버니어캘리퍼스로 0.
- 실험동물은 ㈜오리엔트바이오에서 구입한 체중 25g 내외의 수컷 7주령 C57BL/6N 정상생쥐를 이용하였으며, 각각의 실험군에는 10마리씩 배정하였다. 10마리 중 5마리는 4주차까지, 나머지 5마리는 8주차까지 관찰하여 각각 시험 시작일 부터 4주후, 시작일부터 8주후의 변화를 관찰하였다. 실험의 정확성을 위하여 모두 출생날짜가 유사한 것을 이용하였다.
- ALP, HEY1, HGF, KGF, Versician mRNA gene expression patterns in experiment. To quantify ALP, HEY1, HGF, KGF, VersicianmRNA gene expression, RT-PCR analysis was carried out. Normal group:normal C57BL/6N mice, 1%TXN(CTL): Saline administration after 1% Testosterone for 1 week, 1%TXN_5%MDX: 5% Minoxidil administration after 1% Testosterone for 1 week, 1%TXN_Ahn Tonic: Ahn Tonic administration after 1% Testosterone for 1 week.
- 정상군을 제외한 나머지 군은 1%TXN(Testesteron)으로 1주일간 도포하여 발모를 억제시켰다. 그 후 실험군 2군을 각각 1일 2회씩 경피 도포용 발모 촉진제 5%MXD(minoxidil), Ahn Tonic(한방추출 천연혼합물 토닉제, 0.2ml/day)을 등 피부에 도포한다. 1% TXN 대조군은 동일한 스트레스를 주기 위하여 일정량의 증류수로 수차례 씻은 다음 생리식염수를 스프레이로 동일한 정량을 도포한다.
- 본 실험에서는 열탕추출기 (DWT-1800T, 대웅, Seoul,Korea), 감압 증류장치 (rotary vaccum evaporator, BUCHIB-480, Flawil, Switzerland), 동결 건조기 (freeze dryer, EYELAFDU-540, Tokyo, Japan), CO2 배양기 (Forma scientific Co.,OH, USA), 원심분리기 (Hanil scientific INC., Gimpo, Korea),plate shaker(Lab-Line, IL, USA), spectrophotometer(Shimazu, Kyoto, Japan), Bio-freezer (Sanyo, Osaka, Japan),Quantitative Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA),ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA), flow cytometer(Becton Dickinson, CA, USA), heating mantle (An-gelia7700, Angel co. Busan, Korea), image analysis software(Each systemships with 1 full version of Quantity One and unlimited copies of Quantity OneBasicMode. Bio-Rad, USA),광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 등을 사용하였다.
- 실험 전 등쪽 체모를 애니멀 클리퍼(animal clipper)로 짧게 제거하여 제모 한다. 성장한 체모의 길이는 시료 투여 후 0일, 2주, 4주 후 생장기 모발 성장치를 버니어캘리퍼스로 0.1mm까지 관찰한다.
- 실험 시작 후 0일, 2주, 4주, 6주, 8주 후 털이 자라는 상태를 확인하기 위해 에테르로 마취한 후 사진촬영을 실시하였다. 사진기는 Nikon사의 D70모델 (Tokyo, Japan)을 사용한다.
- 유전자 발현은 TaqManprobe (FAM dye-labeled, ABi, USA)를, internal standard를 Mouse GAPDH probe set;Endogenous Control (VIC® / MGB Probe, Probe limited) from AppliedBiosystems (4352339E)를 사용하였고, primer의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다.
- 사진기는 Nikon사의 D70모델 (Tokyo, Japan)을 사용한다. 이 사진을 image analysis software (Each systemships with 1 full version of Quantity One and unlimited copies of QuantityOneBasicMode. Bio-Rad, USA)로 분석한다. 전체 삭모 부위 중생장기 모발이 자란 부위의 비 (전체 삭모 부위 면적 중 검정색으로 변한 면적의 비)를 구한다.
- 통상적인 방법의 조직처리과정을 거쳐 파라핀에 포매한 후, 마이크로톰 (HM-315model, MicromCo., Germany)을 이용하여 제작한 4μm의 파라핀 조직절편을 Hematolxylin & Eosin 염색하여 광학현미경 (Olympus, Tokyo,Japan)으로 모낭조직의 조직학적 변화를 관찰한다.
- 각 실험동물로부터 적출한 피부조직들의 유전자 발현 양상을 real-time PCR 증폭법을 사용하여 알아본다. 피부 조직은 RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR GreenPCR kit (AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 한다. 지방 조직에 RNAzolB 500 ㎕를 넣고 homogenizer로 조직을 분쇄하여 여기에 chloroform (CHCl3) 50 ㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합한다.
대상 데이터
- Ahn Tonic(한방추출 천연혼합물 토닉제)은 대한민국 천안에 위치한 대전대학교 부속 천안한방병원에서 공급하였다. 투명한 액상 형태의 혼합물로써, 구성성분은 아래 Table 1과 같다.
- C57BL/6N 생쥐의 등을 제모한 후 각각 군당 10마리씩 모두 4군으로 나누어 실험하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 1%TXN(Testesteron)으로 1주일간 도포하여 발모를 억제시켰다.
- 이 휴지기에 실험동물의 자체적 모발 성장 인자에 의한 영향이 배제되므로, 실험 물질만의 효능을 평가하기에 적절하다. 또한, melanocyte가 모낭에만 한정적으로 존재하고 있으며, melanin 합성이 모발 성장 주기와 잘 일치되어 휴지기의 경우, 등판 피부색이 붉은 색을 띠고 성장기의 경우 진회색을 띠어 피부색으로 모발 성장주기를 판정할 수 있어 휴지기를 지난 성장기 도입 시기를 눈으로 볼 수 있으므로, 실험의 종료 시점을 쉽게 찾을 수 있는 장점이 있어 실험동물로 선정하였다19).
- 본 실험에 사용된 시약 diethyl pyrocarbonate(DEPC),Naphthylethylene diamine dihydrochloride, Sulfonylami-de,2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate, Sodium Nitrite,chloroform, trichloroacetic acid, isopropanol, Tris-HCl, KCl,MgCl2, Dubecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배양액, dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS), sulforhodaminB(SRB), 2-isopropanol, sodium dodecyl sulfate(SDS),Streptom-mycin 등은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 시료에는 창포, 녹차, 도인, 구기자, 고삼이 포함되어 있다. 창포(菖蒲; AcoriGraminei Rhizoma)는 천남성과에 속한 다년생 초본인 석창포의 뿌리를 건조한 것으로 化痰開竅, 化濕行氣, 祛風利痺, 消腫止痛의 효능이 있어 열로 인한 정신질환, 이명, 복부통증, 타박상, 피부질환을 치료한다12).
- 실험 시작 후 0일, 2주, 4주, 6주, 8주 후 털이 자라는 상태를 확인하기 위해 에테르로 마취한 후 사진촬영을 실시하였다. 사진기는 Nikon사의 D70모델 (Tokyo, Japan)을 사용한다. 이 사진을 image analysis software (Each systemships with 1 full version of Quantity One and unlimited copies of QuantityOneBasicMode.
- 습(濕을) 없애고 비위(脾胃)의 기능을 원활하게 하여 모발이 영양분을 잘 흡수하고 어혈(瘀血)을 제거하여 모발을 윤택하고 풍부하게 하는 효과를 주기위해 이렇게 청열조습(淸熱燥濕), 화위화위(化濕和胃), 보음(補陰), 항염증효과, 화어(化瘀) 등의 효과를 가진 5가지의 한약재를 선택하였다.
- 실험동물은 실험의 용이성을 고려하여 C57BL/6N쥐를 사용하였다. 실험동물은 ㈜오리엔트바이오에서 구입한 체중 25g 내외의 수컷 7주령 C57BL/6N 정상생쥐를 이용하였으며, 각각의 실험군에는 10마리씩 배정하였다. 10마리 중 5마리는 4주차까지, 나머지 5마리는 8주차까지 관찰하여 각각 시험 시작일 부터 4주후, 시작일부터 8주후의 변화를 관찰하였다.
- 실험동물은 실험의 용이성을 고려하여 C57BL/6N쥐를 사용하였다. 실험동물은 ㈜오리엔트바이오에서 구입한 체중 25g 내외의 수컷 7주령 C57BL/6N 정상생쥐를 이용하였으며, 각각의 실험군에는 10마리씩 배정하였다.
- Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Gibco(Paisley, UK)제품을, RNase inhibitor와 M-MLV RT는Invitrogen (CA, USA) 제품을, RNAs-olB는 Tel-Test (TX, USA)제품을 사용하였다. 마우스 GAPDH probe set (VIC / MGBProbe, 4352339E), Taqman master mix와 SYBR master mix는ABi (CA, USA)사 제품을, EZ-Cytox는 대일바이오텍 (Suwon,Korea), cyclosporin A는 중외제약 (Seoul, Korea)제품을 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- 이 20 ㎕의반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ heating block에서 45분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용한다. Realtime quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system (AppliedBiosystems, USA)를 이용하여 수행한다.
- 각 실험동물로부터 적출한 피부조직들의 유전자 발현 양상을 real-time PCR 증폭법을 사용하여 알아본다. 피부 조직은 RNAsolB (Tel-Test) 용액을 사용하여 각 조직으로부터 RNA를 추출한 뒤 One-step SYBR GreenPCR kit (AB science)를 사용하여 cDNA 및 real-time PCR 분석을 한다.
성능/효과
- 1% TXN + Ahn Tonic 실험군(이하Ahn Tonic 실험군)에서 모발 성장 길이가 1% TXN 대조군에 비하여 유의하게 증가하였다(p<0.01)(Fig. 1).
- TXN 유도 발모 동물 모델에서 유전자 발현 분석 결과, AhnTonic 실험군에서 대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 ALP mRNA(p<0.05), HEY1 mRNA(p<0.05), HGF mRNA(p<0.001), KGF mRNA(p<0.01), VersicianmRNA(p<0.001) 유전자 발현의 증가가 관찰되었다.
- 시험동물에 시료 도포 4 주후에 조직검사를 한 결과, 대조군에 비하여 5% MXD 실험군, Ahn Tonic 실험군이 모낭의 수와 크기가 많고 증가하였다. 그리고 최종 시료 도포 8 주후에 조직검사한 결과에서는 대조군에 비하여 5% MXD 실험군, Ahn Tonic 실험군이 모낭의 수와 크기가 많고 증가하였다. 또한, 염증소견이나 기타 병리학적 소견은 발견되지 않았고, 모낭의 모양이 길게 형성되었다(Fig.
- Versican은 성장기에서 가장 강하게 발현되는 모낭 활성인자로, 퇴행기와 휴지기에서는 감소하여 모유두세포의 증식을 유도하고 성장기를 유지시켜 모발이 정상적으로 유지될 수 있도록 돕는다23). 따라서 TXN 유도 발모동물모델에서 발모촉진 유전자인 ALP mRNA 유전자, HGF mRNA 유전자, KGFmRNA 유전자, Versician mRNA 유전자 발현이 통계학적 유의성 있게 증가하는지를 관찰하여 Ahn Tonic이 발모를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.
- 발모유전자 6개의 발현을 real-time PCR을 사용하여 분석한 결과 Ahn Tonic 실험군에서 유전자 발현이 통계학적으로 유의성 있게 증가되었다.
- 본 논문에서는 심각한 사회 문제로 떠오르고 있는 탈모를 부작용을 최소화 하여 치료할 수 있는 천연물 발모제 개발을 위해Ahn Tonic을 이용한 발모관리를 통해 기존 발모제 MXD과 탈모 개선 효과를 비교 검토하였고 실험 결과, Ahn Tonic이 생장기 모발의 발모를 촉진하여 양모 효능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 모발 성장길이가 1% TXN 대조군에 비해 AhnTonic 실험군과 양성대조군인 5% MXD 실험군이 유의적으로 증가되었고 전체 삭모 부위 중 생장기모발이 자란 부위의 비가 통계학적으로 유의성 있게 증가 하였다. 조직검사상 모낭의 수와 크기, 유전자 발현정도가 1% TXN 대조군에 비해 Ahn Tonic 실험군에서 유의적으로 증가되었고 양성대조군인 5% MXD 실험군과 비슷한 수준이었다.
- 생장기 모발 성장치를 버니어캘리퍼스로 0.1mm까지 관찰한 결과 4주 후 1% TXN+5% MXD 실험군(이하 5% MXD 실험군)의 모발 성장 길이가 1% TXN 대조군(이하 대조군)에 비하여 유의성 있게 증가되었다(p<0.001).
- 1% TXN을 도포하여 탈모를 유발한 C57b1/6N 생쥐에 AhnTonic을 도포하여 발모에 미치는 영향을 알아본 결과 1% TXN 대조군과 MXD 실험군과 비교하여 다음과 같은 유의한 결론을 얻었다. 생장기 모발 성장치를 버니어캘리퍼스로 0.1mm까지 관찰한 결과, 4주후 1% TXN 대조군에 비하여 Ahn Tonic 실험군이 유의성 있게 증가하였고 5% MDX 실험군의 모발 성장도 유의성 있게 증가되었다.
- 시험동물에 시료 도포 4 주후에 조직검사를 한 결과, 대조군에 비하여 5% MXD 실험군, Ahn Tonic 실험군이 모낭의 수와 크기가 많고 증가하였다. 그리고 최종 시료 도포 8 주후에 조직검사한 결과에서는 대조군에 비하여 5% MXD 실험군, Ahn Tonic 실험군이 모낭의 수와 크기가 많고 증가하였다.
- 실험 8주후 1% TXN대조군이 194.05±5.96인데 비하여 Ahn Tonic 실험군(p<0.05)과 5% MXD 실험군(p<0.001)이 각각 216.8±7.19와 240±6.01로 모발이 자란 부위가 유의성 있게 증가하였다(Fig. 2-4).
- 양모의 육안관찰을 위하여 사진을 찍어 분석한 결과, 실험 시작 4주 후 5% MXD 실험군(p<0.01)과 Ahn Tonic 실험군(p<0.01)에서 등 부분의 전체 삭모 부위 중 생장기 모발이 자란 부위의 비(전체 삭모 부위 면적 중 검정색 변한 면적의 비)가 223.5±2.23,208.25±3/83으로 대조군의 181.30±10.61에 비해 통계학적으로 유의성 있게 증가하여 발모 증가가 관찰된다.
- 전체 삭모 부위 중 생장기모발이 자란 부위의 비(전체 삭모부위 면적 중 검정색 변한 면적의 비)를 시험 4 weeks와 8 weeks 째 측정한 결과, 1% TXN 대조군에 비하여 Ahn Tonic 실험군과 5% MXD 실험군 모두 모발이 자란 부위가 통계학적으로 유의성 있게 증가하였다.
- 조직검사 결과, 대조군에 비하여 5% MXD, Ahn Tonic 실험군이 모낭의 수와 크기가 증가하였다. 또한, 염증소견이나 기타 병리학적 소견은 발견되지 않았고, 모낭의 모양이 길게 형성되었다.
- 본 실험에서 모발 성장길이가 1% TXN 대조군에 비해 AhnTonic 실험군과 양성대조군인 5% MXD 실험군이 유의적으로 증가되었고 전체 삭모 부위 중 생장기모발이 자란 부위의 비가 통계학적으로 유의성 있게 증가 하였다. 조직검사상 모낭의 수와 크기, 유전자 발현정도가 1% TXN 대조군에 비해 Ahn Tonic 실험군에서 유의적으로 증가되었고 양성대조군인 5% MXD 실험군과 비슷한 수준이었다.
후속연구
- 시험기간 동안 실험물질을 도포한 모든 실험동물에서 특별한 이상증상(physical sign)이 관찰되지 않았으나, 체중변화와 독성관찰을 통해 안전성에 대한 추가연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 통해 Ahn Tonic은 탈모를 유발한 C57b1/6N 생쥐에서 발모를 촉진하는데 유의적인 효과가 있다고 볼 수 있으며 이러한 기전을 바탕으로 탈모에 대한 대체 치료제로 이용가능 할 것으로 판단된다.
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