[논문]유방암 동물모델에서의 저강도 집속초음파를 이용한 마이크로버블 및 마이크로버블-나노물질 복합체 기반 항암제 전달 효율 검증

백희규; 하신우; 허형규; 정병진; 한문; 문형원; 김상균; 이학종; 박주영

doi:10.9718/jber.2019.40.2.39

유방암 동물모델에서의 저강도 집속초음파를 이용한 마이크로버블 및 마이크로버블-나노물질 복합체 기반 항암제 전달 효율 검증
Effects of Anticancer Drug Delivery based on Microbubble and Microbubble-Nanoparticle Complex using Low-Intensity Focused Ultrasound in Breast Cancer Animal Model 원문보기

Journal of biomedical engineering research : the official journal of the Korean Society of Medical & Biological Engineering, v.40 no.2, 2019년, pp.39 - 47

백희규 (대구경북첨단의료산업진흥재단 첨단의료기기개발지원센터) , 하신우 ((주)아이엠지티) , 허형규 (대구경북첨단의료산업진흥재단 첨단의료기기개발지원센터) , 정병진 (대구경북첨단의료산업진흥재단 첨단의료기기개발지원센터) , 한문 (대구경북첨단의료산업진흥재단 첨단의료기기개발지원센터) , 문형원 (서울대학교 의과대학 영상의학교실) , 김상균 (대구경북첨단의료산업진흥재단 실험동물센터) , 이학종 ((주)아이엠지티) , 박주영 (대구경북첨단의료산업진흥재단 첨단의료기기개발지원센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Ultrasound sonication along with microbubble (MB) could enhance drug delivery to promote the absorption of anticancer drugs into cancers in a noninvasive and targeted manners. In this study, we verify the acute drug delivery enhancement (within an hour) of two representative focused ultrasound driven drug delivery enhancement methods (MB and Doxorubicin-coated Nanoparticle complex (MB-NP) based). Experiments were conducted using in vivo mouse model with MDA-MB-231 breast cancer cell line. Ultrasound generated by single-element 1 MHz focused ultrasound transducer was delivered in pulsed sonication consisted of 0.125 msec bursts at a pulse repetition frequency of 2 Hz for 20 seconds without a significant increase in local temperature (less than $0.1^{\circ}C$) or hemorrhage. Doxorubicin concentrations in tumors were improved by 1.97 times in the case of MB-NP, and 1.98 times by using Doxorubicin and MB separately. These results indicate anticancer drug delivery based on MB and MB-NP can significantly improve the effect of anticancer drugs delivered to tumors in a short time period by using low-intensity focused ultrasound.

주제어

표/그림 (9)

그림 그림 1. 동물실험을 위한 실험 환경. (a) 전임상 집속초음파 시스템 구성도, (b) 집속 초음파 조사 조건 설정, (c) 동물실험에 사용한 집속초음파 트랜스듀서의 음장분포. Fig. 1. Experimental setup for animal experiments. (a) Schematic diagram of preclinical focused ultrasound system, (b) parameter settings of focused ultrasound sonication, (c) acoustic pressure distribution of focused ultrasound using animal experiments.
표 표 1. 알부민 나노 입자 및 마이크로버블 특성 분석 Table 1. Characteristics of albumin nanoparticle and microbubble
그림 그림 2. 마이크로버블 및 Doxorubicin이 코팅된 나노입자 복합체 구조. Fig. 2. Structure of microbubble and Doxorubicin-coated Nanoparticles complex.
그림 그림 3. 유방암 동물모델. (a) IVIS 영상을 이용한 유방암 성장 관찰, (b) 유방암 동물모델에서의 초음파 영상. Fig. 3. Breast cancer animal model. (a) Observation of breast cancer growth using IVIS imaging, (b) ultrasound image of breast cancer in animal model.
그림 그림 4. 집속초음파 이용 동물실험 절차. (a) Doxorubicin 및 마이크로버블 사용, (b) 마이크로버블-나노물질 복합체 사용. Fig. 4. Animal experimental procedures using Focused ultrasound. (a) The use of Doxorubicin and Microbubbles (Definity), (b) the use of Microbubble-Nanoparticle complex.
그림 그림 5. 집속초음파 조사에 따른 초점 영역에서의 온도 측정. (a) 온도측정 실험 환경, (b) 초음파 조사에 따른 기준 온도 대비 온도 변화량. Fig. 5. Temperature measurement in the focal area by focused ultrasound sonication. (a) Experimental setup for temperature measurement, (b) temperature variations compared with reference temperature according to ultrasound sonication.
그림 그림 6. H&E 조직학적 분석 결과. (a) 초음파를 조사하지 않은 유방암 조직, (b) 초음파를 조사한 유방암 조직. Fig. 6. The results of H&E histological analysis. (a) Breast cancer tissue without ultrasound sonication, (b) breast cancer tissue with ultrasound sonication.
그림 그림 8. 마이크로버블-나노물질 복합체 기반 항암제 농도(p-value = 0.017). Fig. 8. Anticancer concentration based on Microbubble-Nanoparticle complex, (p-value = 0.017).
그림 그림 7. Doxorubicin 및 마이크로버블(Definity) 기반 항암제 농도 (p-value = 0.072). Fig. 7. Anticancer concentration based on Doxorubicin and Microbubbles (Definity), (p-value = 0.072).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 저강도 집속초음파 기반 효율적인 항암제 전달 검증을 위해 MDA-MB-231 유방암 동물 모델에서 MB 기반 및 MB-NP 기반으로 집속초음파 조사에 따른 짧은 시간 내에 약물전달 효과에 대한 실험적 검증을 수행하였다.
본 연구에서는 저강도 집속초음파를 이용하여 암조직에서의 항암제 전달 효과 검증을 위해 항암치료요법을 필요로 하는 대표적인 고형암 중 하나인 유방암 세포를 기반으로 암질환 동물 모델을 제작하였다. 그리고 항암제로 널리 사용되는 Doxorubicin을 기반으로 상용화된 MB와 마이크로버블-나노입자 복합체(Microbubble-Nanoparticle Complex; MB-NP)를 이용한 두 가지 약물전달 기법에서 초음파 조사의 효과를 검증했다.

가설 설정

집속초음파 이용 동물실험 절차. (a) Doxorubicin 및 마이크로버블 사용, (b) 마이크로버블-나노물질 복합체 사용.

제안 방법

복합체 형성을 위한 마이크로버블은 phospholipid thin film hydration 기법[21]을 통해 합성하였다. 1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphocholine (DSPC, NOF, Japan), 1,2-distearoly-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[succinly(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2k-NHS, NOF, Japan)을 chloroform에 분자비 9:1로 용해시키고, 이후 얇은 인지질 박막 형성을 위해 chloroform를 증발시켰다. 0.
꼬리 정맥 혈관으로 syringe pump를 이용해 Doxorubicin 4 mg/kg의 MB-NP을 주입하고 20초 후 누드마우스의 오른쪽 암조직에 사전 설정된 방법으로 초음파를 조사하였다. 1시간 후 대조군, 실험군에 해당하는 유방암 조직을 적출하고 MB 및 Doxorubicin 을 사용한 실험과 동일한 방법으로 암조직 샘플을 균질화 및 원심분리 후 excitation 480 nm, emission 590 nm 대역에서의 측정된 Doxorubicin 형광 농도를 standard curve 기반으로 정량화하여 분석하였다.
초음파 조사 및 약물 주입 1시간 후 대조군, 실험군에 해당하는 누드마우스의 유방암 조직을 적출하고 glass beads (GB05, Next Advance, NY, USA) 및 tissue homogenizer (Bullet Blender, Next Advance, NY, USA)를 이용해 균질화한 암조직 샘플을 15분 동안 15,000 rpm에서 원심 분리하여 상등액을 채취하고 microplate reader (Infinite 200 pro, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 480 nm, emission 590 nm 대역에서의 Doxorubicin 형광 농도를 측정하였다[23]. Doxorubicin standard curve를 기반으로 측정된 형광 농도를 정량화하여 암조직에서의 Doxorubicin 농도를 분석하였다.
Doxorubicin 기반으로 제작한 MB-NP 복합체를 이용하여 동물실험을 수행하였다(그림 4(b)). 꼬리 정맥 혈관으로 syringe pump를 이용해 Doxorubicin 4 mg/kg의 MB-NP을 주입하고 20초 후 누드마우스의 오른쪽 암조직에 사전 설정된 방법으로 초음파를 조사하였다.
MB-NP의 특성 분석을 위해 Dynamic Light Scattering (Malvern, Nano ZS90, Worcestershire, UK)을 이용하여 크기 및 제타 포센셜을 측정하였다(표 1). Doxorubicin 포착 효율은 98.6% 이었으며, 액체 크로마토그래피(Agilent Technologies, 1260 Infinity II system, CA, USA)로 분석하였다.
Doxorubicin이 코팅된 알부민 나노 입자 합성[20]을 위해 Human serum albumin (Sigma-Aldrich, MO, USA) 1 g을 탈이온수 34 ml에 용해시킨 후 1M NaOH (Daejung, Korea) 20 μl를 첨가하고 에탄올 무수물(Daejung, Korea) 70 ml를 5분간 천천히 첨가하였다.
Luciferase가 발현하는 인체유래 유방암세포주(Bioware® Brite cell line MDA-MB-231 Fluc, Perkin Elmer, MA, USA)를 이용하여 유방암 동물모델을 제작하였다.
MB-NP의 특성 분석을 위해 Dynamic Light Scattering (Malvern, Nano ZS90, Worcestershire, UK)을 이용하여 크기 및 제타 포센셜을 측정하였다(표 1). Doxorubicin 포착 효율은 98.
초음파 조사를 위해 중심 주파수 1 MHz, 직경 64 mm인 single-element focused ultrasound transducer (H-194, Sonic, concept, WA, USA)를 사용하였다. Transducer 중앙에 있는 직경 42.4 mm의 개구부에 병변 부위를 관찰할 수 있는 phase-array ultrasound imaging probe (SP4-12, Alpinion Medical System, Korea)를 함께 사용함으로써 초음파를 이용한 진단 및 치료를 동시에 수행하였다. Transducer의 앞 단은 water membrane으로 감싸여 있으며, 초음파 전달 매질인 탈기수의 공급 및 정제를 위한 정화장치와 연결되어 있다.
온도 측정을 위해 인체 연부조직 유사 팬텀[24]을 제작하였다. Transducer를 팬텀 표면에 밀착시키고, 광섬유온도측정장치(m600, Luxtron, CA, USA) 온도측정 프로브 3개를 초점 영역에 고정한 후 20초 동안 초음파를 조사하였고, 1개는 transducer 의 초점영역에서 충분히 멀리 있는 지역에 고정하여 기준 온도로 사용하였다(그림 5(a)).
Transducer의 초점 영역에서의 음장분포는 hydrophone (HGL-0400, ONDA, Sunnyvale, CA, USA) 및 초음파음장분포측정시스템(AIMS III, ONDA, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 확인하였다(그림 1
Transducer의 축 방향이 아래쪽을 향하도록 고정하고 축 평면 기준 직경 5 mm 영역 내 서로 다른 위치에서 초음파를 7번 조사하였다(그림 1
본 연구에서는 저강도 집속초음파를 이용하여 암조직에서의 항암제 전달 효과 검증을 위해 항암치료요법을 필요로 하는 대표적인 고형암 중 하나인 유방암 세포를 기반으로 암질환 동물 모델을 제작하였다. 그리고 항암제로 널리 사용되는 Doxorubicin을 기반으로 상용화된 MB와 마이크로버블-나노입자 복합체(Microbubble-Nanoparticle Complex; MB-NP)를 이용한 두 가지 약물전달 기법에서 초음파 조사의 효과를 검증했다. 특히 기존 연구와 다르게 각각의 방법에서 초음파 조사 후 짧은 시간 내에(1시간 이내) 암 조직에 전달되는 Doxorubicin 농도를 분석함으로써 초음파 조사에 따른 약물전달 효과 향상 여부를 분석하였다.
Doxorubicin 기반으로 제작한 MB-NP 복합체를 이용하여 동물실험을 수행하였다(그림 4(b)). 꼬리 정맥 혈관으로 syringe pump를 이용해 Doxorubicin 4 mg/kg의 MB-NP을 주입하고 20초 후 누드마우스의 오른쪽 암조직에 사전 설정된 방법으로 초음파를 조사하였다. 1시간 후 대조군, 실험군에 해당하는 유방암 조직을 적출하고 MB 및 Doxorubicin 을 사용한 실험과 동일한 방법으로 암조직 샘플을 균질화 및 원심분리 후 excitation 480 nm, emission 590 nm 대역에서의 측정된 Doxorubicin 형광 농도를 standard curve 기반으로 정량화하여 분석하였다.
누드마우스의 근육에 zoletil 25 mg/kg (Virbac, Carros, France), rumpon 7 mg/kg (Bayer, Levekusen, Germany) 및 생리식염수 혼합액을 주입하여 마취하고 좌, 우 유방암 조직 중 한쪽에만 집속초음파를 조사하였다. 초음파 조사 4시간 후 유방암 조직들을 모두 적출하여 각각에 대한 파라핀 블록을 제작하였다.
누드마우스의 근육에 zoletil 25 mg/kg, rumpon 7 mg/kg 및 생리식염수 혼합액을 주입하여 마취하였다. 탈기수를 충분히 공급하여 water membrane을 transducer의 초점 거리만큼 팽창시키고 유방암 조직에 초음파가 효과적으로 전달될 수 있도록 누드마우스를 membrane 하단에 밀착시켜 고정하였다.
상용화된 MB (Definity, Lantheus Medical Imaging, MA, USA) 및 Doxorubicin를 이용한 동물실험을 수행하였다(그림 4(a)). 누드마우스의 꼬리 정맥 혈관으로 syringe pump (Pump 11, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 이용해 생리 식염수로 1:50으로 희석된 MB를 주입하고 20초 후 사전 설정된 방법에 의거하여 초음파를 조사한 후 Doxorubicin 5.67 mg/kg[22]을 주입하였다. 초음파 조사 및 약물 주입 1시간 후 대조군, 실험군에 해당하는 누드마우스의 유방암 조직을 적출하고 glass beads (GB05, Next Advance, NY, USA) 및 tissue homogenizer (Bullet Blender, Next Advance, NY, USA)를 이용해 균질화한 암조직 샘플을 15분 동안 15,000 rpm에서 원심 분리하여 상등액을 채취하고 microplate reader (Infinite 200 pro, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 480 nm, emission 590 nm 대역에서의 Doxorubicin 형광 농도를 측정하였다[23].
탈기수를 충분히 공급하여 water membrane을 transducer의 초점 거리만큼 팽창시키고 유방암 조직에 초음파가 효과적으로 전달될 수 있도록 누드마우스를 membrane 하단에 밀착시켜 고정하였다. 동일 실험환경에서 누드마우스의 왼쪽 유방 암조직은 초음파를 조사하지 않는 대조군(control group), 오른쪽 암조직은 초음파를 조사하는 실험군(FUS sonication group)으로 설정하고 초음파 조사 유무에 따른 약물전달 효과를 비교하였다.
초음파를 조사 한 후(그림 6(b)) 에도 암 조직 내 혈관 및 주변 조직에서 적혈구가 관찰되지 않았으며[26], 이는 저강도 초음파가 암조직에 혈관의 파열 등에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 예측 할 수 있다. 본 실험에서는 초음파 조사 후 짧은 시간 내에서의 변화에 초점을 맞춰 분석하였기 때문에, 초음파 조사 후 세포의 형태나 분포의 변화 및 면역세포의 반응에 대한 분석은 이루어 지지 않았다. 장기간 초음파 노출에 따른 정상세포의 생존율 등에 대한 분석은 추가적인 실험이 필요할 것으로 판단된다.
비가열적 효과 확인을 위해 사전 설정된 조건 기반으로 20초간 초음파를 조사하고 초점영역에서의 온도변화를 관찰하였다(그림 5(b)). 초점 영역에 위치한 온도측정 프로브 3개의 초음파 조사에 따른 기준 온도 대비 평균 온도 변화량은 0.
상용화된 MB (Definity, Lantheus Medical Imaging, MA, USA) 및 Doxorubicin를 이용한 동물실험을 수행하였다(그림 4(a)). 누드마우스의 꼬리 정맥 혈관으로 syringe pump (Pump 11, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)를 이용해 생리 식염수로 1:50으로 희석된 MB를 주입하고 20초 후 사전 설정된 방법에 의거하여 초음파를 조사한 후 Doxorubicin 5.
Vial의 상단 공간은 sulfur hexafluoride gas (SF6, Dong-A Specialty Gases & Dong-A Scientific, Korea)로 채웠다. 수화된 리포좀 전구체를 마이크로버블로 변환하기 위해 Vialmix (Lantheus Medical Imaging, MA, USA)를 이용해 45초간 흔들어주었다. 최종적으로 Doxorubicin이 코팅된 알부민 나노 입자 200 μl을 표면이 개질된 마이크로버블 용액에 첨가하고 30분에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 그림 2와 같은 MB-NP를 제작하였다.
초음파 조사 면 방향으로 4 μm 두께로 절개 한 유방암 조직 샘플을 H&E 기법(Hematoxylin and eosin staining)으로 염색하여 초음파 조사 유무에 따른 조직학적 분석을 수행하였다. 염색된 암조직 샘플은 광학 현미경(Eclipse Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 초음파 조사에 따른 조직 손상 여부를 관찰하였다.
집속초음파 조사에 따른 열적 효과 발생여부 확인을 위해 초점 영역에서의 온도 측정을 수행하였다. 온도 측정을 위해 인체 연부조직 유사 팬텀[24]을 제작하였다.
누드마우스의 근육에 zoletil 25 mg/kg (Virbac, Carros, France), rumpon 7 mg/kg (Bayer, Levekusen, Germany) 및 생리식염수 혼합액을 주입하여 마취하고 좌, 우 유방암 조직 중 한쪽에만 집속초음파를 조사하였다. 초음파 조사 4시간 후 유방암 조직들을 모두 적출하여 각각에 대한 파라핀 블록을 제작하였다. 초음파 조사 면 방향으로 4 μm 두께로 절개 한 유방암 조직 샘플을 H&E 기법(Hematoxylin and eosin staining)으로 염색하여 초음파 조사 유무에 따른 조직학적 분석을 수행하였다.
초음파 조사 면 방향으로 4 μm 두께로 절개 한 유방암 조직 샘플을 H&E 기법(Hematoxylin and eosin staining)으로 염색하여 초음파 조사 유무에 따른 조직학적 분석을 수행하였다.
67 mg/kg[22]을 주입하였다. 초음파 조사 및 약물 주입 1시간 후 대조군, 실험군에 해당하는 누드마우스의 유방암 조직을 적출하고 glass beads (GB05, Next Advance, NY, USA) 및 tissue homogenizer (Bullet Blender, Next Advance, NY, USA)를 이용해 균질화한 암조직 샘플을 15분 동안 15,000 rpm에서 원심 분리하여 상등액을 채취하고 microplate reader (Infinite 200 pro, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 excitation 480 nm, emission 590 nm 대역에서의 Doxorubicin 형광 농도를 측정하였다[23]. Doxorubicin standard curve를 기반으로 측정된 형광 농도를 정량화하여 암조직에서의 Doxorubicin 농도를 분석하였다.
초음파 조사에 따른 직접적인 약물 전달 효과 외에 열적 효과 발생 유무 및 조직학적 변화를 검토하기 위해 팬텀 및 실제 조직 샘플에 대한 H&E 분석을 수행하였다.
최종적으로 Doxorubicin이 코팅된 알부민 나노 입자 200 μl을 표면이 개질된 마이크로버블 용액에 첨가하고 30분에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 그림 2와 같은 MB-NP를 제작하였다.
그리고 항암제로 널리 사용되는 Doxorubicin을 기반으로 상용화된 MB와 마이크로버블-나노입자 복합체(Microbubble-Nanoparticle Complex; MB-NP)를 이용한 두 가지 약물전달 기법에서 초음파 조사의 효과를 검증했다. 특히 기존 연구와 다르게 각각의 방법에서 초음파 조사 후 짧은 시간 내에(1시간 이내) 암 조직에 전달되는 Doxorubicin 농도를 분석함으로써 초음파 조사에 따른 약물전달 효과 향상 여부를 분석하였다.
Transducer의 축 방향이 아래쪽을 향하도록 고정하고 축 평면 기준 직경 5 mm 영역 내 서로 다른 위치에서 초음파를 7번 조사하였다(그림 1(b)). 한 지점에서 20 초간 초점 영역에서 1.65 MPa 정도의 최대 음압이 발생되도록 출력을 인가하였으며[15], 펄스 폭 0.125 msec, 반복 주파수 2 Hz를 사용하는 초음파 조사 방법을 설정하였다. Transducer의 초점 영역에서의 음장분포는 hydrophone (HGL-0400, ONDA, Sunnyvale, CA, USA) 및 초음파음장분포측정시스템(AIMS III, ONDA, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 확인하였다(그림 1(c)).

대상 데이터

MDA-MB-231 세포주는 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum (Hyclone, Logan, UT, USA)가 첨가된 RPMI-1640에서 유지되었다. 6주령의 수컷 누드 마우스 (BALB/c nude mice) 10마리를(조직학적 분석 n=2, MB 기반 실험 n=4, MB-NP 기반 실험 n=4 사용) 일주일 동안 적응시켰다. 암세포 주입 전, 유방암 세포주를 phosphatebuffered saline으로 2번 세척하고 0.
Vial의 상단 공간은 sulfur hexafluoride gas (SF6, Dong-A Specialty Gases & Dong-A Scientific, Korea)로 채웠다.
집속초음파 조사에 따른 열적 효과 발생여부 확인을 위해 초점 영역에서의 온도 측정을 수행하였다. 온도 측정을 위해 인체 연부조직 유사 팬텀[24]을 제작하였다. Transducer를 팬텀 표면에 밀착시키고, 광섬유온도측정장치(m600, Luxtron, CA, USA) 온도측정 프로브 3개를 초점 영역에 고정한 후 20초 동안 초음파를 조사하였고, 1개는 transducer 의 초점영역에서 충분히 멀리 있는 지역에 고정하여 기준 온도로 사용하였다(그림 5(a)).
본 연구에서는 소동물용 집속초음파시스템(VIFU-2000, Alpinion Medical System, Korea)을 이용하여 그림 1(a) 과 같은 실험 환경을 구성하였다. 초음파 조사를 위해 중심 주파수 1 MHz, 직경 64 mm인 single-element focused ultrasound transducer (H-194, Sonic, concept, WA, USA)를 사용하였다. Transducer 중앙에 있는 직경 42.

데이터처리

실험적으로 획득한 Doxorubicin 농도의 평균 및 표준편차를 산출하여 비교하였다. 독립표본 비모수 검정으로 초음파 조사 유무에 따른 차이를 통계학적으로 검증하였으며, 통계적 유의수준은 p＜0.05 로 설정하였다.
동물실험 결과에 대한 약물전달 효율성에 대한 통계적 유의성을 검증하기 위해 통계분석 소프트웨어(Statistical Package for the Social Sciences 21.0 for Windows;SPSS, Chicago, IL) 기반의 분석을 수행하였다. 실험적으로 획득한 Doxorubicin 농도의 평균 및 표준편차를 산출하여 비교하였다.
0 for Windows;SPSS, Chicago, IL) 기반의 분석을 수행하였다. 실험적으로 획득한 Doxorubicin 농도의 평균 및 표준편차를 산출하여 비교하였다. 독립표본 비모수 검정으로 초음파 조사 유무에 따른 차이를 통계학적으로 검증하였으며, 통계적 유의수준은 p＜0.

이론/모형

복합체 형성을 위한 마이크로버블은 phospholipid thin film hydration 기법[21]을 통해 합성하였다. 1,2-distearoylsn-glycero-3-phosphocholine (DSPC, NOF, Japan), 1,2-distearoly-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[succinly(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG2k-NHS, NOF, Japan)을 chloroform에 분자비 9:1로 용해시키고, 이후 얇은 인지질 박막 형성을 위해 chloroform를 증발시켰다.

성능/효과

MB-NP 기반의 초음파 조사에 따른 항암제 전달 분석 결과(그림 8, n=4) 대조군에서는 1287.51 ± 404.57 ng/g, 실험군에서는 2541.92 ± 648.11 ng/g 의 Doxorubicin 농도가 측정되었다.
또한, Lentacker 등[18]은 마이크로버블과 Dox-liposome 복합체 기반의 항암제 농도 변화 및 세포 생존율을 분석하여 초음파를 조사함에 따라 세포 사멸율이 3배 이상 향상됨을 검증하였다. 기존 연구 결과들은 초음파 조사 시에만 국소적으로 병변 부위에서의 약물 농도를 증가시킴으로써 항암제 사용에 따른 부작용을 줄이며 효율적으로 항암제를 전달할 수 있음을 보였다. 이번 실험에서는 이와 유사한 결과로서 MB-NP 사용에 따라 초음파 조사 1시간 후 암조직에 전달되는 항암제가 약 1.
055^oC 이었다. 동물실험에 사용된 저강도 초음파 에너지에서 열적 작용이 미비하게 발생됨을 확인하였다.
본 연구를 통해 기존 제안된 MB을 이용한 약물 전달 기법과 MB-NP 기반의 약물 전달 기법에서 모두 단 기간 내 암조직에 항암제 전달 효과를 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 허나 초음파 기반 약물전달 효과 향상 기법에서 효과를 극대화 할 수 있는 최적 초음파 변수에 대한 검증을 수행하지 못했으며, 적은 수의(n=4) 샘플을 사용함에 따른 마우스 각 개체 간 정량화 한계로 인해 두 실험 기법에 대한 통계학적 분석에서의 차이가 발생하였다.
98배 증가되었음을 확인하였다. 실험 결과에 대한 독립표본 비모수 검정 기반의 통계학적 분석 결과 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않았다(p-value = 0.072).
초음파 조사에 따른 직접적인 약물 전달 효과 외에 열적 효과 발생 유무 및 조직학적 변화를 검토하기 위해 팬텀 및 실제 조직 샘플에 대한 H&E 분석을 수행하였다. 온도 측정 결과, 초음파 조사에 따른 초점영역에서의 온도 변화량은 0.1^oC 이하였으며 이는 암세포에 온열치료 효과를 발생 시킬 수 있는 체온 기준 온도 변화량(5~7^oC)[25]과 비교하여 2% 수준으로 매우 적다. 따라서 약물전달을 향상을 위한 저강도 초음파 에너지 사용은 기계적 진동 현상으로 약물 전달 효율을 향상 시키는 것 외에 온열치료 효과는 미비 할 것으로 예상된다.
MB을 이용하여 약물전달 효과를 분석한 Escoffre 등[14]은 MB 사용 여부에 따라 초음파 조사 48시간 후 신경교모 세포종 U-87MG 세포 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서의 생존율을 관찰하여 초음파 조사에 따라 암세포에 작용하는 항암제 전달 효율이 2배 이상 향상됨을 밝혔다. 이는 이번 실험 결과를 기반으로 볼 때 초음파 및 MB의 상호작용에 의해 단 시간 내로 암세포 및 암조직에 항암제가 보다 많이 전달되어 발생한 결과로 판단되며, 실제 초음파 조사에 따른 Doxorubicin 농도가 약 1.98배로서 기존 실험결과와 유사하게 향상되는 효과가 발생되었음을 확인하였다.
기존 연구 결과들은 초음파 조사 시에만 국소적으로 병변 부위에서의 약물 농도를 증가시킴으로써 항암제 사용에 따른 부작용을 줄이며 효율적으로 항암제를 전달할 수 있음을 보였다. 이번 실험에서는 이와 유사한 결과로서 MB-NP 사용에 따라 초음파 조사 1시간 후 암조직에 전달되는 항암제가 약 1.97배 향상되었으며, 통계학적으로 유의미한 차이가 발생하였다.
초음파를 조사하지 않은 대조군에서는 1241.09 ± 472.20 ng/g, 초음파를 조사한 실험군에서는 2461.55 ± 1014.10 ng/g 의 Doxorubicin 농도가 측정되어 초음파 조사에 따른 Doxorubicin 농도가 평균적으로 약 1.98배 증가되었음을 확인하였다.
11 ng/g 의 Doxorubicin 농도가 측정되었다. 초음파를 조사함에 따라 암조직에서의 항암제 농도가 약 1.97배 증가되었으며, 통계학적 분석 결과 통계적으로 유의미한 차이가 발생하였다(p-value = 0.017).
그림 6(a)는 초음파를 조사하지 않은 유방암 조직, 그림 6(b)는 초음파를 조사한 유방암 조직에서의 H&E 조직학적 분석 결과를 나타내고 있다(n=2). 출혈이 발생하지 않은 초기 고형암 형태의 유방암 조직 분석 결과 초음파를 조사하였음에도 출혈이 발생하지 않았으며, 초음파 조사 유무에 따른 두 유방암 조직 간 경향성 차이가 보이지 않았다.

후속연구

또한, 이번 연구에서 사용된 두 가지 약물전달 기법의 경우 각각 다른 약물 농도를 선택하여 실험을 수행 하였으므로 두 기법의 효율성을 직접 비교하기는 어려울 수 있다. 다만, 각 기법은 서로 고유한 장 단점을 지니고 있으며 추후 각 기법에 적합한 최적 초음파 변수에 대한 연구가 수행된다면 향후 치료 효과를 극대화하며 부작용을 최소화 할 수 있는 초음파 기반의 약물전달시스템 구축에 활용될 수 있으리라 기대된다.
허나 초음파 기반 약물전달 효과 향상 기법에서 효과를 극대화 할 수 있는 최적 초음파 변수에 대한 검증을 수행하지 못했으며, 적은 수의(n=4) 샘플을 사용함에 따른 마우스 각 개체 간 정량화 한계로 인해 두 실험 기법에 대한 통계학적 분석에서의 차이가 발생하였다. 또한, 이번 연구에서 사용된 두 가지 약물전달 기법의 경우 각각 다른 약물 농도를 선택하여 실험을 수행 하였으므로 두 기법의 효율성을 직접 비교하기는 어려울 수 있다. 다만, 각 기법은 서로 고유한 장 단점을 지니고 있으며 추후 각 기법에 적합한 최적 초음파 변수에 대한 연구가 수행된다면 향후 치료 효과를 극대화하며 부작용을 최소화 할 수 있는 초음파 기반의 약물전달시스템 구축에 활용될 수 있으리라 기대된다.
본 실험에서는 초음파 조사 후 짧은 시간 내에서의 변화에 초점을 맞춰 분석하였기 때문에, 초음파 조사 후 세포의 형태나 분포의 변화 및 면역세포의 반응에 대한 분석은 이루어 지지 않았다. 장기간 초음파 노출에 따른 정상세포의 생존율 등에 대한 분석은 추가적인 실험이 필요할 것으로 판단된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	치료용 초음파가 각광받는 이유는 무엇인가?	치료용 초음파는 1950년대부터 의료 영역에서 활용되기 시작했으며[1], 최근에는 외과적 수술 없이 비침습적으로 다양한 암 질환을 치료할 수 있는 방법으로서 각광받고 있다[2,3]. 1000 W/cm2 이상의 고강도 초음파 에너지를 집속 시켜 발생되는 열적 작용을 이용하여 환자의 병변 부위만을 치료하는 고강도 집속 초음파 (High Intensity Focused Ultrasound; HIFU) 장비를 자궁근종, 유방암, 전립선암 등 다양한 암질환 치료에 사용하고 있다[4-6].
	팬텀 및 실제 조직 샘플에 대한 H&E 분석을 수행 후 온도 측정 결과는 어떠한가?	초음파 조사에 따른 직접적인 약물 전달 효과 외에 열적 효과 발생 유무 및 조직학적 변화를 검토하기 위해 팬텀 및 실제 조직 샘플에 대한 H&E 분석을 수행하였다. 온도 측정 결과, 초음파 조사에 따른 초점영역에서의 온도 변화량은 0.1℃ 이하였으며 이는 암세포에 온열치료 효과를 발생 시킬 수 있는 체온 기준 온도 변화량(5~7o C)[25]과 비교하 여 2% 수준으로 매우 적다. 따라서 약물전달을 향상을 위한 저강도 초음파 에너지 사용은 기계적 진동 현상으로 약물 전달 효율을 향상 시키는 것 외에 온열치료 효과는 미비할 것으로 예상된다.
	고강도 집속 초음파 (High Intensity Focused Ultrasound; HIFU) 장비란 무엇인가?	치료용 초음파는 1950년대부터 의료 영역에서 활용되기 시작했으며[1], 최근에는 외과적 수술 없이 비침습적으로 다양한 암 질환을 치료할 수 있는 방법으로서 각광받고 있다[2,3]. 1000 W/cm2 이상의 고강도 초음파 에너지를 집속 시켜 발생되는 열적 작용을 이용하여 환자의 병변 부위만을 치료하는 고강도 집속 초음파 (High Intensity Focused Ultrasound; HIFU) 장비를 자궁근종, 유방암, 전립선암 등 다양한 암질환 치료에 사용하고 있다[4-6]. 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging; MRI) 또는 초음파 영상 진단장치를 이용해 종양의 해부학적 위치를 확인 후, 해당 위치에 HIFU를 조사하여 초점 영역의 온도를 65℃ 이상으로 급격히 상승시킴으로써 주위 조직에 손상을 주지 않고 종양 만을 선택적으로 괴사 시킬 수 있는 영상유도 집속초음파 기술이 사용되고 있다[7,8].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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