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문제 정의
- MACROD2 유전자에서 SNP의 고혈압 환자군과 건강 대조 군 간의 MAF 차이에 따른 통계적 유의성을 분석하여 유전적 변이에 따른 고혈압 상태와의 상관성에 대하여 알아보고자 하였다. 그 결과 16개의 SNP에서 고혈압 상태와 통계적으로 의미 있는 유의성이 확인되었다.
- ZFAT는 T세포 항상성과 T 세포 수용체 매개반응 등 면역과 관련되어 있다고 알려진 유전자로, 분석 결과 60개의 SNP 중 수축기 혈압과 이완기 혈압에서는 연관성이 나타나지 않았고, 고혈압에 대해서는 22개의 SNP에서 유의성이 확인되었으나, 본 연구에서는 수축기 혈압과 이완기 혈압에 영향을 받는 고혈압 에 대한 연구를 목적으로 한 연구이기 때문에 ZFAT는 이번연구 에서 고려하지 않았다.
- 5일에서 성년기까지 두뇌, 특히 심실영역에서의 발현을 나타냈다[14]. 또한 MACROD2 exon 결실이 비만에 영향을 미칠 수 있다는 연구 결과[15]를 바탕으로 본 연구에서는 한국인 유전체 역학 데이타를 기반으로 하여 MACROD2 유전자의 다형성과 고혈압과의 상관 관계를 조사 분석하였다.
- 본 연구에서는 대규모 유전체 역학 코호트를 이용한 연구로, MACROD2의 특정 SNP들이 혈압에 영향을 미칠 것이라는 가능성을 제시해 주고 있다. 하지만 MACROD2가 어떻게 고혈압 에 영향을 미치는 지에 대해서는 직접 실험을 진행하지 않아 insilico를 통해서 간접적으로 알 수 있다는 한계점이 있다.
- 본 연구에서는 한국인을 대상으로 MACROD2 유전적 다형성(341개 SNP)과 혈압 수치 및 고혈압 상태에 대한 상관 분석을 시행하였다. 고혈압 환자의 경우 수축기 혈압의 평균과 이완기 혈압의 평균 수치들이 각각 고혈압의 기준인 140 mmHg, 90 mmHg 보다 낮은 수치를 보여주고 있는데, 이것은 고혈압 환자 군에 고혈압 약을 복용하여 원래 자신의 혈압보다 낮은 혈압으로 측정된 사람들이 포함되었기 때문이다.
제안 방법
- 341개의 SNP들을 대상으로 수축기 혈압과 이완기 혈압에 대 해서도 상관 분석을 시행하였다. 선형 회귀 분석을 하였으며 역 시 연령, 성별 및 지역을 공변수로 처리하였다.
- 본 연구에서는 KARE 유전형 자료를 기반으로 SNP (Single nucleotide polymorphism)을 선별하였다. DNA 시료는 연구 참여자의 말초혈액에서 분리 추출하였고, 유전형 판독을 위해서는 Affymetrix genome-wide human SNP array 5.0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 유전형 판독 정확도가 98% 이하이거나, 4% 이상의 높은 missing genotype call rate을 보이거나, 30% 초과의 heterozygosity 를 가지거나, 성별 불일치가 존재하는 대상자들은 제외되었다.
- 고혈압에서 통계적인 유의성을 보이는 MACROD2의 SNP들이 어떻게 유전자 혹은 단백질에 영향을 미칠 것인지를 Regulome DB (http://www.reguloumdb.org/index)와 HaploReg (http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/ haploreg_v3.php)에서 in silico 기능 분석을 해 보았다. 확인 결과 고혈압 상태와 혈압 수치에서 공통적으로 유의하게 나타난 두 개의 SNP (rs16996211, rs6034240) 중에서 rs16996211은 Regulome DB와 HaploReg에서 모두 motif 변화를 예측하고 있다.
- 그리고 수축기 혈압 및 이완기 혈압과 유전적 변이의 상관분석은 선형 회귀분석을 사용하였다. 그리고 이러한 회귀 분석의 시행에 있어서 나이, 지역, 성별을 공변수로 처리하여 분석하였다. 분석 값에 대한 유의수준은 0.
- 본 연구에서는 KARE 데이터를 이용하여 고혈압에 대해 로지스틱 회귀분석을 실시하였고, 앞선 연구에서는 다중 마커를 이용하여 고혈압과 관상동맥질환에 대해 분석하여 각각의 질병과 연관된 유전자를 밝혔다. 본 연구에서는 단일 마커를 이용하여 분석하였으며 앞선 연구에서 유의하게 나타났던 MACROD2의 rs200752와 rs200759 사이의 SNP는 UCSC Genome Browser on Human Mar.
- 본 연구 대상인 MACROD2는 매우 긴 전사체(2 Mb)를 지닌 유전자로 분석 대상 SNP들은 NCBI human genome build 36 를 기준으로 하여 20번 염색체에서 341개의 SNP들이 분석 대상에 해당하였다. 선별된 MACROD2의 341개 SNP을 대상으로 고혈압 환자군과 건강 대조군에 대한 로지스틱 회귀 분석에는 연령, 성별 및 지역을 공변수로 처리하였다. 유전 모델은 additive genetic model을 기반으로 하였다.
- 혈압 측정은 숙련된 간호사가 대상자의 팔 둘레에 적절한 크기의 커프를 사용하여 수은 혈압계(Baumanometer; W. A. Baum, Copiague, NY, USA)로 혈압을 측정하였다. 첫 번째 혈압 측정 전에 연구대상자는 5분 동안 휴식을 취하게 하였다.
대상 데이터
- 이러한 정보는 질병관리본부에서 경기도 안성 지역과 안산 지역 거주자들을 대상으로 한국인 역학 및 유전체 연구를 위한 코호트 연구이다. 40세에서 69세 사이의 10,038명을 모집하였으며, 이들 중에서 QC (Quality Control) 과정을 통해 분석 기준에 적합하지 않은 1,196명이 제외되어 8,842명(남성: 4,183명, 여성: 4,659명)이 분석에 가능한 연구 대상자였다. 본 연구에서는 고혈압에 대한 유전 변이와의 상관성 연구가 목적이기 때문에 8,842명의 대상자 중에서 고혈압 환자와 대조군을 선별하였는데 유전형에 따른 수축기 혈압과 이완기 혈압에 대한 선형 회기 분석에서는 고혈압 약을 복용하거나 혈압에 영향을 줄 수 있는 약물을 복용하고 있는 1,291명을 제외한 7,551명을 대상으로 하였다.
- 본 연구에서는 고혈압에 대한 유전 변이와의 상관성 연구가 목적이기 때문에 8,842명의 대상자 중에서 고혈압 환자와 대조군을 선별하였는데 유전형에 따른 수축기 혈압과 이완기 혈압에 대한 선형 회기 분석에서는 고혈압 약을 복용하거나 혈압에 영향을 줄 수 있는 약물을 복용하고 있는 1,291명을 제외한 7,551명을 대상으로 하였다. 고혈압 환자군과 건강 대조군 사이의 유전형 빈도 차이 에 대한 로지스틱 회귀 분석을 위해서는 수축기 혈압이 140mmHg 이상이거나 이완기 혈압이 90 mmHg 이상인 사람들과 여기에 고혈압 치료를 받고 있는 환자 961명을 고혈압 환자군에 포함하여 총 1,968명을 선정하였고, 건강 대조군(N=4,452) 에는 수축기 혈압이 120 mmHg 미만이면서 동시에 이완기 혈압이 80 mmHg미만을 만족하는 사람으로 정의하였다. 고혈압 환자군과 건강 대조군의 평균 나이는 각각 49.
- 본 연구 대상인 MACROD2는 매우 긴 전사체(2 Mb)를 지닌 유전자로 분석 대상 SNP들은 NCBI human genome build 36 를 기준으로 하여 20번 염색체에서 341개의 SNP들이 분석 대상에 해당하였다. 선별된 MACROD2의 341개 SNP을 대상으로 고혈압 환자군과 건강 대조군에 대한 로지스틱 회귀 분석에는 연령, 성별 및 지역을 공변수로 처리하였다.
- 44세로 통계적으로 유의하게 차이가 있었다. 본 연구 에 활용한 유전 정보는 질병관리본부 국립보건연구원(KNIH, National Institutes of Health)과 호서대학교에서 연구윤리 승인을 받은 후 분석을 수행하였다(1041231-170822-BR062-01).
- 본 연구를 위한 한국인 연구대상자는 한국인 유전체 역학 조사 사업(Korean genome and epidemiology, KoGES)의 일환인 Korean association resource (KARE)를 기반으로 하였다 [16]. 본 연구에 사용한 유전 정보와 역학 정보는 질병관리본부 인체자원은행에서 분양을 받아 사용하였다(2017-046). 이러한 정보는 질병관리본부에서 경기도 안성 지역과 안산 지역 거주자들을 대상으로 한국인 역학 및 유전체 연구를 위한 코호트 연구이다.
- 유전형 판독 정확도가 98% 이하이거나, 4% 이상의 높은 missing genotype call rate을 보이거나, 30% 초과의 heterozygosity 를 가지거나, 성별 불일치가 존재하는 대상자들은 제외되었다. 본 연구에서 분석한 MACROD2 유전자 영역은 전사체(2 Mb) 양 말단에서 5 kb씩 확장하여 이 범위에 존재하는 341개 SNP들을 선택하였다. 이 SNP들의 염색체 상의 위치는 UCSC (University of colombo school of computing) Genome browser on human Mar.
- 본 연구에서는 KARE 유전형 자료를 기반으로 SNP (Single nucleotide polymorphism)을 선별하였다. DNA 시료는 연구 참여자의 말초혈액에서 분리 추출하였고, 유전형 판독을 위해서는 Affymetrix genome-wide human SNP array 5.
- 40세에서 69세 사이의 10,038명을 모집하였으며, 이들 중에서 QC (Quality Control) 과정을 통해 분석 기준에 적합하지 않은 1,196명이 제외되어 8,842명(남성: 4,183명, 여성: 4,659명)이 분석에 가능한 연구 대상자였다. 본 연구에서는 고혈압에 대한 유전 변이와의 상관성 연구가 목적이기 때문에 8,842명의 대상자 중에서 고혈압 환자와 대조군을 선별하였는데 유전형에 따른 수축기 혈압과 이완기 혈압에 대한 선형 회기 분석에서는 고혈압 약을 복용하거나 혈압에 영향을 줄 수 있는 약물을 복용하고 있는 1,291명을 제외한 7,551명을 대상으로 하였다. 고혈압 환자군과 건강 대조군 사이의 유전형 빈도 차이 에 대한 로지스틱 회귀 분석을 위해서는 수축기 혈압이 140mmHg 이상이거나 이완기 혈압이 90 mmHg 이상인 사람들과 여기에 고혈압 치료를 받고 있는 환자 961명을 고혈압 환자군에 포함하여 총 1,968명을 선정하였고, 건강 대조군(N=4,452) 에는 수축기 혈압이 120 mmHg 미만이면서 동시에 이완기 혈압이 80 mmHg미만을 만족하는 사람으로 정의하였다.
데이터처리
- ***Significant differences in characteristics between the normotensive and hypertensive subjects were determined by the two-tailed Student’s t-test.
- Chicago, IL, USA)을 사용하 였다. 고혈압 환자군과 건강 대조군에 대한 유전적 변이의 상관 성 분석은 로지스틱 회귀 분석을 사용하였으며 additive genetic model을 기반으로 하였다. 그리고 수축기 혈압 및 이완기 혈압과 유전적 변이의 상관분석은 선형 회귀분석을 사용하였다.
- 고혈압 환자군과 건강 대조군에 대한 유전적 변이의 상관 성 분석은 로지스틱 회귀 분석을 사용하였으며 additive genetic model을 기반으로 하였다. 그리고 수축기 혈압 및 이완기 혈압과 유전적 변이의 상관분석은 선형 회귀분석을 사용하였다. 그리고 이러한 회귀 분석의 시행에 있어서 나이, 지역, 성별을 공변수로 처리하여 분석하였다.
- 첫 번째 혈압 측정 전에 연구대상자는 5분 동안 휴식을 취하게 하였다. 그리고 연구대상자는 누운 자세를 유지한 상태에서 5분 간격 이상의 시간 차이를 두고 3번 측정하여 평균값을 분석에 사용하였다.
- 341개의 SNP들을 대상으로 수축기 혈압과 이완기 혈압에 대 해서도 상관 분석을 시행하였다. 선형 회귀 분석을 하였으며 역 시 연령, 성별 및 지역을 공변수로 처리하였다. 유전 모델은 additive genetic model을 기반으로 하였다.
이론/모형
- 05 이하를 기준으로 하였다. Regional association plots을 확인하 기 위하여 웹 기반 프로그램인 Locuszoom version 1.1 (http://csg.sph.umich.edu/locuszoom)을 사용하였다[17].
- 본 연구를 위한 한국인 연구대상자는 한국인 유전체 역학 조사 사업(Korean genome and epidemiology, KoGES)의 일환인 Korean association resource (KARE)를 기반으로 하였다 [16]. 본 연구에 사용한 유전 정보와 역학 정보는 질병관리본부 인체자원은행에서 분양을 받아 사용하였다(2017-046).
- 선별된 MACROD2의 341개 SNP을 대상으로 고혈압 환자군과 건강 대조군에 대한 로지스틱 회귀 분석에는 연령, 성별 및 지역을 공변수로 처리하였다. 유전 모델은 additive genetic model을 기반으로 하였다. 그 결과 16개 SNP 에서 통계적으로 유의한 상관관계(P＜0.
- 본 연구에서 분석한 MACROD2 유전자 영역은 전사체(2 Mb) 양 말단에서 5 kb씩 확장하여 이 범위에 존재하는 341개 SNP들을 선택하였다. 이 SNP들의 염색체 상의 위치는 UCSC (University of colombo school of computing) Genome browser on human Mar. 2006 (NCBI human genome build 36)를 기준으로 하였다.
성능/효과
- 95)인 것으로 나타났다(Figure 1). Minor allele인 T 염기의 빈도를 살펴보면 고혈압 환자군에서는 16.1%이고, 건강 대조군에서는 18.7%로 약 2.6%의 빈도 차이가 있어서 T염기를 보유할 경우에 고혈압 상태에 대한 상대적 위험도가 낮아지는 방향으로 유의한 상관 관계가 있는 것을 알 수 있었다. 또한 rs16996211은 수축기 혈압과 이완기 혈압에서도 통계적 유의 수준을 보여주고 있는데, minor allele를 보유할 수록 점진적으로 혈압 수치가 낮아지는 경향을 보여주고 있다.
- 고혈압 환자(n=1,968)의 평균 나이, 평균 수축기 혈압(Systolic blood pressure; SBP), 평균 이완기 혈압(Diastolic blood pressure; DBP)은 각각 56.75±8.44세, 139.42±17.27 mmHg, 88.97±10.90 mmHg 으로 나타났다(Table 1).
- 유전 모델은 additive genetic model을 기반으로 하였다. 그 결과 16개 SNP 에서 통계적으로 유의한 상관관계(P＜0.05)를 확인할 수 있었다(Table 2). 이 중 가장 높은 유의 수준(P=3.
- MACROD2 유전자에서 SNP의 고혈압 환자군과 건강 대조 군 간의 MAF 차이에 따른 통계적 유의성을 분석하여 유전적 변이에 따른 고혈압 상태와의 상관성에 대하여 알아보고자 하였다. 그 결과 16개의 SNP에서 고혈압 상태와 통계적으로 의미 있는 유의성이 확인되었다. 이들 고혈압 상태와 관련 있는 SNP 들 중에서 혈압에서도 동일한 방향성의 유의한 관계를 보이는 SNP는 2개였다.
- 유전 모델은 additive genetic model을 기반으로 하였다. 그 결과 수축기 혈압(SBP)에서는 17개의 SNP들이, 이완기 혈압(DBP)에서는 23개의 SNP들이 각각 통계적으로 유의한 상관 관계를 보여주고 있었다.
- 앞선 연구에서도 마커로 사용된 rs200752와 rs200759 가 고혈압과 관련이 있다고 밝힌 것이 아니고 rs200752와 rs200759 사이의 SNP가 고혈압과 상관성이 있다고 밝혔으므로, 이는 인종과는 상관이 없다는 것을 알 수 있다. 그러나 본 연구에서 혈압과 관련된 MACROD2의 다른 SNP들을 찾을 수 있었으며 이를 바탕으로 고혈압과 MACROD2의 연관성을 밝힐 수 있었다.
- 6×10‒3). 그리고, 11 개의 SNP (rs7268327, rs595247, rs424240, rs383329, rs367595, rs65567, rs17694839, rs6110694, rs16996211, rs6043560, rs6135644)들은 수축기 혈압(SBP)과 이완기 혈압 (DBP) 모두에서 통계적 유의성을 보여주고 있으며, 이들 SNP 들이 minor allele를 보유하고 있을 때 보여주는 혈압 수치의 방향성 또한 수축기 혈압과 이완기 혈압에서 모두에서 일치하고 있다.
- 확인 결과 고혈압 상태와 혈압 수치에서 공통적으로 유의하게 나타난 두 개의 SNP (rs16996211, rs6034240) 중에서 rs16996211은 Regulome DB와 HaploReg에서 모두 motif 변화를 예측하고 있다. 따라서, rs16996211의 유전형에 따라 MACROD2 유전자 발현에 영향을 미칠 가능성을 보여주고 있었다. 또한 rs6034240은 DNase peak 차이가 있다는 것을 확인 할 수 있었고 HaploReg에서는 전사 인자인 Hoxb9와 Pou5f1 의 결합 motif로 작용하기 때문에 이 역시 MACROD2 유전자 발현에 영향을 줄 가능성을 보여주고 있다(Table 3).
- 또한 MACROD2 결실이 대장암의 발병에 영향을 준다는 것이 밝혀졌다. 염색체 불안정성은 암의 주요 특징으로, MACROD2의 haplo insufficiency는 이를 증가시켜 Poly ADP-ribose] polymerase 1 (PARP1) 활성의 억제를 일으켜 DNA 복구를 손상시켜 장의 종양 성장을 촉진한다[21].
- 6%의 빈도 차이가 있어서 T염기를 보유할 경우에 고혈압 상태에 대한 상대적 위험도가 낮아지는 방향으로 유의한 상관 관계가 있는 것을 알 수 있었다. 또한 rs16996211은 수축기 혈압과 이완기 혈압에서도 통계적 유의 수준을 보여주고 있는데, minor allele를 보유할 수록 점진적으로 혈압 수치가 낮아지는 경향을 보여주고 있다. 이러한 결과는 minor allele를 가질수록 고혈압에 대한 상대적 위험도가 낮아 지는 환자-대조군 분석 결과와 일치하고 있었다.
- 따라서, rs16996211의 유전형에 따라 MACROD2 유전자 발현에 영향을 미칠 가능성을 보여주고 있었다. 또한 rs6034240은 DNase peak 차이가 있다는 것을 확인 할 수 있었고 HaploReg에서는 전사 인자인 Hoxb9와 Pou5f1 의 결합 motif로 작용하기 때문에 이 역시 MACROD2 유전자 발현에 영향을 줄 가능성을 보여주고 있다(Table 3).
- 그동안 많은 연구에서 고혈압의 상태와 관련하여 환경적 요인과 유전적 요인에 대한 연구들이 진행되어 왔다[5, 22-25]. 본 연구는 고혈압에 대해 한국인의 유전체 역학 자료를 기반으로 분석했을 때에도 MACROD2의 유전적 변이들이 혈압 및 고혈압 상태와의 상관관계가 성립되는지를 확인하였으며, 이러한 결과를 통해 MACROD2 유전자는 인종이나 인구집단에 상관없이 공통적으로 혈압에 영향을 미치는 유전자임을 유추할 수 있었다.
- 본 연구에서는 KARE 데이터를 이용하여 고혈압에 대해 로지스틱 회귀분석을 실시하였고, 앞선 연구에서는 다중 마커를 이용하여 고혈압과 관상동맥질환에 대해 분석하여 각각의 질병과 연관된 유전자를 밝혔다. 본 연구에서는 단일 마커를 이용하여 분석하였으며 앞선 연구에서 유의하게 나타났던 MACROD2의 rs200752와 rs200759 사이의 SNP는 UCSC Genome Browser on Human Mar. 2006 (NCBI human genome build 36) 기준으로 했을 때 본 연구의 분석 대상 SNP에는 존재하지 않아 확인할 수 없었다. 또한 앞선 연구에서 다중 마커로 사용했 던 rs200752와 rs200759는 고혈압과의 상관성을 나타내지 않았다.
- 이 중 가장 높은 유의 수준(P=3.1×10‒3 )을 보여주는 SNP은 rs16996211으로 상대적 위험도는 0.85 (95% 신뢰구 간: 0.76∼0.95)인 것으로 나타났다(Figure 1).
- 90 mmHg 으로 나타났다(Table 1). 정상 혈압군과 고혈압 환자의 Student t-검정에서 SBP, DBP의 유의 한 통계적 차이가 있었는데, 예상하듯이 고혈압 환자군에서 모두 높은 수치를 나타냈다(Table 1).
- php)에서 in silico 기능 분석을 해 보았다. 확인 결과 고혈압 상태와 혈압 수치에서 공통적으로 유의하게 나타난 두 개의 SNP (rs16996211, rs6034240) 중에서 rs16996211은 Regulome DB와 HaploReg에서 모두 motif 변화를 예측하고 있다. 따라서, rs16996211의 유전형에 따라 MACROD2 유전자 발현에 영향을 미칠 가능성을 보여주고 있었다.
후속연구
- 그러나 앞서 고혈압과 MACROD2와의 관계를 분석한 연구 에서[11], Vascular adhesion protein-1 (VAP-1)이 성숙한 지방 세포에서 고도로 발현되어 순환계로 방출되는 막 결합 아민 산화 효소로 이는 당뇨병, 고혈압 등 여러 병리학적 과정에 매우 연관되어 있으며 MACROD2가 지방 생성 유전자 발현과 인간 지방 세포에서의 VAP-1의 발현을 조절한다는 것을 밝혔다. 또 한 MACROD2의 exon 결실이 비만과 연관이 있다는 연구[15]를 통해 MACROD2가 비만과 밀접한 관계가 있다는 것을 알 수 있으며 비만은 고혈압과의 직접적인 관련이 있는 만큼 이와 관 련하여 분석한다면 더욱 확실한 연구가 될 것이다.
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